生物传感器制作、检测方法、生物传感器及光电磁系统

1.本发明属于数字微流控生物传感器技术领域，尤其涉及生物传感器制作、检测方法、生物传感器及光电磁系统。


背景技术：

2.本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。
3.定量测量生物活性分子(dna、rna、蛋白质和配体等)，特别是对 dna的定量检测及其结合动力学的研究，在疾病诊断、药物筛选、生命科学研究以及环境监测等领域中具有重要意义。
4.到目前为止，已经研发出各种各样对dna杂交动力学检测的方法，主要包括荧光生物传感器、电化学生物传感器以及场效应晶体管生物传感器等。其中，荧光生物传感器和基于纳米材料(一维硅纳米线和碳纳米管等) 的场效应晶体管(field effect transistor，fet)生物传感器由于具有较高的检测灵敏度和可选择性引起了广泛关注。
5.但是目前单链dna检测中存在无法自动化和集成度低的缺点。


技术实现要素：

6.为克服上述现有技术的不足，本发明提供了生物传感器制作、检测方法、生物传感器及光电磁系统，可用于单链dna的高灵敏度检测，且实现检测过程的自动化。
7.为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：
8.第一方面，公开了一种生物传感器的制作方法，包括：
9.将石墨烯薄膜生长在铜箔上并获得石墨烯块，将石墨烯块附着有有机玻璃；
10.去除掉石墨烯薄膜所依附的铜箔，将石墨烯薄膜移动到带有氧化铟锡电极的玻璃板上作为两个电极中间的桥梁，玻璃片上的两个电极分别作为生物传感器的源极和漏极；
11.将转移上石墨烯的氧化铟锡的玻璃板盖在数字微流控芯片的通道上作为盛放待测溶液的容器；
12.在数字微流控芯片上打孔，孔中通过的电极作为栅极输入电压，形成电通道；激发光源通过光纤传导至敏感区，形成光通道；施加周期性的磁场，形成磁通道。
13.在一些实施例子中，针对石墨烯块，在石墨烯块表面均匀的涂上 pmma，之后，加热带有石墨烯的铜箔以使pmma与石墨烯薄膜紧密结合。
14.作为进一步的实施例子中，采用配置完备的三氯化铁溶液去除掉石墨烯薄膜所依附的铜箔：
15.使附着有pmma的石墨烯块悬浮在三氯化铁溶液里，等待铜基地完全被腐蚀，将石墨烯薄膜放入去离子水中清洗。
16.作为进一步的实施例子中，将石墨烯薄膜移动到带有氧化铟锡电极的玻璃板上作为两个电极中间的桥梁之后，还包括：使用丙酮溶液清洗依附在石墨烯表层的pmma。
17.作为进一步的实施例子中，还包括：将溶于二甲基亚砜的pbase移动到制备好的数字微流控反应腔中室温孵化；
18.分别用dmso、去离子水依次清洗生物传感器，去除未反应的pbase；
19.将aptamer注入反应腔并在室温下孵化，使aptamer与pbase充分结合；
20.分别用含有sds的pbs液和pbs液清洗生物传感器，来去除掉未结合的aptamer。
21.第二方面，公开了一种生物传感器，所述生物传感器通过上述制作方法获得。
22.第三方面，公开了一种生物传感器的检测方法，包括：
23.将待测目标物加入生物传感器中以保障待测目标物与探针适配体充分杂交结合；
24.洗涤生物传感器，以此来去除未结合的被荧光基团标记的待测目标物；
25.记录生物传感器的电信号变化与荧光强度的变化来实现对待测目标物的检测，每次测量后，冲洗该生物传感器，以再生探针适配体。
26.作为进一步的实施例子，上述生物传感器的检测方法用于对不同浓度的dna进行检测。
27.第四方面，公开了光电磁系统，包括：
28.包括光路部分和电路部分，所述光路部分用于产生光信号，将得到的光信号转变为电信号输出并实时上传到数据采集和控制单元以反映当下的荧光强度；
29.所述电路部分主要包括栅压输出模块、d/a转换模块、桥式电路模块、ad信号采集模块、电机驱动模块及数据采集和控制单元；
30.栅压输出模块输出的栅极电压经过d/a转换模块转换并通过agcl电极应用于生物传感器，生物传感器的源极和漏极之间的电压直接通过桥式电路模块处理并经过ad信号采集模块进行实时记录；
