一种用于流式细胞仪的显微成像系统及成像方法

1.本发明涉及光学成像技术领域，尤其涉及一种用于流式细胞仪的显微成像系统及成像方法。


背景技术：

2.流式细胞仪是一种广泛应用于细胞计数、生物标志物检测和细胞分选的强大技术。传统的流式细胞仪由三个系统组成，即液流系统、光学系统和电子系统。液流系统由鞘液(通常是缓冲盐水溶液)组成，通过加压将样品输送到流动室并通过激光拦截或检测点。光学系统一般利用激光作为光源产生散射光和荧光信号，由光电二极管或光电倍增管等检测器进行信号读取。电子系统利用计算机将这些信号转换成电子信号，由计算机进行处理并写入标准化格式数据文件，以用于后续分析。
3.传统流式细胞术只能提供纯定量测量，无法得到样本的形态信息。然而，图像对样本的形态分析是非常重要的，比如对于细胞样品而言，图像可以有效地传达有关细胞的某些重要信息，例如细胞大小、形状、形态以及细胞内标记生物分子的分布或位置。此外，通过分析样本的图像信息，也可以用来消除传统流式细胞术可能产生的一些错误结果，比如可以很容易区分出细胞、碎片等。因此，为了克服无法得到样本的图像信息这一问题，通过将流式细胞仪和显微镜相结合开发出了具有成像功能的成像流式细胞仪。另一方面，得益于微加工技术的发展，微流控芯片的制备技术已日益成熟。目前的微流控芯片管道的尺寸可以达到几微米到几百微米，足够完成生物或化学反应。近年来的研究重点是将基于微流控芯片的流式细胞仪与传统光学显微成像系统相结合，根据形态信息进行分类，开发出高通量，高速的新型成像流式细胞仪。
4.然而，对于传统的光学显微成像系统，由于物镜景深非常小，通常只能对一个纵向(z向)很薄的面进行清晰成像，如果我们想要对厚样品进行成像，就不得不对该样品进行逐层扫描，导致成像速度特别慢，难以满足对流动样品检测的需要。例如在流式细胞检测系统中，样品可能位于几十到几百微米厚的流道内的任何位置，大大超出了传统显微镜的成像范围。为了能够获得较准确的图像信息，不得不进一步缩小微流控管道的厚度，限制了样品的通量，使得样品检测的准确率和速度大大降低。因此，开发一种可以提高样品检测的准确率和速度的技术是极为迫切的。
5.传统的光学显微成像系统的成像深度主要受限于物镜的景深，因此通过延长景深的方法可以大幅提高成像深度。目前延长景深的方法主要可分为三类：一、利用空间光调制器、可变形镜和变焦透镜(如声光可变焦透镜(tag lens)、电动可调焦透镜(etl))等实现快速变焦。然而，由于低的探测占空比，该方法得到的是信号的平均强度投影结果，因此图像的信噪比非常低，难以直接使用；二、通过加工的微透镜阵列进行光场成像，然后对得到的光场图像进行重建以获取样品的三维信息。该方法由于需要复杂的重建过程以及固有的低分辨率等问题使得其并不适合用于成像流式细胞仪中；三、通过对物镜的光瞳函数进行调制，使成像系统的点扩散函数在一定范围内沿着z轴保持不变或者变化缓慢，即系统的点扩
散函数对样品的离焦变化不敏感，从而延长景深。目前已经有很多种不同的位相掩模被提出，按照对称性划分主要可以将其分为圆对称的和非圆对称的两种。例如，立方位相掩模(三次位相掩模)是非圆对称位相掩模的典型代表，因其可以产生艾里光片而被广泛应用于光片显微镜中。由于加载的是非圆对称的相位掩模，它的点扩散函数有非常多的非对称旁瓣，使得得到的原始图像不可用。另外，由于该方法的斯特列尔比(strehlratio)非常低，导致图像的对比度非常差。上述问题使得当其被用于宽场成像时，必须进行去卷积处理才能获得可用的图像，极大的限制了其在需要实时成像或进行细胞、粒子分选的流式成像细胞仪的领域的应用。目前，现有技术未见利用圆对称的位相掩模进行细胞、粒子分选的流式成像细胞仪的报道，仍需研究人员进一步地研究和探索。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种延长景深的显微成像系统及其成像方法。该显微成像系统明显延长了显微成像模块的景深，提高了成像流式细胞仪对样品的检测通量和准确率。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种延长景深的显微成像系统，包括物镜、套筒透镜和位相掩模；
9.所述位相掩模为圆对称位相掩模。
10.一些实施方案中，所述显微成像系统结构如图1-c所示，使用加工的位相掩模(即非球面透镜)来实现的，所述显微成像系统从物侧到像侧依次包括物镜、位相掩模和套筒透镜；
11.所述位相掩模独立放置在所述物镜和套筒透镜之间；所述位相掩模由如下公式表示：
[0012][0013]
其中，ρ代表在极坐标下光瞳平面的半径，ρ
max
代表物镜后焦平面的最大通光孔径的半径，k代表波数，f1表示物镜的焦距，δ是设计参数，控制着景深的大小，c是常数。
[0014]
一些实施方案中，所述显微成像系统结构如图1-b所示，使用空间光调制器、变焦透镜等元件作为位相掩模工具来实现的，所述显微成像系统从物侧到像侧依次包括：
[0015]
物镜，套筒透镜，透镜l1，空间光调制器，加载于所述空间光调制器平面上的位相掩模，以及透镜l2；
[0016]
