一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法

1.本发明属于环境检测领域，具体涉及一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法。


背景技术：

2.目前关于微量或痕量有机污染物污染的水体如地表水、污水处理厂出水或再生水中雌激素内分泌干扰化合物的研究大都集中于采用化学分析手段对特定内分泌干扰化合物进行定性和定量分析。再生水中内分泌干扰物的浓度低，常规的分析方法准确性不高，并且分析仪器价格昂贵，成本非常高，难以进行推广和普及。再生水样品与一般样品不同，具有化合物种类繁多、含量低、样品组成复杂、具有流动性和不稳定性等特点。当待测污染物浓度低于现有方法的检出限或者样品复杂，机体干扰严重的情况下，直接测定是不可能的。生物法是判定化合物是否为内分泌干扰物及其内分泌干扰活性大小的非常有前景的方法，在内分泌干扰物定量分析方面质谱法的灵敏度和准确度都很高。斑马鱼由于具有繁殖周期短、产卵量高，且卵是透明的一系列特点而广泛应用于环境毒理学领域中。斑马鱼的基因与人类基因相似度达到87％，且斑马鱼具有与人类相似的生理学特征，例如斑马鱼内分泌系统与人类的相似。因此，近十几年来，斑马鱼广泛应用于测试或筛选内分泌干扰物。
3.多种环境内分泌干扰化合物的相互作用研究较少。单一环境内分泌干扰化合物往往对生物的影响很弱，但与其他环境内分泌干扰化合物联合作用后出现效应的协同，这种协同作用具有非常重要的意义。环境内分泌干扰化合物在环境中常常是以混合状态存在，而对单一环境内分泌干扰化合物的活性测定难以体现环境中内分泌干扰物的实际活性。
4.现有公告号为cn102660644b的专利文件公开了一种调控斑马鱼卵黄蛋白原 mrna水平的方法，其是对待检测水生生物肝脏的总rna进行提取，并对其中的卵黄蛋白原的vtg1和/或vtg3的mrna表达水平进行检测，可应用于水生生物类雌激素干扰物的检验领域。
5.文献《斑马鱼(danio rerio)、河川沙塘鳢(odontobutis potamophila)卵黄蛋白原mrna特性研究及其在环境监测中的应用》中，应用半定量r t一p c r法检测环境雌激素对雄性鱼体卵黄蛋白原mrna表达的诱导，实验鱼vtg表达基因可作为分子模型应用于环境雌激素检测中。
6.目前的现有技术基本都是用一种雌激素化合物如pfos或e2刺激斑马鱼或其他鱼体，并没有考虑环境中污染物不是独立存在的，而是和其他化合物联合存在的，各种化合物联合存在时具有增强或拮抗的毒性作用，即水环境中确实存在e2，但是由于其他化合物的拮抗作用，并没有引起vtg的诱导，所以并不能根据vtg 没有诱导就推断没有雌激素化合物，实际应用起来存在局限性。


技术实现要素：

7.本发明为解决上述问题，提供了一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内
分泌干扰化合物污染的方法。
8.具体是通过以下技术方案来实现的：
9.一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，包括以下步骤：
10.1、化学分析：采用gc-ms法对再生水环境雌激素内分泌干扰化合物进行污染检测，在检测前对水样进行前处理；
11.进一步，所述的前处理，分为邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理以及固醇和酚类化合物分析水样前处理。
12.进一步，所述的邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入氯化钠，水样：氯化钠＝50ml：1g，摇匀后加入乙酸乙酯，水样：乙酸乙酯＝25ml：1ml，重复萃取3-4次，合并萃取液，氮吹定容后浓缩500倍。
13.进一步，所述的固醇和酚类化合物分析水样前处理，具体方法为：在水样中加入双酚a-d16，加入量为200ng.l-1，混匀。
14.进一步，所述的gc-ms法，具体分析方法为：上样前依次用甲醇和超纯水活化hlb小柱，将水样以5ml/min的流速上样，用10-20ml甲醇洗脱小柱，氮吹定容至1ml体积，加入七氟丁酸酐30μl，于30℃下衍生30min，氮吹至干，加入1ml正己烷，浓缩500倍后进行色谱分析，色谱柱采用rtx-5ms(30
×
0.25
ꢀ×
0.25)。
15.进一步，所述的色谱分析，条件为：升温程序：起始温度50℃，保持1min；以10℃/min的速度上升到200℃，保持1min；以10℃/min速度上升到280℃，保持2min；以30℃/min速度上升到310℃，保持5min。
16.2、生物分析：采用实时定量pcr方法检测性成熟斑马鱼雄鱼卵黄蛋白原 (vtg1)的表达，并以β-actin为内参基因建立vtg1转录水平的检测体系，再通过暴露实验分析再生水雌激素内分泌干扰化合物的污染程度。
