吖啶酯标记复合物和检测试剂盒的制作方法

1.本发明涉及免疫检测技术领域，特别是涉及一种吖啶酯标记复合物和检测试剂盒。


背景技术：

2.化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(clia)，是用化学发光试剂直接标记抗体或抗原的免疫分析方法。常用的化学发光物质有吖啶酯类化合物，这类化合物在发光试剂(naoh、h2o2)的作用下能迅速直接发光，在一秒内能完成闪烁发光且无须催化剂。
3.然而，在实际使用过程中，吖啶酯标记的抗原或抗体在免疫检测过程中的本底发光值偏大，信噪比较低，容易产生假阳性。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种吖啶酯标记复合物，该吖啶酯标记复合物能改善免疫检测过程中本底的发光值偏大而使得信噪比较低的问题。
5.一种吖啶酯标记复合物，所述吖啶酯标记复合物包括本体、标记于所述本体上的标记基团、和连接于所述本体上的修饰基团，所述本体为抗afp的抗体，所述标记基团为吖啶酯类基团，所述修饰基团所带电荷与所述本体所带电荷为同性电荷。
6.上述吖啶酯标记复合物的本体和修饰基团为同性电荷，增加了上述吖啶酯标记复合物所带电荷量。在使用时，与和上述吖啶酯标记复合物所带电荷为同性电荷的包被物配合进行免疫检测，由于上述吖啶酯标记复合物所带电荷与包被物所带电荷为同性电荷，它们之间的静电斥力使得上述吖啶酯标记复合物与包被物之间不容易产生非特异性吸附，从而使得本底的发光值较低，进而提升信噪比而使检测结果不容易产生假阳性。
7.在其中一个实施例中，所述标记基团来源于吖啶酯类化合物。
8.在其中一个实施例中，所述吖啶酯类化合物选自nsp-dmae-nhs、nsp-dmae-heg-nhs和nsp-sa-nhs中的至少一种。
9.在其中一个实施例中，所述修饰基团来源于修饰剂，所述修饰剂选自水溶性磺酸基-cy5-活性酯、4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐和磺基琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯中的至少一种。
10.一种吖啶酯标记复合物的制备方法，包括以下步骤：
11.将修饰剂、本体和活化后的吖啶酯类化合物混合后反应，制备吖啶酯标记复合物，其中，所述吖啶酯标记复合物包括所述本体、标记于所述本体上的标记基团和连接于所述本体上的修饰基团，所述本体为抗afp的抗体，所述标记基团来源于所述吖啶酯类化合物，所述修饰基团来源于所述修饰剂，所述修饰基团所带电荷与所述本体所带电荷为同性电荷。
12.在其中一个实施例中，包括以下步骤：
13.将所述修饰剂与所述本体混合，制备修饰后的本体；及
14.将所述修饰后的本体与所述活化后的吖啶酯类化合物反应，制备吖啶酯标记复合物。
15.一种检测试剂盒，包括上述的吖啶酯标记复合物。
16.在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括固相载体和包被在所述固相载体上的包被物，所述包被物能与待测物质及所述吖啶酯标记复合物经免疫结合形成包被物-待测物质-吖啶酯标记复合物的夹心结构，所述包被物所带电荷与所述复合物所带电荷为同性电荷。
17.在其中一个实施例中，所述固相载体选自磁颗粒、玻片、微孔滤膜、设置有加样孔的板材及化学发光板中的一种。
18.在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括校准品、稀释用缓冲剂、样本稀释剂、蛋白保护剂和发光底物中的至少一种。
附图说明
19.图1为一实施例的吖啶酯标记复合物减小非特异吸附的原理图。
具体实施方式
20.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
21.需要说明的是，当一个元件被表述“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件、或者其间可以存在一个或多个居中的元件。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
22.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
