一种基于生物效应的心可舒片质量控制方法与流程

1.本发明具体涉及建立一种基于生物效应的心可舒片质量控制方法，属于中成药质量控制技术领域。


背景技术：

[0002]“心可舒片”由丹参、葛根、三七、山楂、木香组成，具有活血化瘀、行气止痛的功效，常用于气滞血瘀引起的胸闷、心悸、头晕、头痛、颈项疼痛；冠心病心绞痛、高血脂、高血压、心律失常见上述证候者。《中国药典》(2020年版一部)(以下简称药典)现行质量标准包括性状、鉴别、检查、特征图谱、含量测定等项目。鉴别项主要包括三七和金丝桃苷鉴别方法。特征图谱包含丹参素钠、原儿茶醛、3
’‑
羟基葛根素、葛根素、3
’‑
甲氧基葛根素、葛根素-7-木糖苷、大豆苷、丹酚酸b等8个特征峰。含量测定以丹酚酸b，丹参素、原儿茶醛、丹酚酸b总量，木香烃内酯，去氢木香内酯的含量为指标。由上可见，药典质量控制体系基本涵盖了心可舒片处方全部药味的控制，但是该体系涉及的实验数量繁多且复杂，质量控制指标与临床功效相关性差，且只检测了少数几个化合物，不能准确评价心可舒片的整体质量。近年来，基于生物效应的质量控制方法受到广泛关注，为中药质量控制提供了新思路。生物效应检测是利用药物对试验系所产生的生物效应，以生物统计为工具，从与药物临床功能主治相关的角度出发，运用特定的实验设计，测定药物有效性、安全性的一种方法。基于生物效应的质量控制方法能够实现不唯成分论，以与临床药效相关的生物效应水平控制中成药质量。尤其对组成药味复杂、有效成分不明确的中成药，更能凸显其整体性与优越性。
[0003]
斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因同源性高达87％，心、肝、肾等脏器生理结构和功能与人类高度相似，具有广泛的p450酶，拥有与人类相似的多条药物代谢途径，是国际认可的模式生物，其在早期药物活性与安全性评价中的应用受到国际顶尖杂志、药物审评管理部门、著名毒理学家、大型制药企业等的持续重点关注。以斑马鱼为模型的实验既具有体外实验快速、高效、成分低和用药量小的优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高和可观察多个器官等优点。研究表明，斑马鱼幼鱼比hipsc心肌细胞系统能够更可靠地预测心脏毒性，且斑马鱼与犬的预测性相似，数十种基于斑马鱼表型筛选的创新药物已经在开展临床研究。目前，斑马鱼模型已经在中药活性评价、药效物质筛选、作用机制研究等方面得到广泛应用。
[0004]
中国文献《斑马鱼高血脂模型在山青之片质量控制中的应用研究》(郭殿宾、周娟等，中国药品标准2013年第14卷第4期)，该文献公开了利用斑马鱼高血脂模型对山青之片降血脂作用进行生物活性评价和质量稳定性检测。中国文献《山青之片辅助降血脂作用临床观察》(冯飞玉、唐礼可等，浙江中西医结合杂质2009年第19卷第9期)公开了山青之片具有降血脂的作用，山青之片主要含有赤芍提取物和党参提取物，而赤芍和党参均具有一定的降血脂作用。由于山青之片功能单一、成分组成相对简单，可以仅利用单个生物效应功能指标进行质量稳定性检测；但是中成药治疗疾病具有多成分、多靶点和多途径的特色与优势，多数中成药具有组方配伍药味多，成分组成复杂，功能主治广泛等特点，能够通过多种
不同药理作用协同起效，仅利用单个生物效应功能指标进行质量控制不可行，易出现错误评估。
[0005]
心可舒片处方含有丹参、葛根、木香、三七、山楂；心可舒片具有扩张冠脉，改善心肌缺血，活血化瘀，改善心脏微循环，增加冠脉血流量，增强心肌细胞线粒体及三磷酸腺苷(atp)酶活性等多种生物活性。现有技术中对处方复杂且具有多种功能主治的中药，利用生物效应进行质量控制还未见报道。


技术实现要素：

[0006]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于生物效应的心可舒片质量控制方法。
