胆甾类人工受体特异性识别银离子的应用

1.本发明涉及检测领域，具体涉及金属离子的检测。


背景技术：

2.众所周知，金属离子在我们日常生活中的应用随处可见，尤其在食品、环境、医疗等领域更是发挥着不可替代的作用。然而由于人们对经济社会高速发展所带来的负面影响预防不足，致使大量未经处理的有毒有害离子被无节制的排放到了环境中，进而通过食物链进入人体，危害人体健康。过渡金属银，是自然界存在的重要微量元素之一，现如今因其具有的光学特性，被广泛应用在拍照摄影、半导体材料方面。科学研究表明，一定浓度的银离子表现出了很好的杀菌效果，不仅可以用作消毒剂的生产，而且已成功应用于一些疾病的防治以及抗菌药品的研发。尽管ag
+
表现出了有益的作用，然而一旦在体内不断积累超过安全浓度时，便会与各种代谢物中的巯基相互作用从而使含硫酶失活，进而对人体健康造成严重的不利影响，比如抑制细胞的增殖与分化，引发皮肤组织损伤，肝脏、肾脏衰竭以及线粒体功能障碍等。因此，开发一种银离子高灵敏度响应的识别受体和可靠的检测方法对人类健康与食品安全具有重要的意义。目前对于银离子的检测往往局限于传统的分析方法，如原子吸收光谱法(aas)、原子发射光谱法(aes)、电感耦合等离子体质谱(icp-ms)以及离子选择性电极法(ise)等，但这些方法均依赖大型精密仪器与专业技术人员，且操作繁琐，严重阻碍了常规和现场检测的能力。如今，光化学技术正逐步发展成为具有广阔应用前景的检测方法，它不仅具备检测技术要求的高选择性、高灵敏度，而且所需的仪器设备低廉，实验操作环保高效，符合绿色化学检测的理念。
3.近年来，基于光化学响应信号形成的阳离子特异性识别受体的种类逐年被大量报道。贾慧劼等开展了一种苯并噻唑类探针对cu
2+
识别的荧光探针，能在乙腈水溶液中高选择性地检测到cu
2+
离子。wang等利用芘分子和吡啶分子合成了二芘衍生物，通过荧光试验发现，该化合物对ag
+
表现出了良好的选择性。chen等以香豆素为基，合成了对pd
2+
高选择性和灵敏性的荧光探针。


技术实现要素：

4.本发明拟定提供一种对于食品、药品、保健品等产品中银离子的检测方法。
5.本发明研究发现，使用同时含有-cooch3和-aroch3两个官能团的分子钳，可以与银离子结合，对银离子有选择识别能力，可以将银离子与其他金属离子更好的区别，且结合后，可以通过肉眼观察颜色即可分辨银离子是否存在，同时，还可以通过荧光、紫外等光谱法进行定性或定量检测。
6.本发明中所述分子钳包括但不限于：
[0007][0008]
经过研究发现，分子钳7a中与苯环相连的甲氧基氧原子与ag
+
的最短距离为12α-cooch3中的羰基氧原子与ag
+
的最短距离为由此认为，12α-cooch3和aroch3基团上的氧原子与ag
+
发生作用形成配合物。
[0009]
本发明中需要将待检样品进行消解，消解又叫湿法消化，是用酸液或碱液并在加热条件下破坏样品中的有机物或还原性物质的方法。
[0010]
本发明中可以采用酸液进行消解，例如使用硫酸及其盐。
[0011]
本发明所述肉眼检测，即裸眼可视，无需使用其他仪器设备，即可分辨颜色。
附图说明
[0012]
图1.(a)主体化合物7a中加入不同金属离子的颜色变化；(b)主体化合物7a中加入不同金属离子的紫外-可见吸收光谱图
[0013]
图2.主体化合物7a在加入不同金属离子后的荧光光谱
[0014]
图3.其他金属离子对主体7a识别ag
+
的荧光强度变化的影响
[0015]
图4.主体化合物7a在不同ph值下对ag
+
的荧光响应
[0016]
图5.主体化合物7a与ag
+
形成配合物的1/[g0]对1/δa作图
[0017]
图6.主体化合物7a(1.0
×
10-4
mol/l)在不同浓度ag
+
(0-20μmol/l)存在下的紫外可见光谱图
[0018]
图7.主体化合物7a与ag
+
配位的job曲线图
[0019]
