受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统

1.本公开涉及光学超分辨显微成像技术领域，具体涉及一种受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统。


背景技术：

2.当今生命科学中显微成像方面的研究大约80％需要使用光学显微镜，可以说生命科学的进步伴随着光学显微镜的发展。然而由于光学衍射极限的存在，使得光学显微镜的空间分辨率被限制在半个波长左右，这样的分辨率严重阻碍了生物学家们对亚细胞结构的精细研究。受激辐射损耗显微镜(stimulated emission depletion，sted)使用一束损耗光通过位相板的调制，形成损耗光斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子通过受激辐射耗尽转换为非辐射态，实现了好于50nm的空间分辨率。由于使用全光设置，图像采集时间与传统共聚焦显微镜相同，对样品准备没有特殊要求，因此可以实现活细胞内亚细胞结构的实时成像和动态跟踪。
3.超分辨sted显微镜发明以来，已经被广泛应用于生物学和生命医学科学研究中。但在实际应用中sted显微镜会存在一些问题，诸如：光路复杂，难以实现小型化；难以维持激发光斑与sted光斑的高精度长时间稳定对准(纳米级)；显微物镜对激发光和sted光有很大(60％以上)的能量损耗，因此sted超分辨显微镜需要选用较高功率的激光器；显微物镜对荧光信号产生较大的能量损失，降低荧光信号的探测灵敏度。


技术实现要素：

4.本公开的目的是提供一种受激辐射损耗显微镜及其显微成像系统，能够避免物镜对荧光信号产生的能量损失，提高荧光信号的探测灵敏度。
5.本公开第一方面实施例提供一种用于显微镜的显微成像系统，包括：
6.位移台，用于承载样品；
7.位相板，用于对垂直入射的第一光束和第二光束同时进行相位调制和汇聚，使得所述第一光束和所述第二光束经过所述位相板后，分别在所述显微镜的焦面处形成第一光斑和第二光斑，所述第一光斑和所述第二光斑的中心严格重合；
8.其中，所述第一光束和所述第二光束的重叠区域可覆盖所述位相板。
9.可选地，所述第一光束为激发光，所述第一光斑为实心光斑；所述第二光束为相对于所述第一光束的损耗光，所述第二光斑为空心光斑。
10.可选地，所述位相板为毫米级尺寸。
11.本公开第二方面实施例提供一种受激辐射损耗显微镜，包括：
12.照明系统和荧光探测系统，以及上述第一方面所述的显微成像系统；
13.所述照明系统发出第一光束和第二光束，所述第一光束和所述第二光束分别经过所述位相板后聚焦照射到样品表面，激发样品中的荧光物质发射荧光，被激发的荧光经过所述位相板汇聚后进入所述荧光探测系统进行检测。
14.可选地，所述照明系统包括：第一激光器、第二激光器、第一透镜、第二透镜、第一滤光片、第二滤光片、第一二向色性元件、第二二向色性元件和1/4波片；
15.所述第一激光器发出所述第一光束，所述第二激光器发出所述第二光束；
16.所述第一光束依次经过所述第一透镜和所述第一滤光片后进入所述第一二向色性元件；所述第二光束依次经过所述第二透镜和所述第二滤光片后进入所述第一二向色性元件；
17.所述第一二向色性元件能使所述第一光束发生反射和所述第二光束发生透射，以使所述第一光束和所述第二光束共轴进入所述第二二向色性元件，经过第二二向色性元件反射后，入射到所述1/4波片，之后垂直入射所述位相板，以激发样品中的荧光物质发射荧光。
18.可选地，所述1/4波片能够将入射的所述第一光束和所述第二光束由线偏振光转换为圆偏振光。
19.可选地，所述第一滤光片和所述第二滤光片均为中性密度滤光片，用于对经过光束的激光强度进行调节。
20.可选地，所述荧光探测系统沿光束传播方向包括第三滤光片、第三透镜及荧光探测元件；
21.荧光光束从样品发出后经过所述位相板汇聚并入射到所述第二二向色性元件发生透射，透射后依次入射所述第三滤光片和所述第三透镜，经过所述第三透镜汇聚收集至所述荧光探测元件。
22.可选地，所述第一二向色性元件和所述第二二向色性元件均为二向色性片。