[0007]
本发明通过实验研究发现利用心可舒片单功能生物效应易出现错误评价，甚至有些功能生物效应稳定性差，无法作为心可舒片生物效应评价指标。本发明通过大量实验研究发现利用斑马鱼节间血管生成障碍模型和高血脂症模型二者结合可以实现基于生物效应的心可舒片质量控制，且建立了心可舒片基于生物效应的质量控制方法，并开展方法学考察。本发明为处方复杂且具有多种功能主治的中成药，基于生物效应的质量控制研究提供了新思路与方法。
[0008]
术语说明：
[0009]
(1)节间血管(intersegmental vessels,isv)。
[0010]
(2)尾部区域血脂染色强度(integrated optical density,iod)。
[0011]
(3)hpf(hours post fertilization)：生物学专用术语，指受精后的时间。如24hpf指受精后24小时的胚胎。
[0012]
(4)dpf(days post fertilization))：生物学专用术语，指受精后的天数。如1dpf指受精后1天的胚胎。
[0013]
本发明的技术方案如下：
[0014]
一种基于生物效应的心可舒片质量控制方法，包括如下步骤：
[0015]
(1)心可舒片样品甲醇提取物的制备；
[0016]
(2)采用斑马鱼节间血管生成障碍模型对步骤(1)中心可舒片样品甲醇提取物进行生物效应检测，用药浓度以心可舒片样品浓度为85μg/ml为标准；采用斑马鱼高血脂症模型对步骤(1)中心可舒片样品甲醇提取物进行生物效应检测，用药浓度以心可舒片样品浓度为680μg/ml为标准；
[0017]
(3)步骤(2)中心可舒片样品检测结果：斑马鱼节间血管生成障碍模型中斑马鱼节间血管长度达到2180μm以上，斑马鱼高血脂症模型中降脂率达到40％以上，同时达到所述两个指标数值时判定心可舒片样品为合格样品。
[0018]
根据本发明优选的，步骤(1)中利用甲醇提取心可舒片样品提取物。
[0019]
进一步优选的，利用甲醇提取心可舒片样品提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0020]
取心可舒片样品，研磨成粉，称定，加入10倍量甲醇，常温浸泡30min，超声提取30min，固液分离，保留提取液，将剩余药渣再重复提取2次，保留提取液，然后合并提取液体浓缩至浸膏，将浸膏干燥制得心可舒样品提取物。
[0021]
进一步优选的，取心可舒片样品，研磨成粉，称定，加入10倍量甲醇，常温浸泡
30min，超声提取30min，进行抽滤，保留提取液，将药渣重复提取2次，保留提取液，然后合并提取液，将提取液减压浓缩至1/10体积，转移至水浴蒸至浸膏，然后将浸膏真空干燥，制得心可舒片样品提取物。
[0022]
根据本发明优选的，步骤(1)中将心可舒片样品提取物用体积分数10％二甲基亚砜(dmso)配制含100mg/ml心可舒片样品提取物的储备液，用时根据心可舒片样品提取物的得率计算心可舒片样品浓度。
[0023]
根据本发明优选的，步骤(3)中斑马鱼节间血管生成障碍模型中斑马鱼节间血管长度达到2180μm-2382μm，斑马鱼高血脂症模型中降脂率达到43％-56％。
[0024]
根据本发明优选的，步骤(2)中使用imagepro plus 5.1测量节间血管。
[0025]
根据本发明优选的，步骤(2)中使用imagepro plus 5.1测量心可舒片处理组染色强度并计算降脂率，降脂率(％)＝(模型组iod－心可舒片处理组iod)/模型组iod
×
100％；所述iod为尾部区域血脂染色强度。
[0026]
根据本发明优选的，步骤(2)中采用斑马鱼节间血管生成障碍模型对步骤(1)中心可舒片样品提取物进行生物效应检测的方法，包括如下步骤：
[0027]
①