图8.(a)主体化合物7a在无ag
+
条件下的fesem图像(
×
300，5kw).(b)主体化合物7a在ag
+
存在下的fesem图像(
×
10000，5kw).(c)主体化合物7a在ag
+
存在下的fesem图像(
×
20000，25kw).(d)主体化合物7a在ag
+
存在下的能谱图像(
×
20000，25kw)
[0020]
图9.络合物7a+ag
+
的质谱
[0021]
图10.主体化合物7a及络合物7a+ag
+
的红外光谱图
[0022]
图11.主体化合物7a在dmso-d6中加入不同比例ag
+
的1h nmr谱图：(a)+1当量；(b)+0当量，(
◆
，nch；12α-cooch3；
·
，aroch3；)
[0023]
图12.主体分子钳7a与配合物7a+ag
+
的最低能量构象图
[0024]
图13.主体分子钳7a与ag
+
可能的络合模型
[0025]
图14.ag
+
定量检测标准曲线
具体实施方式
[0026]
实施例1
[0027]
1试验部分
[0028]
1.1试剂与仪器
[0029]
去氧胆酸、邻甲氧基苯甲酸、三光气(≥99％)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙醇、浓盐酸、二氯甲烷、乙酸乙酯购于天津市富宇精细化工有限公司；丙酮购于广州市江顺化工科技有限公司；无水硫酸钠购于天津市大茂化学试剂厂；吡啶(≥99％)购于上海建信化工有限公司试剂厂；水合肼购于广东光华科技有限公司；氘代dmso购于默克化学试剂有限公司；三羟甲基氨基甲烷(tris)购于广州赛国生物科技有限公司；金属离子溶液由其硝酸盐或乙酸盐配制；奶粉购自双城雀巢有限公司；枸杞、藜麦购自格尔木纳木兰商贸有限公司；小麦面粉购自河北金沙河商贸公司；所用试剂均为分析纯，试验用水均为蒸馏水。
[0030]
用uv-2600型紫外-可见分光光度计测量紫外吸收光谱(日本岛津仪器设备有限公司)；用rf-6000型荧光光度计测量荧光发射光谱(日本岛津仪器设备有限公司)；用thermo q exactive超高分辨液质联用仪进行质谱分析(美国赛默飞世尔科技有限公司)；用mcr-3微波化学反应器进行化学反应(郑州泰远仪器设备有限公司)；用avance neo型核磁共振波谱仪记录核磁共振光谱(德国布鲁克公司)；用jsm-7900f场发射扫描电子显微镜观察显微图像(日本电子株式会社)；用nicolet 6700傅里叶红外光谱仪记录红外光谱(美国赛默飞世尔科技有限公司)。
[0031]
1.2胆甾类分子钳7a的合成
[0032]
主体分子钳7a的合成路线如方案1所示，根据先前文献报道的方法合成了中间体3和中间体5，将中间体5(0.5mmol/l)、无水二氯甲烷(10ml)、无水吡啶(0.5ml)和三光气(0.18mmol/l)置于50ml圆底烧瓶中，在300w微波辐射下加热回流反应10min，待反应完全后再加入缬氨酸甲酯盐酸盐(1mmol/l)、无水吡啶(0.5ml)，相同条件下继续反应10min，待反应完全后减压蒸去溶剂，残余物经柱层析分离纯化得白色固体(c
41h61
n3o
10
)，目标物的质谱、氢谱、碳谱等数据与文献报道的一致(ye y,suo y r,yang f,et al.microwave-assisted synthesis ofnovel chiral receptors derived from deoxycholic acid and their molecular recognitionproperties[j].chem lett,2014,43:1812-1814).
[0033]
[0034]
1.3溶液的配制和光谱分析
[0035]
参照：石治川,赵志刚.不对称双缩二氨基硫脲荧光探针的合成及其对金属离子的识别性能研究[j].现代化工,2019,39(09):227-231.