23.可选地，所述第三滤光片为荧光滤光片，能够使所述荧光光束通过且滤除其中的所述第一光束和所述第二光束。
24.本公开与现有技术相比的优点在于：
25.(1)本公开提供的位相板，具有小型化可聚焦多波长的特点，用于调制sted显微镜的照明系统发出的激发光和损耗光。激发光和损耗光在二向色性元件处耦合后，垂直入射该位相板，产生严格同心的位相调制光束。
26.(2)本公开提供的位相板，以纯相位调制型相位板代替物镜，使激发光和损耗光在通过位相板时的能量损耗大幅降低，提高了激光的能量利用率，降低了对激光器功率的要求，进而降低了配件成本。
27.(3)本公开提供的位相板，以纯相位调制型位相板代替物镜，减小了对荧光信号的能量损失，提高了荧光信号的探测灵敏度，从而提高了图像的信噪比，提高了图像质量。
28.(4)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，使得激发光束和损耗光束可以在基本共轴的情况下进行相位调制和汇聚。并且经该相位板调制、汇聚后的激发光斑和损耗光斑可以长时间、稳定和严格中心重合。
29.(5)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，代替了物镜和传统位相板，使得sted显微镜的显微成像系统尺寸缩微到几厘米，可以应用于更多场景。
附图说明
30.通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通
技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本公开的限制。而且在整个附图中，用相同的参考符号表示相同的部件。在附图中：
31.图1示出了本公开所提供的一种受激辐射损耗显微镜的结构示意图；
32.图2示出了本公开提供的位相板的高度图；
33.图3示出了采用传统的共聚焦显微镜照射直径为40nm的荧光微球样品得到的共聚焦成像图；
34.图4示出了采用本公开的sted显微镜对直径为40nm的荧光微球样品在图3的同一区域进行受激辐射耗尽显微成像得到的成像图；
35.附图标记：
36.01-照明系统；02-显微成像系统；03-荧光探测系统；a-第一激光器；
37.b-第一激光器；1-第一透镜；2-第二透镜；3-第一滤光片；4-第二滤光片；
38.5-第一二向色性元件；6-第二二向色性元件；7-1/4波片；8-第三滤光片；
39.9-第三透镜；101-第一光束；102-第二光束；103-荧光光束；111-位相板；112-位移台。
具体实施方式
40.以下，将参照附图来描述本公开的实施例。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本公开的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。
41.在附图中示出了根据本公开实施例的各种结构示意图。这些图并非是按比例绘制的，其中为了清楚表达的目的，放大了某些细节，并且可能省略了某些细节。图中所示出的各种区域、层的形状以及它们之间的相对大小、位置关系仅是示例性的，实际中可能由于制造公差或技术限制而有所偏差，并且本领域技术人员根据实际所需可以另外设计具有不同形状、大小、相对位置的区域/层。
42.在本公开的上下文中，当将一层/元件称作位于另一层/元件“上”时，该层/元件可以直接位于该另一层/元件上，或者它们之间可以存在居中层/元件。另外，如果在一种朝向中一层/元件位于另一层/元件“上”，那么当调转朝向时，该层/元件可以位于该另一层/元件“下”。
43.为了解决现有技术中存在的问题，本公开实施例提供一种显微成像系统及一种显微成像系统的制备方法，下面结合附图进行说明。
44.图1示出了本公开所提供的一种受激辐射损耗显微镜的结构示意图，如图1所示的sted显微镜，包括照明系统01、显微成像系统02和荧光探测系统03。照明系统01发出的光束经光学元件调制，经过显微成像系统02中位相板111相位调制及汇聚，照射到显微成像系统02位移台上的样品表面，能够激发样品中的荧光物质发射荧光，样品的荧光又经所述位相板111调制汇聚成平行光，最终收集至荧光探测系统03。