17.进一步，所述的生物分析法，具体包括以下步骤：
18.(1)样品采集与预处理
19.采集的再生水样品过夜澄清，获得澄清再生水，弃掉底部固体沉积物；
20.(2)暴露实验
21.选择3-4个月大的健康雄性斑马鱼为暴露对象，充分曝气除氯自来水水样为阴性对照用水。设置三个平行样，每个平行样包含5条随机获取的雄鱼。采集样品与对照同时暴露，暴露时间为14天，暴露期间每天喂食丰年虾2次，每天换水。成熟雄鱼暴露后，处死鱼，解剖，获取肝脏组织，迅速收入-80℃冰箱中保存；
22.(3)鱼样品处理
23.采用rna提取试剂盒提取rna，采用反转录试剂盒将rna反转录得到 cdna，采用荧光定量pcr试剂盒进行荧光定量pcr检测成年雄性斑马鱼卵黄蛋白原vtg1表达水平，进而指示环境雌激素内分泌干扰化合物的污染；荧光定量pcr反应体系为qpcr master mix 10μl、cdna模板1μl、 nuclease-free water 7μl和上下游引物各1μl；反应在cfx96tm real-time system实时定量pcr仪中进行；
24.vtg1引物序列为：f:5
’‑
ccttggagaaaattgaggctatc-3’；r:5
’‑
ctgaatgaactcgggagtggta-3’；
25.β-actin引物序列为：f:5
’‑
tctggcatcacaccttctacaat-3’；r:5
’ꢀ‑
tgttggctttgggattcagg-3’。
26.进一步，所述的pcr温度程序为预变性：95℃3min；变性：95℃30s，退火：60℃30s，延伸：72℃30s，共40个循环；熔解曲线分析：60～95℃。
27.酚类和固醇类雌激素化合物的进样量与对应的峰面积如下：4-叔辛基酚(op) 的浓度为10.000μg/l时平均峰面积为449.00，浓度为20.000μg/l时平均峰面积为1774.00，浓度为50.000μg/l时平均峰面积为6003.00，浓度为100.000μg/l 时平均峰面积为13340.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为27222.00。
28.壬基酚的浓度为40.000μg/l时平均峰面积为6829.00，浓度为80.000μg/l 时平均峰面积为13969.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为35411.00，浓度为400.000μg/l时平均峰面积为72141.00，浓度为800.000μg/l时平均峰面积为 152344.00。
29.bpa-d16的浓度为10.000μg/l时平均峰面积为3676.00，浓度为20.000μg/l 时平均峰面积为7830.00，浓度为50.000μg/l时平均峰面积为19582.00，浓度为 100.000μg/l时平均峰面积为40344.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为 80288.00。
30.双酚a的浓度为10.000μg/l时平均峰面积为3299.00，浓度为20.000μg/l 时平均峰面积为7205.00，浓度为50.000μg/l时平均峰面积为18146.00，浓度为 100.000μg/l时平均峰面积为36956.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为 74727.00。
31.17α-乙炔基雌二醇(ee2)的浓度为10.000μg/l时平均峰面积为556.00，浓度为20.000μg/l时平均峰面积为1095.00，浓度为50.000μg/l时平均峰面积为 3015.00，浓度为100.000μg/l时平均峰面积为6618.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为13572.00。
32.17β-雌二醇的浓度为10.000μg/l时平均峰面积为2160.00，浓度为20.000 μg/l时平均峰面积为5836.00，浓度为50.000μg/l时平均峰面积为15903.00，浓度为100.000μg/l时平均峰面积为32926.00，浓度为200.000μg/l时平均峰面积为66794.00。
33.酚类和固醇类雌激素化合物的标准曲线如图1所示。