31.电机驱动模块采用pwm的方式控制电机速度；
32.ad信号采集模块采集的阻抗波动上传至数据采集和控制单元进行实时记录。
33.作为进一步的实施例子，所述光路部分包括光纤准直器、高通滤光片及pmt；
34.所述光纤准直器将灯发出的光汇聚成平行光束，该平行光束经过光纤传到生物传感器，激发荧光，被激发的荧光首先经过光纤准直器汇聚成平行光束，然后经过光纤传到高通滤光片；
35.所述高通滤光片对传输来的光再次滤光后，汇聚到pmt的有效感应区；
36.所述pmt将得到的光信号转变为电信号输出并实时上传到上位机以反映当下的荧光强度。
37.以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：
38.本发明光电磁msigfet生物传感器不仅提高了检测结果的准确率，而且微流控芯片体积小，芯片上的样品的控制尺度在微米量级，成本低，便于携带，自动化程度高。
39.本发明除了可以对同一目标进行检测外，该传感器还有可能对不同目标物进行检测，特别是基于光的穿透性和无创性，有潜力应用于细胞内外不同种分子的检测，这对研究细胞活性机制具有重要意义。
40.本发明为构建多重传感技术集成的生物传感器提供了一种新的策略。针对目前的单链dna检测一般只采用单一通道的检测方法，如荧光生物传感器、电化学生物传感器以及场效应晶体管生物传感器等，本发明将几种传感器的检测方法集成在一起，使检测结果相
互验证，从而得到更为准确的结果。
41.针对目前的单链dna检测大多依赖大型仪器分析，所用样品种类较多时会面临进、出样繁琐的问题，且无法精准控制反应时间。本发明利用数字微流控技术可以对样品运动路线进行编程，并实现样品的连续多步处理，同时也可对多样本液滴的位置和反应时间进行精确的控制，提高了自动化程度。
42.本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
43.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
44.图1为本发明实施例石墨烯的转移过程示意图；
45.图2为本发明实施例msigfet结构原理图；
46.图3为本发明实施例msigfet的功能化与检测原理示意图；
47.图4为本发明实施例msibds的示意图；
48.图5为本发明实施例光电磁三通道灵敏度检测结果比较示意图；
49.图6为本发明实施例光电磁三通道特异性检测结果比较示意图。
具体实施方式
50.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
51.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。
52.在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
53.名词解释：
54.cvd：化学气相沉积；
55.pmma：聚甲基丙烯酸甲酯，polymethylmethacrylate；
56.pbase：1-芘丁酸琥珀酰胺酯，1-pyrenebutanoic acid succinimidyl ester；
57.dmso：二甲基亚砜,dimethyl sulfoxide；
58.aptamer：适配体，这里指dna链；
59.含有0.2％sds的pbs：含有0.2％十二烷基硫酸钠的磷酸缓冲盐溶液；
60.msibds：光电磁多传感方式集成的生物传感检测系统，multi-sensing integrated biosensing detection system；
61.pmt：光电倍增管。
62.近年来，随着数字微流控(dmf)技术被广泛应用。数字微流控技术是近年来在芯片上发展起来的一种新的操纵微小体积液体的技术。
63.其原理是通过向芯片的电极上施加电压，从而改变芯片介质层与其上液滴的表面张力。