选用23hpf tg(flk1:egfp)血管绿色荧光标记转基因斑马鱼，用1mg/ml链蛋白酶e脱膜，将脱膜后的健康胚胎随机分为空白对照组，模型组，心可舒片处理组，将胚胎随机分配，各组设置2个以上平行，每个平行10-12枚胚胎。空白对照组给予：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso；模型组给予：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787；心可舒片处理组给予：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787+终浓度为85μg/ml的心可舒片；孵育温度28℃，孵育至47hpf时，在荧光显微镜下观察斑马鱼胚胎血管形态；
[0028]
②
定量分析：使用imagepro plus 5.1测量节间血管(isv)。
[0029]
根据本发明优选的，步骤(2)中采用斑马鱼高血脂症模型对步骤(1)中心可舒片样品提取物进行生物效应检测的方法，包括如下步骤：
[0030]
选用5dpf(days post fertilization)野生型ab系斑马鱼，随机分为空白对照组、模型组、心可舒片处理组，每组28-32条，空白对照组给予含0.015mg/ml苯硫脲(ptu)养鱼水，模型组和心可舒片处理组喂食质量分数为0.1％的蛋黄溶液，处理48h后，移除蛋黄溶液，空白对照组和模型组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso的养鱼水，心可舒片处理组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso+680μg/ml心可舒片的养鱼水，孵育温度28℃，处理24h换液，继续处理24h后，使用imagepro plus 5.1测量心可舒片处理组染色强度并计算降脂率，降脂率(％)＝(模型组iod－心可舒片处理组iod)/模型组iod
×
100％。
[0031]
上述质量控制方法在心可舒片样品质量检查中的应用。
[0032]
根据本发明优选的，所述方法在心可舒片缺方样品、心可舒片投料减半样品检测中的应用。
附图说明
[0033]
图1为心可舒片合格样品促血管生成活性测定结果图；
[0034]
图中：a为心可舒片样品促血管生成表型图；b、c、d分别为心可舒片合格样品促血管生成活性的不同3天重复实验结果柱形图；
[0035]
图2为各样品促血管生成活性测定结果图；
[0036]
图中：a为心可舒片合格样品促血管生成表型图，b为心可舒片合格样品促血管生成活性柱形图；
[0037]
c为缺方阴性样品、投料减半阴性样品促血管生成表形图，d为缺方阴性样品、投料减半阴性样品促血管生成活性柱形图。
[0038]
图3为心可舒片合格样品降血脂活性测定结果图；
[0039]
图中：a为心可舒片合格样品降血脂活性表型图，b、c、d分别为心可舒片合格样品不同3天重复实验iod结果柱形图；f、e、g分别为心可舒片合格样品不同3天重复实验降血脂率结果柱形图。
[0040]
图4为各批次心可舒片合格样品降血脂活性评价结果图；
[0041]
图中：a为各批次心可舒片合格样品降血脂活性表型图；b为各批次心可舒片合格样品降血脂活性iod柱形图；c为为各批次心可舒片合格样品降血脂活性降脂率柱形图。
[0042]
图5为缺方阴性样品与投料减半阴性样品降血脂活性评价结果图；
[0043]
图中：a为缺方阴性样品与投料减半阴性样品降血脂活性表型图；b为缺方阴性样品与投料减半阴性样品降血脂活性iod柱形图；c为缺方阴性样品与投料减半阴性样品降血脂活性降脂率柱形图。
[0044]
图6心可舒片抗血栓活性测定结果图；
[0045]
图中：a为心可舒片抗血栓活性表型图；b、c、d分别为不同3天重复实验area结果图；e、f、g分别为不同3天重复实验iod结果图。