34.邻苯二甲酸酯类激素化合物的进样量与对应的峰面积如下：dmp的浓度为 20.000μg/l时平均峰面积为25373.00，浓度为40.000μg/l时平均峰面积为 52592.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为102341.00，浓度为160.000μg/l 时平均峰面积为210819.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为407063.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为650512.00。
35.dep的浓度为20.000μg/l时平均峰面积为23215.00，浓度为40.000μg/l时平均峰面积为47255.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为93138.00，浓度为 160.000μg/l时平均峰面积为192085.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为 373204.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为602775.00。
36.dbp的浓度为20.000μg/l时平均峰面积为43356.00，浓度为40.000μg/l时平均峰面积为73472.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为142162.00，浓度为 160.000μg/l时平均峰面积为297239.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为 598069.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为1001280.00。
37.bbp的浓度为20.000μg/l时平均峰面积为10840.00，浓度为40.000μg/l时平均峰面积为22625.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为46391.00，浓度为 160.000μg/l时平
均峰面积为105054.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为 223900.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为374175.00。
38.dehp的浓度为20.000μg/l时平均峰面积为28258.00，浓度为40.000μg/l 时平均峰面积为50765.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为99003.00，浓度为160.000μg/l时平均峰面积为220082.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为 459435.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为776241.00。
39.dnop的浓度为20.000μg/l时平均峰面积为21485.00，浓度为40.000μg/l 时平均峰面积为47786.00，浓度为80.000μg/l时平均峰面积为109116.00，浓度为160.000μg/l时平均峰面积为259787.00，浓度为300.000μg/l时平均峰面积为 558528.00，浓度为500.000μg/l时平均峰面积为945860.00。
40.邻苯二甲酸酯类激素化合物的标准曲线如图2所示。
41.综上所述，本发明的有益效果在于：本发明基于生物检测对再生水中多种微量的内分泌干扰化合物联合作用效应进行分析，开发出基于生物活体模型的检测技术，从再生水的综合生物学和毒理学活性来直接评估再生水中内分泌干扰化合物污染的健康危害程度。能有效运用于再生水环境雌激素内分泌干扰化合物污染检测，为再生水回用安全评估提供监测和预警技术。
42.实际环境中污染物不是独立存在的，而是和其他化合物联合存在的，各种化合物联合存在时具有增强或拮抗的毒性作用。当检测对象是一些污染物浓度比较低的干净水体如再生水和水源水等，这些水体中污染物种类多浓度低，存在拮抗、增强、相加等联合作用效应，有可能gcms检出了雌激素化合物，但是由于存在拮抗作用，并不能引起vtg的诱导，也可能是gc-ms未检出，但是低剂量的雌激素内分泌干扰物存在协同增强效应，导致vtg1的诱导，所以单纯用卵黄蛋白原诱导效应或直接用gcms测定都存在问题。