64.通过构建电极阵列，相邻电极加电以及原电极断电进而完成液滴的产生、分裂及运输等操作。数字微流控芯片可以对运动路线进行编程，并实现液滴的连续多步处理，同时也可对多样本液滴的位置和反应时间进行精确的控制，制作工艺简单且成本低廉。数字微流控技术可有效解决单链dna 检测中无法自动化和集成度低的缺点，为在线检测单链dna检测提供了便利。
65.分析物表面的反应或吸附引起的电荷变化相当敏感等优良特性，使得二维石墨烯场效应晶体管(graphene field effect transistor，gfet)生物传感器比一维纳米材料fet生物传感器在探测dna杂交动力学方面更具优势。在常规gfet生物传感器中，主要基于gfet生物传感器的双导电层电容模型理论对dna杂交动力学检测进行分析。
66.在栅极通过电介质对石墨烯薄膜施加一定的栅压，使得在石墨烯薄膜和溶液电解质之间的界面处形成双导电层，从而调制gfet的电阻特性。
67.因此，通过对传感器施加一定栅压，分析gfet生物传感器产生的电信号变化，实现对tdna的检测。
68.磁镊技术是一种单分子力谱法，在tdna末端耦合磁性纳米颗粒(mbs)，当施加一定磁场时，通过mbs与磁场之间的磁力，可以实现机械地控制耦合mbs的tdna与石墨烯薄膜之间的距离，从而调制磁控gfet生物传感器的双导电层结构。
69.因此，磁控gfet生物传感器因其具有高信噪比、物理和化学性质稳定、有生物相容性，环保等独特的优势引起了广泛关注。
70.基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，fret) 的荧光生物传感器是一种常用的用于监测dna杂交过程的光学技术。
71.由于其具有分析灵敏度高、选择性强以及使用简便等优点，成为目前研究最广泛的光学传感技术之一。
72.fret是受激发的供体生色团将能量传递给受体生色团(两者在1nm范围内)的现象，当标记在tdna上的荧光基团受到激发时，产生的荧光可以通过强度来衡量，反映tdna的浓度。
73.因此，本发明提出将石墨烯场效应管生物传感、荧光生物传感集成并结合mbs构建了一种基于数字微流控的多传感集成石墨烯场效应晶体管 (多传感集成石墨烯场效应晶体管，msigfet)生物传感器并用于对tdna 的检测。
74.实施例一
75.本发明公开了生物传感器制作方法，具体的，msigfet生物传感器的制作过程如图1所示。
76.本发明采取典型的cvd方法将石墨烯薄膜生长在铜箔上，并采用湿法转移的方式将石墨烯转移到带有氧化铟锡(ito)电极的玻璃基底上来作为 msigfet的源极和漏极。
77.由于铜基底上制作的石墨烯品质较好，比较适合制作对质量要求较为严格的石墨烯生物传感器，所以本发明使用石墨烯依附在铜箔表层的石墨烯薄膜上，具体见图1中的(a)。
78.使用剪刀剪取适宜大小的石墨烯块，为了保证转移石墨烯薄膜的完整性，在剪取的石墨烯表面均匀的涂上pmma，使pmma平铺在石墨烯表面，见图1中的(b)所示，为了使pmma与石墨烯薄膜紧密结合，在具体实施例子中使用加热台加热带有石墨烯的铜箔，以起到加
固结合效果的作用。
79.随后采用配置完备的三氯化铁溶液去除掉石墨烯薄膜所依附的铜箔。使附着有pmma的石墨烯块悬浮在三氯化铁溶液里，等待铜基地完全被腐蚀，捞出石墨烯薄膜放在去离子水中清洗，见图1中的(c)。
80.将清洗干净的石墨烯薄膜移动到带有氧化铟锡电极的玻璃板上作为两个电极中间的桥梁，玻璃片上的两个电极分别作为场效应管传感器的源极和漏极，见图1中的(d)。
81.由于加入了pmma会影响石墨烯生物传感器的响应特性，因此使用丙酮溶液清洗依附在石墨烯表层的pmma，见图1中的(e)。
82.最后将转移上石墨烯的氧化铟锡的玻璃板盖在数字微流控芯片的通道上作为盛放待测dna溶液的容器，见图1中的(f)。
83.msigfet结构的原理图如图2所示。在数字微流控芯片上打孔，孔中通过的agcl电极作为栅极输入电压，形成gfet作为电通道。