23.本技术一实施方式提供了一种吖啶酯标记复合物，该吖啶酯标记复合物包括本体、标记于本体上的标记基团和连接于本体上的修饰基团，标记基团为吖啶酯类基团，修饰基团所带电荷与本体所带电荷为同性电荷。
24.经本技术的研究发现，在利用双抗体夹心法或双抗原夹心法的免疫检测中，标记抗体或标记抗原容易与包被的抗原或包被的抗体因静电作用而产生非特异性吸附，从而使得阴性样本的发光值也较高，信噪比较低，容易产生假阳性而使得准确性较低。请参阅图1，而上述吖啶酯标记复合物的本体和修饰基团为同性电荷，增加了上述吖啶酯标记复合物所带电荷量。在使用时，与和上述吖啶酯标记复合物所带电荷为同性电荷的包被物配合进行免疫检测，由于上述吖啶酯标记复合物所带电荷与包被物所带电荷为同性电荷，它们之间的静电斥力使得上述吖啶酯标记复合物与包被物之间不容易产生非特异性吸附，从而使得阴性样本(本底)的发光值较低，信噪比较好，检测结果不容易产生假阳性。此外，经验证，经修饰基团修饰后的本体对吖啶酯的标记率几乎无影响，且上述吖啶酯复合物与传统未经修饰的吖啶酯标记复合物的稳定性相当。
inner salt”的简称；nsp-sa-nhs的结构式为可以理解的是，在其他实施例中，吖啶酯类化合物不限于上述，还可以是其他可以提供发光基团的吖啶酯类化合物。
28.具体地，修饰基团来源于修饰剂。在一些实施例中，上述吖啶酯标记复合物所带电荷为负电荷。此时的修饰剂提供带负电荷的修饰基团。可选地，修饰剂选自水溶性磺酸基-cy5-活性酯(简称cy5-nhs酯)、4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(简称sulfo-smcc)和磺基琥珀酰亚胺4-(n-马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(简称sulfo-smpb)中的至少一种。cy5-nhs酯、sulfo-smcc和sulfo-smpb提供的修饰基团带负电荷，可以增加了的复合物所带电荷的量，使得上述吖啶酯标记复合物与包被物之间的静电斥力增加而减少两者之间的非特异性吸附，从而提高信噪比，降低出现假阳性的概率。可以理解的是，在其他实施例中，上述吖啶酯标记复合物所带电荷还可以正电荷。此时的修饰剂提供带正电荷的修饰基团。对应地，与上述吖啶酯标记复合物配合使用的包被物所带电荷也为正电荷。此外，cy5-nhs具有水溶性，与目的蛋白偶联易操作。
29.在一些实施例中，本体为抗体。此时，上述吖啶酯标记复合物为标记抗体，可以利用双抗体夹心法检测待测样本中能与标记抗体特异性结合的抗原。
30.可选地，本体为抗afp的抗体。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，afp)是一个胚胎特异的血清α-球蛋白，是哺乳动物早期胚胎血清中一个重要的组分。在正常情况下，人体内的甲胎蛋白含量都很低，新生胎儿在一周岁后血清中的甲胎蛋白含量也会降低到正常水平。有研究表明，血清中甲胎蛋白含量》20ng/ml且数值有增加的，肝细胞可能就出现了癌变。因此，在检测afp时降低阴性样本的发光值，提高信噪比对提高检测的准确性显得尤为重要。可以理解的是，在其他实施例中，本体还可以为抗原。此时，上述吖啶酯标记复合物为标记抗原，可以利用双抗原夹心法检测待测样本中的能与标记抗原特异性结合的抗体。
31.在一些实施例中，在ph为超过本体的等电点的条件下，修饰基团所带电荷与本体所带电荷均为负电荷。在本实施方式中，在ph为超过6的条件下，修饰基团所带电荷与抗afp的抗体所带电荷均为负电荷。
32.基于上述，本技术一实施方式还提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒包括上述任一实施例的吖啶酯标记复合物。
33.在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括包被物，包被物能与待测物质及上述吖啶酯标记复合物经免疫结合形成包被物-待测物质-吖啶酯标记复合物的夹心结构，包被物所带电荷与吖啶酯标记复合物所带电荷为同性电荷。可以理解的是，包被物的设计之初是为了与标记复合物和待测物质所形成的复合物特异性结合而用于测定待测物质的量，其不单独与标记复合物结合，但在实际应用过程中，包被物会与标记复合物由于静电作用力而不可避免地产生非特异性吸附，因而使得阴性样本的发光值较大，信噪比较低。