[0036]
选取0.1mol/l的三羟甲基氨基甲烷与盐酸，以二者体积比25:21定量混合，配成tris-hcl(ph 7.4)缓冲液。准确称取适量的分子钳人工受体7a于25ml容量瓶，用5mldmso将其溶解完全后加入ethanol/tris(v/v＝1/1，ph 7.0)溶液定容至标线得到0.1mmol/l的分子钳储备液。再分别称取金属离子的硝酸盐或乙酸盐(ag
+
、al
3+
、ca
2+
、mg
2+
、na
+
、k
+
、pb
2+
、mn
2+
、zn
2+
、fe
3+
)溶于去离子水中，配制浓度均为0.1mmol/l的金属离子盐溶液。
[0037]
在室温下，将配好的分子钳溶液分别加入一定量的不同金属离子，然后测定混合物的紫外-可见吸收光谱以及荧光光谱(选择性试验、干扰性试验、紫外滴定试验、job试验)，于200～600nm范围内检测荧光光谱，于200～400nm范围内检测紫外吸收光谱的变化。
[0038]
1.4主体化合物对金属离子的选择性识别
[0039]
主体分子钳7a对不同金属阳离子的紫外可见吸收光谱识别试验。取0.5ml浓度1
×
10-4
mol/l的主体分子钳7a，分别加入5倍物质量的各种金属离子(ag
+
、al
3+
、ca
2+
、mg
2+
、na
+
、k
+
、pb
2+
、mn
2+
、zn
2+
、fe
3+
)，观察溶液颜色、荧光发射光谱及紫外可见吸收光谱变化。
[0040]
1.5共存离子对特异性识别ag
+
的干扰能力及ph值的影响研究
[0041]
为了检测主体化合物7a在其它金属离子存在时是否干扰对ag
+
的选择性识别，进行了识别的抗干扰性研究，并配制不同ph的混合体系，观察ph值对配合物荧光强度的影响。在主体分子钳7a浓度为1
×
10-4
mol/l的溶液中依次加入5倍物质量的ag
+
和其他单一金属离子，观察荧光发射光谱变化。
[0042]
1.6主体分子钳7a识别ag
+
的紫外滴定及job试验
[0043]
在浓度为1.0
×
10-4
mol/l的主体分子钳7a溶液中逐渐滴加ag
+
(0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20μmol/l)，测定不同ag
+
浓度下各组配合物溶液的紫外-可见吸收光度值，以配合物在257nm处的吸光度值计算主体分子钳7a与ag
+
的络合常数。
[0044]
为了进一步确定主体分子钳7a对ag
+
的配合比，采用等摩尔比连续变化法(job试验法)是行之有效的测定方法
[30]
。始终保持主体与客体ag
+
的总浓度为1
×
10-4
mol/l，依次配制主体分子钳7a与ag
+
摩尔比为1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2和9:1的一系列混合溶液，测定其吸光度值，根据主体化合物的摩尔配比对吸光度作图，得配合物的job点图，确定配合物的组成比。
[0045]
1.7配合物的微观结构观察及能谱成像研究
[0046]
为了能够更加直观的观察到化合物7a与ag
+
的相互作用情况，对主体分子钳7a及其与ag
+
的配合物采用场发射扫描电子显微镜(fesem)进行微观结构观察及能谱成像分析。
[0047]
1.8主体分子钳7a识别ag
+
的作用机理研究
[0048]
采用傅里叶红外光谱、核磁滴定及计算机分子模拟等手段研究主体分子钳7a对ag
+
的识别作用机制。傅里叶红外光谱观察主体分子钳7a加入ag
+
后官能团的变化，初步推断两者可能的结合位点；根据配合物的组成比定量加入分子钳7a与ag
+
，观察主体分子钳7a加入ag
+
后1h谱的变化，进一步通过不同官能团上氢质子化学位移的变化判断分子钳7a与ag
+
的结合部位及可能的识别作用推动力；计算机分子模拟进一步确证分子钳7a与ag