84.具体的，agcl电极作为栅极，位于上方的玻璃板上的两个氧化铟锡电极分别作为源极和漏极，此时可形成石墨烯场效应管(gfet)。通过向栅极输入电压，石墨烯上会因为不同的dna链浓度，反映在源极和漏极上会输出不同的电压。最终根据电压的变化来反映dna链的浓度。
85.窄带led作为激发光源，通过光纤传导至敏感区，形成荧光生物传感器，作为msigfet的光通道；在传感器上施加周期性的磁场，形成 msigfet的磁通道。
86.本发明相比于单一通道的检测方式，多通道得到的检测结果可以互相验证，使结果更加准确。
87.gfet的修饰与实现其功能化如图3所示：
88.首先，将溶于二甲基亚砜(dmso)的pbase移动到制备好的数字微流控反应腔中室温孵化2小时。
89.然后，分别用dmso、去离子水依次清洗生物传感器，以此来去除未反应的pbase。将aptamer注入反应腔并在室温下孵化4小时，使aptamer 与pbase充分结合。
90.其次，分别用含有0.2％sds的pbs液和pbs液清洗该生物传感器，来去除掉未结合的aptamer。
91.最后，分别将不同浓度的mbs/tdna的耦合物溶液加入反应腔，依次对tdna进行一系列的检测实验。
92.通过上述制作方法获得生物传感器。
93.实施例二
94.使用生物传感器对tdna的检测步骤具体如下：
95.将待测mbs/tdna加入msigfet传感器中1小时，以保障待测 mbs/tdna与探针适配体充分杂交结合。
96.然后，加入含有0.2％sds的pbs溶液和pbs溶液洗涤msigfet三次，以此来去除未结合的被荧光基团标记的mbs/tdna和过量的mbs。
97.最后，采用光电磁msibds记录msigfet的电信号变化与荧光强度的变化来实现对tdna的检测。
98.每次测量后，用naoh溶液(25℃)冲洗该装置60s，以再生探针适配体。
99.上述待测mbs/tdna耦合过程为：
100.首先利用超声仪，将用羧基修饰的磁性纳米颗粒mbs置于超声中 20min，得到均匀分散的mbs溶液。其次，将均匀分散的mbs溶液与1-乙基-(3-二甲氨基丙基)羧二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰胺(nhs)混合15min以获得活化的mbs。然后，将待测tdna溶液加入到上述混合溶液中，并使其在室温下连续轻微摇动培养2h，使mbs与tdna可以充分的结合。再次，引入强磁场以富集mbs/tdna。最后，将mbs/tdna溶液用pbs洗涤三次并分散在pbs溶液中，并在4℃储存以备将来使用。
101.在磁通道的检测过程中，mbs/tdna耦合就是在目标dna链的一端修饰上磁性纳米颗粒，当的磁场变强时，耦合的磁珠会向磁场方向靠近，使dna 链发生弯折，使石墨烯场效应管的源极和漏极输出发生变化，基于这个原理来检测目标dna链的浓度。
102.此处需要注意的是，光通道、电通道和磁通道并不是同时采集信号，而是先后分别采集。
103.实施例三
104.本实施例的目的是提供光电磁misbds，光电磁misbds的构造图如图4所示，其中主要包括msigfet生物传感器、以及与其匹配的光路部分和电路部分。
105.光路部分主要通过光纤准直器将led灯发出的光汇聚成平行光束。该平行光束经过光纤传到msigfet，激发荧光。被激发的荧光首先经过光纤准直器汇聚成平行光束，然后经过光纤传到520nm的高通滤光片，再次滤光后，汇聚到pmt的有效感应区。pmt将得到的光信号转变为电信号输出并实时上传到上位机以反映当下的荧光强度(the fluorescence intensity， if)。
106.电路部分主要包括电源模块、栅压输出模块、桥式电路模块、ad信号采集模块以及电机驱动模块等。