43.鱼类卵黄蛋白原特异性的产生于成熟雌性动物肝脏中，正常条件下，雄鱼或者幼鱼体内很难检测到表达，但在雌二醇及环境类雌激素暴露下，鱼卵、幼鱼和雄性也会大量表达卵黄蛋白原。因而，鱼卵、幼鱼和雄鱼卵黄蛋白原的诱导可以指示环境中雌激素污染。本研究选用成熟的雄性斑马鱼为活体模型，建立了针对卵黄蛋白原的活体环境雌激素检测技术。与化学方法相比，生物检测可以避开成分检测，直接分析环境雌激素对健康的危害程度。但目前极少有研究运用小型模式水体生物检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物。因而有必要开发基于生物活体模型的检测技术，从再生水的综合生物学和毒理学活性来直接评估再生水中内分泌干扰化合物污染的健康危害程度。本发明联合使用雌激素内分泌干扰化合物化学分析方法gc-ms分析微量或痕量有机污染物污染水体，能直接评估再生水中内分泌干扰化合物污染的健康危害程度，为再生水回用安全评估提供监测和预警技术，并已成功运用于贵阳污水处理厂再生水中微量环境雌激素内分泌干扰化合物污染检测。
附图说明
44.图1为酚类和固醇类雌激素化合物的标准曲线图；其中，a为4-叔辛基酚 (op)，b为壬基酚，c为双酚a-d16(bpa-d16)，d为双酚a，e为17α-乙炔基雌二醇(ee2)，f为17β-雌二醇。
45.图2为邻苯二甲酸酯类激素化合物的标准曲线图；其中，a为邻苯二甲酸二甲酯
(dmp)，b为邻苯二甲酸二乙酯(dep)，c为邻苯二甲酸二正丁酯(dbp)， d为邻苯二甲酸丁基苄基酯(bbp)，e为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(dehp)， f为邻苯二甲酸二正辛酯(dnop)。
46.图3为雌激素内分泌干扰化合物质谱图；其中，(1)为酚类和固醇类雌激素化合物；(2)为邻苯二甲酸酯类激素化合物。
47.图4为再生水处理对雄性斑马鱼肝脏vtg1基因转录水的影响。
具体实施方式
48.下面对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神上的改进或代替，仍属于本发明权利要求所要求保护的范围。
49.实施例1
50.一种生物-化学联合检测再生水中微量雌激素内分泌干扰化合物污染的方法，包括以下步骤：
51.1、实验所用试剂：
52.17β-雌二醇(17α-estradiol，e2)，炔雌醇(17α-ethinylestradiol，ee2)，辛基酚(octyl phenol，op)，壬基酚(nonylphenol，np)，双酚a(bisphenola，bpa)以及邻苯二甲酸盐类化合物(phthalates，paes)，包括邻苯二甲酸二甲酯(dimethyl pimelimidate，dmp)，邻苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate，dep)，邻苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate，dbp)，邻苯二甲酸丁苄基酯(benzyl butyl phthalate，bbp)，邻苯二甲酸二正辛酯(di-n-octyl phthalate，dnop)和邻苯二甲酸二(2－乙基己基)酯(di(2-ethylhexyl)phthalate，dehp)。
53.所用溶剂：甲醇(上海安谱，色谱纯)、乙酸乙酯(上海安谱，色谱纯)和丙酮(上海安谱，色谱纯)。衍生化试剂七氟丁酸酐(mtbstfa)、e2、ee2、 op、np、bpa)和bpa-d16购买于supelco，dmp、dep、dbp、bbp、dnop 和dehp购买于sigma-aldrich。
54.标准溶液配制：分别准确称取固醇和酚类化合物标准品，用甲醇配制成10 mg/ml标准储藏溶液，分别量取邻苯二甲酸酯类化合物标准品，用乙酸乙酯稀释成100mg/ml标准储藏溶液，所有的标准溶液在使用前都储存于4℃。
55.酚类和固醇类雌激素化合物的标准曲线如图1所示；邻苯二甲酸酯类激素化合物的标准曲线如图2所示。
56.2、化学分析：在贵阳再生水厂二级及三级水样分别设置采样点s1和s2，各采样1l，水样采集后4℃保存。采用gc-ms法对再生水环境雌激素内分泌干扰化合物进行污染检测，在检测前对水样进行前处理；
57.进一步，所述的前处理，分为邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理以及固醇和酚类化合物分析水样前处理。
58.进一步，所述的邻苯二甲酸酯类化合物分析水样前处理，具体方法为：
59.取500ml水样加入10g氯化钠，摇匀后，加入20ml乙酸乙酯，震荡10min，静置10min，重复萃取3次，合并萃取液，氮吹定容至1ml，将目标分析物浓缩500倍，上机分析。
60.进一步，所述的固醇和酚类化合物分析水样前处理，具体方法为：
61.取水样500ml，加入内标(双酚a-d16、200ng.l-1
)混匀。
62.进一步，所述的gc-ms法，具体分析方法为：