+
可能的作用机制。
[0049]
1.9主体荧光探针7a对ag
+
检出限的确定
[0050]
在主体分子钳浓度为1.0
×
10-4
mol/l的溶液中逐渐滴加ag
+
，当ag
+
浓度在2
×
10-6
～2
×
10-5
mol/l范围内时，以配合物形成过程中ag
+
浓度对紫外可见吸光度值作图，得标准曲线方程，再根据公式lod＝3σ/k，计算荧光探针7a对ag
+
的检出限。其中σ为标准偏差，k为线性拟合的斜率。
[0051]
1.10食品样品中ag
+
的定量检测
[0052]
取奶粉、藜麦、小麦面粉、枸杞样品各2g，干燥，粉碎，移入干燥的消解管中，分别加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾及10ml硫酸，400℃高温消解1h，冷却至室温，稀释到一定倍数后调节ph为7.0(参照：夏俊影.基于苯并噻唑衍生物荧光探针的合成及性能研究[d].渤海大学,2020.)。取主体分子钳7a(1
×
10-4
mol/l)0.5ml于试管中，加入2.5ml稀释后的样品混合，测得样品在257nm处的吸光度值，每组测定3次取平均值，根据1.9所得标准曲线方程计算各样品中ag
+
的含量。
[0053]
2结果与讨论
[0054]
2.1主体化合物对金属离子的选择性识别
[0055]
如图1b所示，未加入金属离子之前，探针在235、290nm处有吸收，其中在235nm处有较强吸收峰。而当主体化合物与金属离子发生作用后，虽然都使主体化合物最大紫外吸收波长处的吸收峰强度发生了变化，但ag
+
却表现出了特异之处。该金属离子不仅在此波长下的吸收峰强度高于其他金属离子，而且在290nm处的紫外吸收峰明显红移至257nm处。这可能是由于主体化合物7a与ag
+
发生了选择性识别作用，引起吸收峰信号的改变，而其他金属离子并未发生反应。此外，值得注意的是，主体化合物7a与ag
+
作用后颜色由无色变为明显的淡红色，其他金属离子的颜色没有变化(图1a)。这可能是因为主体化合物7a与ag
+
形成了配合物，促进了溶液的颜色变化。这说明主体化合物7a能够达到肉眼特异性识别ag
+
的效果。为进一步考察主体化合物7a对金属阳离子的选择识别作用，采用荧光光谱法对上述金属阳离子进行发射性能的探究。
[0056]
如图2所示，当主体化合物7a中分别加入同等浓度的不同金属离子时，ag
+
表现出最强的荧光发射光谱强度变化，而其他金属离子虽然使主体在268nm处荧光强度略有增强，但响应值基本无差别。荧光光谱与紫外光谱变化结果均表明，主体分子钳7a与ag
+
产生了较好的特异性结合，主体化合物7a能够对ag
+
实现高选择性识别。
[0057]
2.2共存离子对特异性识别作用的干扰能力及ph值的影响研究
[0058]
如图3所示，在主体化合物7a与ag
+
共存的体系下加入其他金属离子，荧光强度与只加入ag
+
变化不大，表明主体化合物7a对ag
+
的识别具有良好的荧光响应且其他金属离子对ag
+
选择识别过程影响甚微。此外，配制了不同ph的混合溶液，观察ph值对配合物荧光强度的影响，结果如图4所示。不含ag
+
时，主体分子钳7a显示出很弱的荧光强度且比较稳定，加入ag
+
后，随着ph出现变化，荧光强度呈现不断增大趋势，当ph等于6～8时，配合物荧光响应趋于稳定且强度逐渐达到峰值，随后开始降低，这可能由于在过酸或者过碱性环境下影响主体胆甾环的空间结构，同时主体分子钳7a与ag
+
之间的识别推动作用力遭到破坏，从而使配合物溶液荧光强度表现出显著波动。基于以上影响，研究主体分子钳7a对ag
+
的识别性能时均选择ph 7.0的ethanol/tris溶液为检测体系。
[0059]
2.3主体分子钳7a识别ag
+
的紫外滴定及job试验结果