[0046]
有益效果
[0047]
1、本发明通过大量实验研究发现利用斑马鱼节间血管生成障碍模型和高血脂症模型二者结合可以实现基于生物效应的心可舒片质量控制，且建立了心可舒片基于生物效应的质量控制方法，并开展方法学考察。本发明为处方复杂且具有多种功能主治的中成药，基于生物效应的质量控制研究提供了新思路与方法。
[0048]
2、本发明建立了基于斑马鱼生物效应的心可舒片整体质量控制方法，对心可舒片以化学成分为检测指标的现行标准提供了重要补充。
[0049]
3、本发明以促血管生成和降血脂活性为指标建立了心可舒片生物效应质量控制方法，该方法与心可舒片临床功效密切相关，不唯成分论，能够更准确的控制心可舒片质量。
[0050]
4、本发明建立的方法，为斑马鱼在处方复杂且具有多种功能主治的中成药生物效应质量控制方法中的应用具有示范作用。
具体实施方式
[0051]
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但本发明内容的保护范围不限于此。
[0052]
实施例中未详加说明的内容均按本领域现有技术。
[0053]
材料来源
[0054]
养鱼水：含5.0mm nacl，0.17mm kcl，0.4mm cacl2，0.16mm mgso4。
[0055]
0.1％亚甲基蓝：称取100mg亚甲基蓝粉末溶于100ml纯净水，4℃保存备用。
[0056]
1mg/ml ptu：称取1g苯硫脲粉末溶于1l纯净水中，超声2h充分溶解，4℃保存备用。
[0057]
10％二甲基亚砜：二甲基亚砜与纯净水以体积比1：9混合配制。
[0058]
1mg/ml链蛋白酶e：1mg链蛋白酶e溶于1ml纯净水中，现用现配。
[0059]
0.1％蛋黄溶液：称取1g蛋黄粉溶于1000ml含0.015mg/ml ptu的养鱼水，充分搅拌均匀。
[0060]
25％丙二醇溶液：pbs与丙二醇以体积比3：1混合配制。
[0061]
50％丙二醇溶液：pbs与丙二醇以体积比1：1混合配制。
[0062]
75％丙二醇溶液：pbs与丙二醇以体积比1：3混合配制。
[0063]
0.3％油红o染色液：取0.25g油红o粉末，加50ml异丙醇溶液，超声90min充分溶解，4℃避光长期保存。用时取适量与纯净水以体积比3：2混匀，0.22μm微孔滤膜过滤。
[0064]
pbt：100ml pbs中加入100μl tween 20。
[0065]
心可舒片由山东沃华医药科技股份有限公司提供，批号为0100714、0110277、0110278、0110279、0110280、0110281。
[0066]
斑马鱼由山东省科学院生物研究所斑马鱼药物筛选平台(山东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选工程技术研究中心)提供，也可以由国家斑马鱼资源中心购买。
[0067]
pbs:1
×
pbs:genview,cat#:gs3101-500ml。
[0068]
实施例1
[0069]
样品甲醇提取物的制备
[0070]
心可舒片合格样品、缺方阴性样品、投料减半阴性样品甲醇提取物的制备方法，包括如下步骤：
[0071]
取样品研磨成粉，称定，转移至烧杯中，加入10倍量甲醇，常温浸泡30min，超声(40khz)提取30min，抽滤，药渣重复提取2次。合并抽滤液，减压浓缩至1/10体积，转移至蒸发皿中水浴蒸至浸膏状，真空干燥，得甲醇提物，计算得率。用体积百分数为10％的二甲基亚砜(dmso)配制含100mg/ml心可舒片醇提物的储备液，用时根据得率计算心可舒片浓度。
[0072]
各样品甲醇提取物的提取率见表1：
[0073]
表1
[0074][0075]
实施例2
[0076]