63.上样前依次用甲醇和超纯水活化hlb(waters公司，500mg/6ml)小柱，将水样以5ml/min流速上样，用10-20ml甲醇洗脱小柱，氮吹定容至1ml体积，加入七氟丁酸酐30μl，30℃下衍生30min，氮吹至干，加入1ml正己烷，将目标分析物浓缩500倍，上机分析。
64.通过直接将1μl提取物注入gc-ms2020nx(岛津)，色谱柱采用 rtx-5ms(30
×
0.25
×
0.25)。
65.升温程序：起始温度50℃保持1min；以10℃/min速度上升到200℃，保持1min；以10℃/min速度上升到280℃，保持2min；以30℃/min速度上升到 310℃，保持5min。
66.其他条件：气化室温度：250℃；载气：he气；载气流量：1.0ml/min；不分流。
67.质谱条件：ei源；电子能量：70ev；离子源温度：240℃；扫描模式：sim。
68.目标化合物的检测限(lod)，dmp、dbp、dep、bbp、dehp和dnop的lod分别为12.24、25.98、29.04、2.64、20.82、2.7ng.l-1
，op、np、bpa、ee2 和e2的lod分别为5.66、6.97、8.27、9.55、12.35ng.l-1
。邻苯二甲酸酯类化合物的平均回收率在70％-110％之间。固醇和酚类化合物加入bpa-d16检测回收率，样品的加标回收率在75％-100％之间。雌激素内分泌干扰化合物的质谱条件如表1所示，雌激素内分泌干扰化合物的质谱图如图3所示。
69.表1雌激素内分泌干扰化合物的质谱条件
[0070][0071]
3、生物分析：采用实时定量pcr方法检测性成熟斑马鱼雄鱼卵黄蛋白原 (vtg1)的表达，并以β-actin为内参基因建立vtg1转录水平的检测体系，再通过暴露实验分析再生水雌激素内分泌干扰化合物的污染程度。具体包括以下步骤：
[0072]
(1)样品采集与预处理
[0073]
采集的再生水样品过夜澄清，获得澄清再生水，弃掉底部固体沉积物；
[0074]
(2)暴露实验
[0075]
选择3-4个月大的健康雄性斑马鱼为暴露对象，充分曝气除氯自来水水样为阴性对照用水。设置三个平行样，每个平行样包含5条随机获取的雄鱼。采集样品与对照同时暴露，暴露时间为14天，暴露期间每天喂食丰年虾2次，每天换水。成熟雄鱼暴露后，处死鱼，解剖，获取肝脏组织，迅速收入-80℃冰箱中保存；
[0076]
(3)鱼样品处理
[0077]
采用rna提取试剂盒(中国宝生物工程有限公司)提取rna，采用反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)将rna反转录得到cdna，采用荧光定量pcr试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行荧光定量pcr检测成年雄性斑马鱼卵黄蛋白原vtg1表达水平，进而指示环境雌激素内分泌干扰化合物的污染；荧光定量pcr反应体系为qpcr master mix 10μl、cdna模板1 μl、nuclease-free water 7μl和上下游引物各1μl；反应在cfx96tm real-time system实时定量pcr仪中进行；
[0078]
vtg1引物序列为：f:5
’‑
ccttggagaaaattgaggctatc-3’；r:5
’ꢀ‑
ctgaatgaactcgggagtggta-3’；
[0079]
β-actin引物序列为：f:5
’‑
tctggcatcacaccttctacaat-3’；r:5
’ꢀ‑
tgttggctttgggattcagg-3’。
[0080]
反应在cfx96tm real-time system实时定量pcr仪(美国bio-rad公司) 中进行，pcr温度程序为预变性：95℃3min；变性：95℃30s，退火：60℃30s，延伸：72℃30s，共40个循环；熔解曲线分析：60～95℃。以β-actin为内参基因，利用方法分析vtg1的相对表达量。采集水样，以充分曝气除氯自来水作为阴性对照组，对斑马鱼成体雄鱼分别进行充分曝气除氯自来水和再生水暴露，进行三次平行暴露14天，提取成体雄鱼肝脏rna，检测vtg1的表达量，与阴性对照组比较，分析再生水雌激素内分泌干扰化合物污染程度。
[0081]
以阴性对照组的基因表达量为参比值，计算暴露于样品的基因相对于阴性对照组的表达量。阳性对照组用于确认体系的正常运行，并为样品的再生水环境雌激素内分泌干扰化合物污染程度提供定性认知。再生水中雌激素化合物测定结果如表2所示；再生水处理对雄性斑马鱼肝脏vtg1基因转录水的影响如图4所示，结果表现为平均值
±
标准差(n＝3)，*p≤0.05,**p≤0.01表示实验组与对照组有显著差异。
[0082]
表2再生水中雌激素化合物测定结果
[0083][0084]
注:nd表示低于检出限。