[0060]
由图5可知，随着主体分子钳7a中加入的ag
+
浓度从0μmol/l增大到20μmol/l时，溶液的紫外吸收光谱出现规律性上升趋势，可能是由于主体分子钳7a与不断加入的ag
+
发生配合导致分子内电荷转移，从而使主体化合物在257nm处的紫外吸光度值逐渐增强。在2
×
10-6
～2
×
10-5
mol/l范围内，根据hildebrand
‑‑
benes方程
[35]
，以1/[g0]对1/δa作图，通过线性拟合得到一条直线(r2＝0.997)，如图6所示，说明主体化合物7a与ag
+
间形成了1:1型配合物，然后再根据直线的截距1/a和斜率1/a
·
ka，通过计算求得配合物的结合常数ka值为1.38
×
104l/mol。job法试验结果如图7所示，由图可知，当[ag
+
]/[7a+ag
+
]为0.5时，所得到的紫外-可见吸光度值最大，因此同样说明主体分子钳7a与ag
+
是以1:1络合配位的。
[0061]
2.4配合物的微观结构观察及能谱成像分析
[0062]
主体分子钳7a与ag
+
形成配合物的电场发射扫描电镜如图8所示。由图可知，未加入金属ag
+
离子时(图8a)，主体化合物7a主要以致密的块状形式堆积，当与金属离子ag
+
发生络合后(图8b)，化合物7a的结构发生明显改变，形成规则的网状结构，且出现大量空腔和裂穴，将ag
+
包埋于其中，形成稳定的分子聚集体
[36]
。为了进一步验证图中裂穴所包埋的是金属ag
+
，通过jsm 7900f高分辨透射扫描电子显微镜在25.0kv的加速电压下拍摄样品的扫描电子显微镜图像(图8c)以及对应的能谱成像图(图8d)。如图8c所示，当主体分子钳7a与ag
+
作用后，大量银离子进入分子钳7a的裂穴内，在图像中呈现出高光亮点，经能谱成像图分析，图8d中蓝色部分为ag
+
，红色部分为主体分子钳7a中的碳骨架结构，由图可知，绝大多数金属银离子成功嵌入裂穴中，被主体化合物7a包裹形成稳定的络合物。
[0063]
2.5主体化合物7a与ag
+
络合后质谱及红外光谱分析
[0064]
主体化合物7a的分子量为755.33，加入银离子后配合物的分子量理论值[m+h]
+
为864.20，实测值为864.11(如图9)，进一步证实了主体分子钳7a与ag
+
形成了配合物。主体分子钳7a及配合物7a+ag
+
的红外光谱如图10所示，主体分子钳7a中酰胺n-h、甲氧基c-h、c＝o、甲氧基c-o-c的伸缩频率分别为3372cm-1
、2951cm-1
、1737cm-1
、1239cm-1
。当与ag
+
络合后，主体分子钳7a位于3372cm-1
的酰胺n-h振动吸收峰向高波数方向移动至3437cm-1
，位于2951cm-1
的甲氧基c-h伸缩振动峰移动至2930cm-1
，而c＝o特征吸收峰从1737cm-1
移动到1720cm-1
，甲氧基c-o-c的伸缩吸收峰从1239cm-1
移动到1059cm-1
，且2951cm-1
、1737cm-1
处峰形发生明显变化，峰形变小，峰强度变弱，因而据此推测，c＝o、-och3可能是与ag
+
发生配位作用的主要官能团，ag
+
缺电子，c＝o、-och3为其提供电子，由此导致电荷发生转移，从而引起红外光谱的变化。
[0065]
2.6核磁滴定试验结果与分析
[0066]
由2.3研究结果可知，主体化合物7a与ag
+
的配位比为1:1，为了进一步探究主体化合物7a与金属ag
+
的相互作用机理，采用核磁滴定的方法测定了主体化合物7a在氘代二甲基亚砜中加入ag
+
前后的1h nmr变化。从图11可以看出，未加入ag
+
时，主体化合物7a中-nch、12α-cooch3和aroch3基团上氢质子的化学位移分别为4.52、3.53和3.62ppm。当加入1.0equiv的ag
+