采用斑马鱼节间血管生成障碍模型评价不同样品对节间血管生成活性的检测方法，包括如下步骤：
[0077]
(1)选用23hpf tg(flk1:egfp)血管绿色荧光标记转基因斑马鱼，用1mg/ml链蛋白酶e脱膜。将脱膜后的健康胚胎随机分为空白对照组，模型组，心可舒片处理组，将胚胎随机置于24孔板中，各组设置3个平行孔，每孔10枚胚胎。空白对照组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso；模型组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787；心
可舒片处理组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787+终浓度分别为21.25、42.5、85μg/ml的心可舒片。孵育温度28℃，孵育至47hpf时，即给药24h(光照14h避光10h)后观察结果，在荧光显微镜下观察斑马鱼胚胎血管形态，侧视角拍照。
[0078]
(2)定量分析：使用imagepro plus 5.1测量isv，并进行统计学分析，检测结果见图1。
[0079]
当心可舒片处理组斑马鱼的isv大于模型组，且达到统计学上的显著性水平(p-value＜0.05),说明该浓度的心可舒片对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
[0080]
斑马鱼的麻醉采用浓度为0.3
‰
的三卡因浸泡40
–
90s进行麻醉。采集图像为斑马鱼胚胎固定侧面体位，在荧光显微镜下观察拍照，获得斑马鱼胚胎侧位图像；采集的图像是在同一放大倍数下获得。
[0081]
isv是斑马鱼血管生成的评价指标，可以推测药物对血管生成的影响。当药物具有抑制血管生成的作用时，isv会出现数量缺失、长度缩短、发育畸形等现象；当药物具有促进血管生成的作用时，可以逆转isv数量缺失、长度缩短、发育畸形等现象。如图1所示，85μg/ml心可舒片促血管生成活性显著。
[0082]
对所述检测方法进行日间精密度考察。
[0083]
按照步骤(1)、(2)中的方法，分三天进行测定，根据3次活性测定结果的相对标准偏差(rsd)，评价方法的重现性，心可舒片处理组中心可舒片终浓度为85μg/ml，检测结果见表2。
[0084]
表2心可舒片促血管生成活性实验日间精密度考察
[0085][0086]
如图1所示，85μg/ml心可舒片促血管生成活性显著，日间精密度rsd为4.52％(见表2)，表明该方法可用于心可舒片促血管生成活性测定。以心可舒片浓度为85μg/ml为标准，根据得率计算各样品对应浓度，在相同条件下进行实验，采用斑马鱼节间血管生成模型评价不同样品对斑马鱼节间血管生成的影响。
[0087]
实施例3
[0088]
采用斑马鱼节间血管生成障碍模型评价不同样品对节间血管生成活性的检测方法，步骤如下：
[0089]
(1)选用23hpf tg(flk1:egfp)血管绿色荧光标记转基因斑马鱼，用1mg/ml链蛋白酶e脱膜。将脱膜后的健康胚胎随机分为空白对照组，模型组，各样品处理组，将胚胎随机置于24孔板中，各组设置3个平行孔，每孔10枚胚胎。空白对照组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso；模型组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787；各样品处理组：养鱼水中含体积分数为0.1％dmso+终浓度为0.175μg/ml的ptk787+终浓度分别为85μg/ml的各样品。孵育温度28℃，孵育至47hpf时，即给药24h(光照14h避光10h)后观
察结果，在荧光显微镜下观察斑马鱼胚胎血管形态，侧视角拍照。
[0090]