34.在一些实施例中，包被物与上述吖啶酯标记复合物的本体为针对同一抗原的不同表位的抗体。
35.在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括固相载体。固相载体为包被物提供支撑。可选地，包被物预包被在固相载体上。可以理解的是，在其他实施例中，包被物及固相载体可以独立包装，在使用时，将包被物包被到固相载体上。
36.在一些实施例中，固相载体选自磁颗粒、玻片、微孔滤膜、设置有加样孔的板材及化学发光板中的一种。可以理解的是，在其他实施例中，固相载体不限于上述，还可以其他物质。
37.在一些实施例中，上述检测试剂盒还包括校准品、稀释用缓冲剂、样本稀释剂、封闭剂、蛋白保护剂和发光底物中的至少一种。
38.具体地，校准品用于对检测仪器、检测方法进行校准，以使检测系统检验的结果可靠有依据。稀释用缓冲剂用于稀释反应体系中的其他试剂。可以理解的是，校准品和稀释用缓冲液没有特别限制。样本稀释剂用于稀释样本。蛋白保护剂用于提供良好稳定反应环境，使抗原/抗体保持天然构象。可选地，蛋白保护剂包括胎牛血清、卵清蛋白、牛血清白蛋白和酪蛋白中的至少一种。封闭剂用于封闭未反应的位点。发光底物用于与吖啶酯类化合物反应而使得吖啶酯类化合物发光。可选地，发光底物为naoh和h2o2。
39.在一些实施例中，上述检测试剂盒包括磁珠工作液和标记物工作液。磁珠工作液包括包被有包被物的磁珠和磁珠稀释液；标记物工作液包括吖啶酯标记复合物和标记稀释液。
40.上述检测试剂盒包括上述吖啶酯标记复合物和包被物，通过包被物所带电荷与吖啶酯标记复合物所带电荷为同性电荷，使得反应体系中，吖啶酯标记复合物与包被物之间由于静电斥力而非特异性吸附减少，大大减少了阴性样本的发光值，提升了信噪比，提高了试剂的灵敏度。
41.此外，本技术一实施方式还提供了一种上述吖啶酯标记复合物的制备方法，该制备方法包括以下步骤：将修饰剂、本体和活化后的吖啶酯类化合物混合反应，制备吖啶酯标记复合物。
42.具体地，修饰剂为上述吖啶酯标记复合物提供修饰基团；吖啶酯类化合物为上述吖啶酯标记复合提供标记基团。修饰剂、本体和吖啶酯类化合物如上文所述，此处不再赘述。
43.在一些实施例中，吖啶酯标记复合物的制备方法包括步骤s110和步骤s120。
44.步骤s110：将修饰剂与本体混合，制备修饰后的本体。
45.具体地，制备修饰后的本体的路线为：
[0046][0047]
在一些实施例中，将水溶性磺酸基-cy5-活性酯溶解到碳酸盐缓冲溶液中，待完全溶解后与本体混合，混匀后避光反应一段时间，得到含有修饰后的本体的混合物液。
[0048]
在其中一个实施例中，采用akta蛋白纯化仪纯化修饰后的本体。可选地，纯化柱选自sepharose cl 4b、superdex200 increase10/300gl和superosetm 6 increase 10/300gl中的一种。可以理解的是，在其他实施例中，纯化修饰后的本体的方式不限于上述，还可以采用其他形式。
[0049]
步骤s120：将修饰后的本体与活化后的吖啶酯类化合物反应，制备吖啶酯标记复合物。
[0050]
具体地，修饰后的本体与活化后的吖啶酯类化合物反应，制备吖啶酯标记复合物的路线为：
smpb均购自赛默飞(thermo scientific)；用于制备吖啶酯标记复合物的抗afp抗体为购自菲鹏生物的抗afp的单克隆抗体(afp-ab 02)，包被在磁珠上的抗afp抗体为购自菲鹏生物的抗afp的单克隆抗体(afp-ab 04)。
[0058]
实施例1
[0059]
制备吖啶酯标记复合物
[0060]
(1)制备修饰后的afp抗体(afp-cy5-nhs酯)
[0061]
称取760ug的水溶性磺酸基-cy5-活性酯溶解到10μl的ph为10.0的碳酸盐缓冲溶液中，混匀待其完全溶解。然后再取1mg的抗afp抗体溶解于1ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph为10.0)中，其终浓度约为6.6mg/ml。将上述溶解的cy5-nhs酯加入到抗afp抗体中，然后混匀后于25℃避光反应1个小时，得到含有修饰后的抗afp抗体(afp-cy5-nhs酯)的混合物。
[0062]
(2)纯化复合物p
[0063]