作用后，主体分子钳7a芳环上氢质子信号峰强度减弱，位于4.52ppm的峰强度明显增加，且向低场区移动(
△
δ＝0.1ppm)，此外，δ3.53ppm处的酯基信号峰明显变宽变强。推测可能是12α-cooch3和aroch3基团上的氧原子给ag
+
提供电子，从而导致相邻氢质子信号峰发生改变。
[0067]
2.7计算机分子模拟结果与分析
[0068]
采用计算机分子模型软件(chem 3d)，对主体及主客体配合物进行系统的构象搜寻和结构最佳化
[37]
。主体分子钳7a与配合物7a+ag
+
最低能量分子构象见图12，由图可知，主体分子钳7a处于最低能量构象时为钳形，为ag
+
的嵌入提供足够的空间，客体ag
+
能够较好的进入化合物7a的分子钳裂穴内并形成稳定的配合物。主体分子钳7a中与苯环相连的甲氧基氧原子与ag
+
的最短距离为12α-cooch3中的羰基氧原子与ag
+
的最短距离为由此认为，12α-cooch3和aroch3基团上的氧原子与ag
+
发生作用形成配合物，可能的识别推动力为氢键和静电引力作用，主体分子钳7a与ag
+
可能的络合模型如图13所示。
[0069]
2.8实际样品中ag
+
的定量检测
[0070]
银离子在人体生长代谢过程中起着不可忽视的作用，因此对于实际食品样品中ag
+
的检测具有重大意义。通过主体分子钳7a对ag
+
的定量检测标准曲线及检出限试验，以配合物形成过程中ag
+
浓度对紫外可见吸光度值作图(图14)，经拟合得到其在257nm处的标准曲线方程为y＝0.014x+0.359，相关系数为0.991，根据公式lod＝3σ/k，计算出主体分子钳7a对ag
+
的检出限为1.0μmol/l。
[0071]
为了验证该方法对ag
+
检测的实用性，将硝化后的食品样品稀释若干倍后，根据滴定试验ag
+
的标准曲线计算食品样品中ag
+
的含量，结果如表1所示。与aas法相比，主体分子钳7a检测的奶粉、小麦面粉、藜麦和枸杞的ag
+
含量分别为19.44、31.06、41.4、38.37μg/g。此外，基于上述结果，采用标准加入法随机挑选了其中两种食品样品对其ag
+
含量进行了检测，通过向其稀释液加入不同浓度的ag
+
标准溶液(10μg/g、40μg/g)，测定其紫外吸光度值，结果见表2。回收率为99％-104％，相对标准偏差为1.34％-4.59％。本试验的检测结果与原子吸收法的相对误差值小于5％(n＝3)，证明该方法具有较好的准确性，可用于不同食品样品中ag
+
的定量检测，在实际样品分析中具有较高的实用性和可靠性。
[0072]
表1.食品样品中ag
+
测定新方法与原子吸收法的比较(n＝3)
[0073][0074]
表2.加标食品样品中ag
+
回收率的测定(n＝3)
[0075][0076]
3结论
[0077]
本研究合成得到了手性胆甾类分子钳7a，通过紫外滴定、荧光光谱考察了其对ag
+
的识别性能，研究结果表明，该主体分子钳7a在ethanol/tris(v/v＝1/1，ph 7.0)溶液中能够特异性识别金属ag
+
，其结合常数为1.38
×
104l/mol，最低检出限为1.0μmol/l，且通过溶液颜色由无色到淡红色变化实现了对银离子的裸眼检测。采用傅里叶红外光谱、核磁滴定
及计算机分子模拟等手段研究了主体分子钳7a对ag
+
的识别作用机制，发现主体分子钳7a中的12α-cooch3和aroch3是主要结合位点，基团中的氧原子为ag
+
提供电子，识别推动作用力主要为静电引力和氢键作用。此外，通过藜麦、小麦面粉等食品样品中ag
+
的测定，建立了一种实际样品中ag
+
的检测方法，该检测方法灵敏、高效，与传统方法相比操作简便，且缩短了检测时间，所需的仪器设备造价低，因此有望据此开发出ag
+
快速检测试剂盒应用于食品、环境等领域的银离子检测。