(2)定量分析：使用imagepro plus 5.1测量isv，并进行统计学分析，检测结果见图2、表3。
[0091]
当心可舒片处理组斑马鱼的isv大于模型组，且达到统计学上的显著性水平(p-value＜0.05),说明该浓度的心可舒片对斑马鱼的血管生成具有促进作用。
[0092]
斑马鱼的麻醉采用浓度为0.3
‰
的三卡因浸泡40
–
90s进行麻醉。采集图像为斑马鱼胚胎固定侧面体位，在荧光显微镜下观察拍照，获得斑马鱼胚胎侧位图像；采集的图像是在同一放大倍数下获得，
[0093]
如图2ab所示，各合格批次心可舒片均具有显著的促血管生成活性。如图2cd所示，缺方或减方阴性样品中，仅1/2ds(丹参减半)样品具有促血管生成活性。如表3所示，6批次心可舒片合格样品处理组的斑马鱼节间血管长度均较模型组显著增加，长度均为2184.20-2381.64μm。投料减半阴性样品处理组节间血管长度均为1721.03-2070.51μm。缺方阴性样品处理组节间血管为1628.74-1739.60μm。阴性样品促血管生成活性均低于心可舒片合格样品；由实验结果得出合格样品的斑马鱼节间血管长度达到2184.20-2381.64μm。
[0094]
但是，如图2d所示，1/2ds(丹参减方阴性样品)处理组的isv为2070.51较ptk787处理组具有显著性差异，说明1/2ds阴性样品具有促血管生成活性，并且与合格样品促血管生成活性非常接近，仅由促血管生成的实验结果无法判定该样品为不合格样品；对样品检测结果容易出现误判。
[0095]
表3各样品处理组节间血管长度
[0096][0097][0098]
实施例4
[0099]
采用斑马鱼高血脂症模型评价不同样品降血脂活性的检测方法，步骤如下：
[0100]
(1)选用5dpf(days post fertilization)野生型ab系斑马鱼，随机分为空白对照组、模型组、心可舒片处理组，每组30条，空白对照组给予含0.015mg/ml ptu养鱼水，模型组和心可舒片处理组喂食质量分数为0.1％蛋黄溶液，处理48h后，移除蛋黄溶液，空白对照组和模型组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso的养鱼水，心可舒片处理组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso+终浓度分别为170、340、680μg/ml心可舒片的养鱼水，孵育温度为28℃，处理24h换液(光照14h避光10h)，继续处理24h(光照14h避光10h)后，进行油红o染色。
[0101]
(2)油红o染色：
[0102]
①
固定：移除斑马鱼的处理液，加入质量分数为4％的多聚甲醛(pfa)，室温固定4h或4℃过夜。
[0103]
②
脱水：依次用25％、50％、75％和100％丙二醇脱水10min。
[0104]
③
染色：0.3％油红o染色液28℃染色4h。
[0105]
④
复水：依次用100％、75％、50％、25％丙二醇和pbs脱色10分钟。
[0106]
⑤
洗脱：用pbt洗脱15min，洗脱4次。
[0107]
(3)定量分析
[0108]
按照现有技术，在显微镜下观察步骤(2)油红o染色后的斑马鱼，通过观察斑马鱼血脂染色强度定性判断高脂血症模型是否建立成功，斑马鱼高血脂症模型建模成功后，使用imagepro plus 5.1测量空白对照组与模型组iod，使用imagepro plus 5.1测量心可舒片处理组染色强度并计算降脂率。降脂率(％)＝(模型组iod－心可舒片处理组iod)/模型组iod
×
100％。
[0109]
当心可舒片处理组iod低于模型组，且达到统计学上的显著性水平(p-value＜0.05)，说明该浓度的心可舒片对斑马鱼高脂血症具有治疗作用。
[0110]