107.栅压输出模块输出栅极电压，栅极电压(vg)经过d/a转换模块转换并通过agcl电极应用于msigfet。msigfet源极和漏极之间的电压(vds) 直接通过数据采集单元(即ad信号采集模块)进行实时记录。msigfet 电流强度(the current intensity，ic)可以通过vds来计算。在电机驱动模块电路中，本系统采用pwm的方式控制电机输入的pwm信号以进行电机速度的控制，然后将采集到的阻抗波动(the impedance intensity，ii)上传至数据采集单元进行实时记录。
108.采集到的阻抗波动的过程为：当磁场变强时，芯片上的dna由于修饰的磁性纳米颗粒，dna会弯折，修饰磁珠的一端会靠近磁场，该变化会产生阻抗波动，使源极和漏极的输出电压产生变化。
109.最后，将msigfet的荧光强度if、电流强度ic和阻抗波动ii记录并通过ad数据采集模块上传到上位机。通过采集的上述三个信号相互验证，进而得到可靠的结果。
110.本发明光路部分主要为led提供激发光，当标记在tdna上的荧光基团受到激发时，会产生荧光信号，由光电倍增管采集后经过ad信号采集模块最终上传至上位机。
111.电路部分主要包括：电源模块为整个系统电路供电；栅压输出模块使栅极电压(vg)经过d/a转换模块转换并通过agcl电极应用于msigfet；桥式电路模块以差分的方式采集场效应管源极和漏极输出的信号；ad信号采集模块采集光通道、电通道和磁通道产生的信号；电机驱动模块控制磁场的强弱变化。
112.实施例四
113.本实施例子公开了msigfet对不同浓度的dna检测：
114.为了检验msigfet的实用性，研究了不同浓度的tdna和aptamer 之间实时dna杂交的结合动力学。
115.如图5所示，首先，在功能化的石墨烯中按照从低到高的顺序依次加入了不同浓度的mbs/tdna，浓度分别为10pm、1nm、10nm、100nm和 2um。
116.然后，基于msigfet的光电磁多检传感特性和msibds的监测装置，可以获得荧光强度、电流和阻抗的变化。
117.对于电通道，msigfet的电流随着待测mbs/tdna浓度的增加而逐渐降低，并且狄拉克点逐渐左移，图5中(b)图所示。
118.对于光和磁通道，在提供激发光激发以及施加周期性磁场的情况下， msigfet的中荧光强度和阻抗随着待测mbs/dna浓度的增加而逐渐增加图5中(a)、(c)、(d)图所示，其中，(a)光通道灵敏度检测结果， (b)电通道。灵敏度检测结果，(c)磁通道灵敏度检测结果，(d)不同互补tdna浓度的阻抗波动时域图。
119.上述都表明mbs/tdna成功与探针适配体结合。msibds的光电磁三通道在检测tdna敏感性方面显示出一致的趋势。
120.这使该传感器的测量结果比单一传感方式的传感器测量结果更可靠，同时可以看出，该传感器的灵敏度可达到10pm，检测限度较低。
121.另外，关于msigfet的特异性检测：
122.为了验证msigfet的特异性，使用完全错配的mbs/tdna进行验证。
123.首先，将溶解在pbs溶液中的完全错配的mbs/tdna放入反应池1小时完全反应。
124.然后用0.2％的sds溶液和pbs溶液清洗msigfet，清除未反应的完全错配mbs/dna。
125.最后，作为对照实验，将相同浓度完全匹配的mbs/tdna加入反应池， 1小时后再次洗涤，使用msibds检测整个反应过程中荧光强度、电流和阻抗的变化。
126.对于电通道，完全错配的mbs/tdna的电流和狄拉克点没有显著变化，完全匹配的mbs/tdna的电流显著降低，狄拉克点出现左移，见图6中(a) 所示，这表明完全匹配的mbs/tdna与aptamer完全结合，完全错配的 mbs/tdna与aptamer没有结合。
127.对于光-磁通道，完全匹配的mbs/tdna荧光强度和阻抗明显增加，完全错配的mbs/tdna荧光强度和阻抗基本不变，见图6中(b)、(c)所示，荧光强度和阻抗的变化也表明aptamer只与完全匹配的mbs/tdna结合。
128.本实验证明msigfet具有优良的特异性。
129.上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。