所述位相掩模加载于所述光瞳面上，所述位相掩模由如下公式表示：
[0017][0018]
其中，k代表波数，f1表示物镜的焦距，f2表示套筒透镜的焦距，f3表示延伸透镜l1的焦距；代表在极坐标下光瞳平面(空间光调制器平面)的半径，ρ
3max
代表光瞳面的最大通光孔径的半径；δ是设计参数，控制着景深的大小，c2是常数。
[0019]
本发明中，所述位相掩模的公式具有通用性，并不局限于某一特定的物镜。
[0020]
本发明所述的位相掩模公式中，设计参数δ为0～200μm的选择可根据实际需要进行改变。一些实施方案中，δ优选为65～130μm，具体可为65μm或130μm。
[0021]
一些实施方案中，所述物镜、套筒透镜可自行组装，也可直接购买商用物镜和套筒透镜，对于具体的焦距和透镜个数本发明不作限定，本领域可根据需要选择适宜的。
[0022]
本发明还提供一种高通量成像流式细胞仪，包括所述的显微成像系统和流式细胞仪。
[0023]
本发明还提供了所述的显微成像系统在流式细胞检测成像中的应用。
[0024]
本发明还提供一种基于流式细胞仪的细胞成像方法，使用本发明以上所述的显微成像系统和流式细胞仪对细胞进行成像，或使用所述的高通量成像流式细胞仪对细胞进行成像。
[0025]
本发明提供的显微成像系统包括物镜、套筒透镜和位相掩模；所述位相掩模为圆对称位相掩模。该成像系统采用圆对称位相掩模具有高的斯特列尔比、无需图像后处理的特点，能够延长显微成像系统的景深，扩展现有显微成像系统纵向的成像范围，将其用于成像流式细胞仪时，可以提高检测样品的通量，使得样品检测的准确率和速度大幅提高。
附图说明
[0026]
图1示本发明基于景深延长的显微成像系统的实现方式；(a)、传统的显微成像系统；(b)、基于空间光调制器、变焦透镜等元件的景深延长成像系统1；(c)、基于加工的位相掩模的景深延长成像系统2；
[0027]
图2示传统显微成像系统和本发明显微成像系统的成像深度对比；a、传统显微成像系统在z方向的成像深度；b、本发明延长景深显微成像系统在z方向的成像深度；
[0028]
图3示传统显微成像系统和延长景深显微成像系统的理论点扩散函数，a、延长景深显微成像系统在xz方向的点扩散函数；b、传统显微成像系统在xz方向的点扩散函数。
具体实施方式
[0029]
本发明提供了一种用于流式细胞仪的显微成像系统及成像方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本
文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0030]
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
[0031]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0032]
实施例1
[0033]
本发明基于景深延长的显微成像系统的关键元件在于位相掩模的设计和使用，由于本发明自主设计的圆对称位相掩模具有高的斯特列尔比、无需图像后处理的特点，适用于成像流式细胞仪中，这里将其作为范例进行阐述。
[0034]
图1(b)所示的显微成像系统，从物侧到像侧依次包括：物镜，套筒透镜，透镜l1，加载于所述光瞳面上的位相掩模，以及透镜l2；在光瞳面(即空间光调制器平面)加载的位相掩模公式如下所示：
[0035][0036]
其中，k代表波数，f1表示物镜的焦距，f2表示套筒透镜的焦距，f3表示延伸透镜l1的焦距；代表在极坐标下光瞳平面(空间光调制器平面)的半径，ρ
3max
代表光瞳面的最大通光孔径的半径；δ是设计参数，控制着景深的大小，c2是常数。
[0037]
对图1(c)所示的系统，从物侧到像侧依次包括物镜、位相掩模和套筒透镜；所述位相掩模独立设置在所述物镜和套筒透镜之间，在物镜后焦平面(即位相掩模平面)加载如下公式：
[0038][0039]
这里ρ代表在极坐标下光瞳平面的半径，ρ
max
代表物镜后焦平面的最大通光孔径的半径，k代表波数，f1表示物镜的焦距，δ是设计参数，控制着景深的大小，c是常数。
[0040]
图2对比了传统显微成像系统(图1-a)和延长景深显微成像系统(图1-b、c所示的系统)的z向成像深度。由于传统显微成像系统的景深(dof)非常小，因此可以清晰成像的样品的范围也很小(图2-a)。本发明基于景深延长的显微系统的成像深度(edof)被大大提高，可以清晰成像的样品的范围远大于未延长景深的传统显微系统，如图2-b所示。
[0041]
以4xna0.2的标准nikon物镜为例，模拟计算了传统显微成像系统和延长景深显微成像系统在x、z平面的点扩散函数，其中设计参数δ取130μm，结果如图3所示。通过对比传统显微成像系统(图1-a)和本发明延长景深显微成像系统(图1-b、c所示的系统)的点扩散函数可以清楚的发现，本发明提出的延长景深成像系统可以将成像深度至少提高到5倍以上。
[0042]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为
本发明的保护范围。