将上述得到的含有修饰后的抗afp抗体的混合物通过ge公司的akta蛋白纯化仪，选用易于纯化分离大蛋白和蛋白复合物的预装柱superosetm 6 increase 10/300gl，100mm pbs(ph8.0)平衡预装柱，纯化分离得到高浓度的修饰后的抗afp抗体。并通过sds-page电泳实验，确定收集的目的产物为修饰后的抗afp抗体。然后通过nanodrop紫外分光光度仪对修饰后的抗afp抗体中的抗afp抗体进行定量。
[0064]
(3)制备吖啶酯标记复合物(afp-cy5-ae)
[0065]
取500μl修饰后的抗afp抗体(其中抗afp抗体的浓度为0.5mg/ml)，向其中加入10μl溶解于dmso溶剂的10mmol/l吖啶酯(已活化)，于25℃下避光反应1.5h，用5ml 7kd截留分子量的脱盐柱(thermo fish公司)以150mm pbs(ph 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯，得到吖啶酯标记复合物。
[0066]
实施例2
[0067]
本实施的吖啶酯标记复合物的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，本实施例的吖啶酯标记复合物未经cy5-nhs酯修饰。本实施例的吖啶酯标记复合物的制备步骤包括：
[0068]
取10μl的碳酸盐缓冲液加入到浓度为0.5mg/ml的抗afp抗体中，25℃反应1.5h。将上述得到的复合物通过ge公司的akta蛋白纯化仪，选用易于纯化分离大蛋白和蛋白复合物的预装柱superose tm 6increase 10/300gl，100mm pbs(ph8.0)平衡预装柱，分离得到抗afp抗体。然后取500μl分离得到的上述抗afp抗体，向其中加入10μl溶解于dmso溶剂的10mmol/l吖啶酯，于25℃下避光反应1.5h,用5ml 7kd截留分子量的脱盐柱(thermo fish公司)以150mm pbs(ph 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍,除去游离的吖啶酯，得到吖啶酯标记复合物(afp-ae)。
[0069]
实施例3
[0070]
本实施的吖啶酯标记复合物的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，本实施例的修饰剂更换为sulfo-smcc，即本实施例制备的吖啶酯标记复合物是经sulfo-smcc修饰的吖啶酯标记的抗afp抗体。本实施例的吖啶酯标记复合物的制备方法包括以下步骤：
[0071]
(1)制备修饰抗afp抗体
[0072]
称取436μg的sulfo-smcc溶解到10μl的ph为10.0的碳酸盐缓冲溶液中，混匀待其完全溶解。然后再取1mg的抗afp抗体溶解于1ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph为10.0)中，其终
浓度约为6.6mg/ml。将上述溶解的sulfo-smcc加入到抗afp抗体中，然后混匀后于25℃避光反应1个小时，得到含有修饰后的抗afp抗体的混合物。
[0073]
(2)纯化修饰后的抗afp抗体
[0074]
将上述得到的含有修饰后的抗afp抗体的混合物通过ge公司的akta蛋白纯化仪，选用易于纯化分离大蛋白和蛋白复合物的预装柱superosetm 6 increase 10/300gl，100mm pbs(ph8.0)平衡预装柱，纯化分离得到高浓度的修饰后的抗afp抗体。并通过sds-page电泳实验，确定收集的目的产物为修饰后的抗afp抗体。然后通过nanodrop紫外分光光度仪对修饰后的抗afp抗体中的抗afp抗体进行定量。
[0075]
(3)制备吖啶酯标记复合物
[0076]
取500μl修饰后的抗afp抗体(其中抗afp抗体的浓度为0.5mg/ml)，向其中加入10ul溶解于dmso溶剂的10mmol/l吖啶酯，于25℃下避光反应1.5h，用5ml 7kd截留分子量的脱盐柱(thermo fish公司)以150mm pbs(ph 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯，得到吖啶酯标记复合物。
[0077]
实施例4
[0078]