高脂血症是指人体内脂类成分代谢异常紊乱，主要表现为血浆中的胆固醇(tc)过高和(或)甘油三酯(tg)过高或低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)过高或高密度脂蛋白胆固醇水平过低(hdl-c)的各种血脂成分异常。高脂血症是动脉粥样硬化的主要发病因素，常因侵犯重要器官而引起严重的后果，如糖尿病、心脑血管疾病、顽固性高血压及肾病综合症、胰腺炎、结石症、脂肪肝等。本发明中用质量分数为0.1％的蛋黄溶液喂食斑马鱼，造成斑马鱼高脂血症疾病模型。如图3所示，心可舒片处理组降脂率呈剂量依赖性升高，与模型组均具有显著性差异，选择心可舒片终浓度为680μg/ml进行后续试验。
[0111]
对所述检测方法进行日间精密度考察。
[0112]
按照步骤(1)、(2)中的方法，分三天进行测定，根据3次活性测定结果的相对标准偏差(rsd)，评价方法的重现性，心可舒片处理组中心可舒片终浓度为680μg/ml，检测结果见表4。
[0113]
表4心可舒片降血脂活性实验日间精密度考察
[0114][0115]
如图3所示，心可舒片处理组降脂率呈剂量依赖性升高，与模型组均具有显著性差异。680μg/ml心可舒片处理组降血脂日间精密度rsd为7.89％(见表4)，表明该方法可用于心可舒片降血脂活性测定。以心可舒片浓度为680μg/ml为标准，根据得率计算各样品对应浓度，在相同条件下进行实验，采用斑马鱼降血脂模型评价不同样品对斑马鱼高脂血症的影响。
[0116]
实施例5
[0117]
采用斑马鱼高血脂症模型评价不同样品降血脂活性的检测方法，步骤如下：
[0118]
(1)选用5dpf(days post fertilization)野生型ab系斑马鱼，随机分为空白对照组、模型组、各样品处理组，每组30条，空白对照组给予含0.015mg/ml ptu养鱼水，模型组和各样品处理组喂食质量分数为0.1％的蛋黄溶液，处理48h后，移除蛋黄溶液，空白对照组和模型组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso的养鱼水，各样品处理组给予含0.015mg/ml ptu+0.1％dmso+终浓度为680μg/ml各样品的养鱼水，孵育温度为28℃，处理24h换液(光照14h避光10h)，继续处理24h(光照14h避光10h)后，进行油红o染色。
[0119]
(2)油红o染色：
[0120]
①
固定：移除斑马鱼的处理液，加入质量分数为4％的多聚甲醛(pfa)，室温固定4h或4℃过夜。
[0121]
②
脱水：依次用25％、50％、75％和100％丙二醇脱水10min。
[0122]
③
染色：0.3％油红o染色液28℃染色4h。
[0123]
④
复水：依次用100％、75％、50％、25％丙二醇和pbs脱色10分钟。
[0124]
⑤
洗脱：用pbt洗脱15min，洗脱4次。
[0125]
(3)定量分析
[0126]
按照现有技术，在显微镜下观察步骤(2)油红o染色后的斑马鱼，通过观察斑马鱼血脂染色强度定性判断高脂血症模型是否建立成功，斑马鱼高血脂症模型建模成功后，使用imagepro plus 5.1测量空白对照组与模型组iod，使用imagepro plus 5.1测量心可舒片处理组染色强度并计算降脂率。降脂率(％)＝(模型组iod－心可舒片处理组iod)/模型组iod
×
100％。
[0127]
如图4和表5所示，各合格批次心可舒片均具有显著的降血脂活性，降脂率为43.95％-55.20％。如图5和表5所示，除缺丹参阴性样品(qds)外，其他各阴性样品均具有一定的降脂作用，但较合格样品活性明显减弱。缺方样品的降脂率仅为7.49％-13.43％，减方阴性样品降脂率为17.22％-31.64％。
[0128]