45.具体地，显微成像系统02，包括：
46.位移台112，用于承载样品；
47.位相板111，用于对垂直入射的第一光束和第二光束同时进行相位调制和汇聚，使得所述第一光束和所述第二光束经过所述位相板后，分别在所述显微镜的焦面处形成第一
光斑和第二光斑，所述第一光斑和所述第二光斑的中心严格重合；其中，所述第一光束和所述第二光束的重叠区域可覆盖所述位相板。
48.具体地，所述第一光束为激发光，所述第一光斑为实心光斑；所述第二光束为相对于所述第一光束的损耗光，所述第二光斑为空心光斑。
49.本公开提供的上述位相板111为小型化可聚焦多波长位相板，该位相板111可以由深度学习计算得出，并采用微纳加工技术加工而成。具体地，所述位相板111为毫米级尺寸，使得激发光和损耗光可以在毫米级共轴的情况下进行相位调制和汇聚。
50.图2示出了本公开提供的位相板111的高度图。该位相板对共同入射的激发光和损耗光同时进行相位调制，汇聚成稳定共轴的、中心严格重合的实心激发光斑和空心损耗光斑，以用于后续荧光激发。荧光在经过该位相板收集后进入探测系统03。
51.具体地，如图1所示，照明系统01发出第一光束101和第二光束102，所述第一光束101和所述第二光束102分别经过所述位相板111后聚焦照射到样品表面，激发样品中的荧光物质发射荧光，被激发的荧光经过所述位相板111汇聚后进入所述荧光探测系统03进行检测。
52.具体地，如图1所示，照明系统01包括：第一激光器a、第二激光器b、第一透镜1、第二透镜2、第一滤光片3、第二滤光片4、第一二向色性元件5、第二二向色性元件6以及1/4波片7。
53.具体地，第一激光器a发出第一光束101，第二激光器b发出第二光束102，所述第一光束101依次经过所述第一透镜1和所述第一滤光片3后进入所述第一二向色性元件5；所述第二光束102依次经过所述第二透镜2和所述第二滤光片4后进入所述第一二向色性元件5。
54.所述第一二向色性元件5能使所述第一光束101发生反射和所述第二光束102发生透射，以使所述第一光束101和所述第二光束102共轴进入所述第二二向色性元件5，经过第二二向色性元件6反射后，入射到所述1/4波片7，之后垂直入射所述位相板111，以激发样品中的荧光物质发射荧光。
55.具体地，所述1/4波片7能够将入射的所述第一光束101和所述第二光束102由线偏振光转换为圆偏振光。所述第一滤光片3和所述第二滤光片4均为中性密度滤光片，可以对经过光束的激光强度进行调节。
56.可见，从照明系统01出射的第一光束101和第二光束102可以共轴经过显微成像系统02的位相板111。位相板111同时对第一光束101及第二光束102起相位调制和汇聚作用，在显微镜的焦面处形成第一光斑和第二光斑，第一光斑和第二光斑的中心严格重合。
57.第一光束101为激发光，第一光斑为实心激发光斑，用于激发样品中的荧光，对样品进行荧光成像；第二光束102是损耗光，第二光斑为空心损耗光斑，用于抑制荧光，使第一光斑的外围区域上处于荧光发射态的荧光物质发生受激辐射，使该外围区域不再自发辐射荧光。
58.探测系统03沿光束传播方向包括：第三滤光片8、第三透镜9及荧光探测元件10。荧光光束103从样品发出后经过位相板111，汇聚并入射到第二二向色性元件6，透射后依次入射第三滤光片8和第三透镜9，经过第三透镜9汇聚收集至荧光探测元件10。
59.具体地，所述第三滤光片8为荧光滤光片，能够使样品的荧光光束通过且滤除其中的第一光束101和第二光束102。
60.具体地，所述第一二向色性元件5和所述第二二向色性元件6均为二向色性片。
61.值得一提的是，图1中还用到了若干全反射镜0，用于改变光束的传播方向。
62.为了便于理解，下面结合附图1对本公开提供的sted显微镜的工作原理介绍如下：
63.在照明系统01的照明光路中，第一激光器a为第一光束101的光源，第一光束101为激发光，第一光斑为实心光斑。第二激光器b为第二光束102的光源，第二光束102为相对于第一光束101的损耗光，第二光斑为空心光斑。