本实施的吖啶酯标记复合物的制备方法大致与实施例1相同，其不同在于，本实施例的修饰剂更换为sulfo-smpb，即本实施例制备的吖啶酯标记复合物是经sulfo-smpb修饰的吖啶酯标记的抗afp抗体。本实施例的吖啶酯标记复合物的制备方法包括以下步骤：
[0079]
(1)制备修饰抗afp抗体
[0080]
称取436μg的sulfo-smpb溶解到10μl的ph为10.0的碳酸盐缓冲溶液中，混匀待其完全溶解。然后再取1mg的抗afp抗体溶解于1ml的碳酸盐缓冲液(50mm，ph为10.0)中，其终浓度约为6.6mg/ml。将上述溶解的sulfo-smpb加入到抗afp抗体中，然后混匀后于25℃避光反应1个小时，得到含有修饰后的抗afp抗体的混合物。
[0081]
(2)纯化修饰后的抗afp抗体
[0082]
将上述得到的含有修饰后的抗afp抗体的混合物通过ge公司的akta蛋白纯化仪，选用易于纯化分离大蛋白和蛋白复合物的预装柱superosetm 6 increase 10/300gl，100mm pbs(ph8.0)平衡预装柱，纯化分离得到高浓度的修饰后的抗afp抗体。并通过sds-page电泳实验，确定收集的目的产物为修饰后的抗afp抗体。然后通过nanodrop紫外分光光度仪对修饰后的抗afp抗体中的抗afp抗体进行定量。
[0083]
(3)制备吖啶酯标记复合物
[0084]
取500μl修饰后的抗afp抗体(其中抗afp抗体的浓度为0.5mg/ml)，向其中加入10ul溶解于dmso溶剂的10mmol/l吖啶酯，于25℃下避光反应1.5h，用5ml 7kd截留分子量的脱盐柱(thermo fish公司)以150mm pbs(ph 7.4)缓冲液作为换液缓冲液，过柱3遍，除去游离的吖啶酯，得到吖啶酯标记复合物。
[0085]
性能测试
[0086]
(1)对吖啶酯标记率的影响测试
[0087]
分别取实施例1～实施例4中的吖啶酯标记复合物各取25μg至总体积为50μl的150mm pbs缓冲液中，通过液相色谱对这种复合物上的吖啶酯标记率进行计算。其中，实施例1和2的结果如表1所示。
[0088]
表1
[0089][0090][0091]
从表1中可以看出，cy5-nhs酯对抗afp抗体的修饰不会影响抗afp抗体和吖啶酯的反应，经cy5-nhs酯修饰的抗afp抗体与未经修饰的抗afp抗体相比，其吖啶酯的标记率相差不大。
[0092]
(2)检测效果测试
[0093]
将实施例1、实施例2、实施例3和实施例4中得到的吖啶酯标记复合物分别应用于afp的化学发光免疫分析检测。具体步骤包括：
[0094]
取6组1000pg/ml的afp样本中，分别加入50μg抗afp单克隆抗体(afp-ab 04)包被的磁珠，再分别加入实施例1、实施例2、实施例3和实施例4制备的10pmol吖啶酯标记复合物，37℃孵育反应10min后，磁分离清洗3次，各组分别先后加入100μlhno
3-h2o2溶液和100μl的氢氧化钠溶液，用iflash3000型化学发光免疫分析仪(亚辉龙生物)测量发光值，平行进行3份测量，取平均值。结果见表2。
[0095]
表2
[0096][0097][0098]
表1中，“ch”指tris盐溶液；样本1～样本8为人血清阴性样本。由表2可知，采用cy5-nhs酯修饰后的吖啶酯标记的抗afp抗体(即实施例1制备的吖啶酯标记复合物)的检测结果中，其ch和阴性样本的发光值与不经修饰的吖啶酯标记的抗afp抗体(即实施例2的吖啶酯标记复合物)相比有了明显的下降，大大降低了本底，同时其中值样本(样本9和样本10)和高值样本(样本11)的发光值并未有明显的下降，其信噪比提高了约4倍。
[0099]
(3)稳定性测试
[0100]
取等量的实施例1和实施例2制得的吖啶酯标记复合物分别于25℃和低温(4℃)
下，并测试放置后的检测稳定性，其结果如表3所示。
[0101]
表3
[0102][0103]
在表3中，对照组为放置之前的组别；“ch”为tris盐溶液组，样本1为胎牛血清，均作为阴性组别；样本2为中值样本；样本3为高值样本。由表3可知，实施例1和实施例2制得的吖啶酯标记复合物在常温(25℃)和低温(4℃)下的稳定性相当，相对于对照组检测值下降并不明显。
[0104]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0105]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。