由实验结果得出合格样品的降脂率达到43.95％-55.20％。但是减方阴性样品1/2sz降脂率达31.64％，相对于模型组降血脂活性效果显著，仅利用降血脂活性对减方阴性样品1/2sz进行评价，易出现误判，而减方阴性样品1/2sz在实施例3中的血管长度仅达到1853.66μm，促血管生成活性不显著。
[0129]
表5各样品处理组降脂率
[0130][0131]
对比例1
[0132]
采用斑马鱼抗血栓模型评价心可舒片抗血栓活性的检测方法，步骤如下：
[0133]
(1)取72hpf的ab品系斑马鱼胚胎，在体视显微镜下挑选发育正常的胚胎，移入6孔培养板中，每孔30条。设置6个实验组。空白对照组给予ptu鱼水，模型组给予ptu鱼水，放入28℃培养箱中6h后，换成终浓度为80μm aa溶液。阳性对照组给予asp溶液，使终浓度为22.5μg/ml，放入28℃培养箱中6h后，换成终浓度为80μm aa溶液。给药组给予心可舒片醇提物10.625、21.25、42.5、85、170、340、680μg/ml系列浓度，放入28℃培养箱中6h后，换成终浓度为80μm aa溶液。
[0134]
(2)药物处理6h，aa造模1h后，取出，在暗处，用1mg/ml的邻联茴香胺染色液染色10min。养鱼水洗3次，将各组斑马鱼放在在显微镜下观察静脉血栓形成情况并取心脏部位拍照(放大倍数为80倍)。用image pro plus 5.1图像处理软件进行定量分析心脏红细胞染色面积及光密度。
[0135]
图6a为心可舒片抗血栓活性表型图，图6b、c、d分别为不同3天重复实验area柱形图，图6e、f、g分别为不同3天重复实验iod柱形图。如图所示，给予aa造模后，与空白对照组相比，斑马鱼心脏部位面积显著减小，iod显著减小。而心可舒片170-680μg/ml可以显著减轻aa导致的斑马鱼心脏部位血栓。但是经过方法学考察，本发明发现空白对照组染色面积rsd达19.36％、iod值rsd达16.63％，模型组染色面积rsd达14.40％，心可舒片处理组iod值rsd达11.30％，说明本实验的稳定性较促节间血管生成活性模型与降血脂模型较差(表6、7)，难以作为心可舒片质量控制的生物效应指标。
[0136]
表6心可舒片抗血栓活性实验日间精密度考察(area)
[0137][0138]
表7心可舒片抗血栓活性实验日间精密度考察(iod)
[0139][0140]
综上，如图2d所示，1/2ds(丹参减方阴性样品)处理组的isv为2070.51较ptk787处理组具有显著性差异，说明1/2ds阴性样品具有促血管生成活性，并且与合格样品促血管生成活性非常接近，仅由促血管生成的实验结果无法判定该样品为不合格样品；对样品检测结果容易出现误判。如图5c和表5所示，1/2ds阴性样品处理组的降脂率仅为28.97％，显著
低于合格样品降脂率(43.95％-55.20％)，可以判定该样品不合格。
[0141]
减方阴性样品1/2sz降脂率达31.64％，相对于模型组降血脂活性效果显著，仅利用降血脂活性对减方阴性样品1/2sz进行评价，易出现误判，而减方阴性样品1/2sz在实施例3中的血管长度仅达到1853.66μm，促血管生成活性不显著，可以判定该样品不合格。
[0142]
心可舒片具有多成分、多靶点、多途径的治疗特色，采用单一生物活性模型，难以全面评价其质量；本发明发现采用斑马鱼抗血栓模型评价心可舒片抗血栓活性检测方法稳定性差，难以作为心可舒片质量控制的生物效应指标；本发明通过大量实验首次发现斑马鱼节间血管生成障碍模型中斑马鱼节间血管长度达到2184μm以上，斑马鱼高血脂症模型中降脂率达到43％以上，同时达到所述两个指标数值可以判断心可舒片样品为合格样品，优选的，斑马鱼节间血管生成障碍模型中斑马鱼节间血管长度达到2180μm-2382μm，斑马鱼高血脂症模型中降脂率达到43％-56％。该方法能够有效减少对心可舒片样品生物活性检测出现误判的现象，实现了基于生物效应的心可舒片质量控制。