64.第一激光器a和第二激光器b所发出的第一光束101和第二光束102分别经过第一透镜1和第二透镜2后，扩束成为平行光。第一滤光片3、第二滤光片4为中性密度滤光片，用于分别对第一光束101及第二光束102的激光强度进行调节。
65.第一二向色性元件5为二向色性片，第一二向色性元件5能使所述第一光束101发生反射和第二光束102发生透射，从而实现第一光束101和第二光束102共轴。第二二向色性元件6为二向色性片，可以反射第一光束101、第二光束102以及透射样品的荧光光束103。第一光束101和第二光束102经过第二二向色性元件6后，入射到1/4波片7，第一光束101和第二光束102由线偏振光转换为圆偏振光。
66.在显微成像系统02中，位相板111为小型化可聚焦多波长相位调制位相板，位相板111对第一光束101和第二光束102同时进行相位调制和汇聚，从而得到中心严格重合的第一光斑和第二光斑。使得样品中荧光物质发射荧光，荧光光束再经过所述位相板111汇聚后，入射到第二二向色性元件6发生透射，进入荧光探测系统03。然后入射到第三滤光片8，对第一光束101第二光束102进行进一步地滤除，使荧光光束更加纯净，最终入射到第三透镜9进行汇聚，并进入荧光收集元件10。
67.值得一提的是，入射到位相板111的第一光束101与第二光束102需保持基本共轴，且垂直入射位相板111。
68.图3示出了采用传统的共聚焦显微镜对直径为40nm的荧光微球样品进行共聚焦成像试验获得的成像图，图4示出了采用上述的sted显微镜对直径为40nm的荧光微球样品在图3的同一区域进行受激辐射耗尽(sted)显微成像试验获得的成像图。从图中可以看出传统的共聚焦成像不能分辨图3中虚线框内的纳米微球，而本公开的sted超分辨成像可清晰地辨认出图3中虚线框内的3个荧光微球(如图4中虚线框内所示)，经测量荧光微球显微成像的半高全宽小于50nm。由上述对比可知，采用本公开提供的sted显微镜能够大大提高成像的分辨率，获得超分辨成像的效果。
69.本公开与现有技术相比的优点在于：
70.(1)本公开提供的位相板，具有小型化可聚焦多波长的特点，用于调制sted显微镜的照明系统发出的激发光和损耗光。激发光和损耗光在二向色性元件处耦合后，垂直入射该位相板，产生严格同心的位相调制光束(激发光经过位相板调制及汇聚后获得实心圆斑，损耗光经过位相板调制及汇聚后形成空心光斑)。优化了照明系统的光路，减少了光学元件。避免了单元器件相互几何关系的物理调节以及机械调节机构所固有的温度和振动不稳定性，避免了激发光斑和损耗光斑偏移等现象。使sted显微镜能够在各种环境下长期可靠工作。
71.(2)本公开提供的位相板，以纯相位调制型位相板代替物镜，使激发光和损耗光在通过位相板时的能量损耗大幅降低，提高了激光的能量利用率，降低了对激光器功率的要
求，进而降低了配件成本。
72.(3)本公开提供的位相板，以纯相位调制型位相板代替物镜，减小了对荧光信号的能量损失，提高了荧光信号的探测灵敏度，从而提高了图像的信噪比，提高了图像质量。
73.(4)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，使得激发光束和损耗光束可以在基本共轴的情况下(两光束重叠区域可覆盖位相板)进行相位调制和汇聚。并且经该相位板调制、汇聚后的激发光斑和损耗光斑长时间、稳定和严格中心重合。
74.(5)本公开提供的位相板，为毫米级尺寸，代替了物镜和传统位相板，使得sted显微镜的显微成像系统尺寸缩微到几厘米，可以应用于更多场景。
75.为了形成同一结构，本领域技术人员还可以设计出与以上描述的方法并不完全相同的方法。另外，尽管在以上分别描述了各实施例，但是这并不意味着各个实施例中的措施不能有利地结合使用。
76.以上对本公开的实施例进行了描述。但是，这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并非为了限制本公开的范围。本公开的范围由所附权利要求及其等价物限定。不脱离本公开的范围，本领域技术人员可以做出多种替代和修改，这些替代和修改都应落在本公开的范围之内。