一种基于FMs和PMA荧光-比色双模生物传感器的构建和应用

一种基于fms和pma荧光-比色双模生物传感器的构建和应用
技术领域
1.本发明涉及材料技术领域，涉及一种利用荧光微球(fms)的光学性能，磷钼杂多酸(pma) 还原生成的磷钼蓝具有的宽的紫外吸收能力和荧光猝灭能力，具体涉及一种基于fms和pma 荧光-比色双模生物传感器的构建和应用。


背景技术：

2.荧光编码微球(fluorescent addressable microsphere，fms)是指将荧光物质通过物理法(吸附法、包埋法、自组装法)或化学法(接枝法、共聚法)吸附或包埋到载体粒子表面或内部而形成的直径在纳米至微米级(0.01-10μm)范围内，受激发光源激发能发出荧光的固相球体。它是一种新型的功能性微球，具有比表面积大、吸附性强、凝集作用大和表面反应能力强等特性，由于其同时具有稳定的形态结构及稳定而高效的发光效率，使得其在生物医学检测中的应用非常广泛，涉及的领域包括生物分析、疾病诊断、免疫分析等。
3.基于fms的生物传感方法属于荧光传感方法，是一种在生物、化学和医学领域被广泛应用的分析检测工具。此类生物传感方法能够实现对特定目标分析物的快速检测，灵敏度可达 10
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数量级，近年来在痕量、微量分析等领域的应用非常广泛。由于fms能够与许多试剂和生物分子相互作用，发生荧光猝灭或荧光增强，因此荧光强度常被用作荧光传感方法的检测信号报告参数。导致荧光强度变化的因素很多，因此能够影响fms荧光性质的物质都可以作为目标物，以此为依据建立基于fms的分析方法。
4.近年来，国内外学者利用杂多酸作为显色剂测定抗坏血酸的方法进行了很多研究，其中许多方法需要进行长时间的水浴加热，这增加了操作的复杂性。重要的是，许多糖类和具有弱还原性的杂质在加热条件下可能会对检测结果产生干扰，从而降低了方法的选择性。因此，使用常温下即可被抗坏血酸(aa)快速还原的磷钼杂多酸(pma)是一种很有意义的检测策略。同时，pma被抗坏血酸还原后生成的磷钼蓝具有较宽的吸光范围，能够吸收fms位于 620nm处的荧光发射，即通过内滤作用使fms发生荧光猝灭，这使得fms在作为报告信号时可以免于复杂的表面修饰过程。
5.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，alp)是一种具有催化作用的蛋白质，能够催化蛋白质、核酸和小分子发生去磷酸化，广泛存在于人体的肝脏、骨骼、肾脏和胎盘等组织中，它不仅在调节各种细胞内代谢中起着至关重要的作用，而且是许多疾病的重要生物标志。以往的研究证实肝功能障碍、骨损伤等都与alp活性异常密切相关。alp的检测对骨骼疾病的诊断非常重要，并且可以治疗性地应用于缺乏该酶的低磷酸血症患者，在血管钙化中的作用和作为败血症相关的急性肾脏损伤的治疗方法也是近些年来的研究热点。因此，开发检测alp 活性的有效方法对相关疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
6.目前为止，报道的alp检测方法非常广泛，包括比色法、荧光法和电化学法等，其中 alp催化水解无色的对硝基苯基磷酸盐(npp)产生黄色的对硝基酚是监测alp活性常用的方法之一。该方法操作简单，效率高，已被临床应用为标准方法，但是却具有选择性差，线性范围有限等缺点，这严重影响了其在实际中的应用。更糟糕的是，对硝基苯基磷酸盐底物对光
敏感，在没有alp的情况下也可以水解，这可能导致假阳性结果。因此，开发实用性强、可靠性高的alp活性检测新策略尚需进一步努力。
7.随着智能手机的越来越普及，由于其便携性、低成本、易操作等优点，经常被应用于快速现场检测分析。据文献报道，许多用于医疗诊断的智能手机传感方法已经被开发出来，例如使用智能手机作为传感方法读取纸基信号的血型传感方法和检测汗水和唾液的ph值变化的比色传感方法。基于智能手机的荧光传感方法也被成功用于检测液体样本中的特定核酸序列。智能手机捕捉到的颜色信息可以用rgb颜色识别软件进行信号读取。一些基于智能手机的算法软件也被开发出来，能够直接量化智能手机界面中的颜色信息。有研究证明，基于智能手机的比色检测的准确度可以与台式光谱仪相媲美。
8.因此，基于fms和pma构建的荧光-比色双模生物传感器能够实现对alp的快速准确检测。室温下，pma可被alp与aap反应生成的aa还原生成磷钼蓝，磷钼蓝通过内滤效应猝灭fms的荧光，构建一种荧光-比色双模生物传感器实现对alp的灵敏检测。此外利用智能手机读取比色信号的便捷传感系统实现对生物标志物alp的即时检测和实时监测。


技术实现要素：

9.本发明为克服现有alp检测技术存在的操作复杂、准确性差，灵敏度低以及易出现假阳性等问题，提出了一种基于fms和pma的荧光-比色双模生物传感器的构建方法及其应用，实现对alp的灵敏检测。此外利用智能手机读取比色信号的便捷传感系统，读取反应后纸片上的光学信号，通过rgb软件进行数据分析，实现对alp的即时检测和实时监测，具有便携性、低成本、易操作等优点，可应用于快速现场检测分析。
10.本发明的技术的制备方法如下：
11.一种基于fms和pma的荧光-比色双模生物传感器的构建和应用。所述的荧光-比色双模生物传感方法包括fms，pma和aap等，其中fms具有好的光学性能，提供荧光信号，直径约为200nm；pma还原后生成的磷钼蓝具有较宽的吸光范围，并通过内滤作用使fms 发生荧光猝灭，输出了荧光-比色双模信号，实现在缓冲溶液体系中对alp的高灵敏检测。fms和pma荧光-比色双模生物传感器对alp的比色和荧光检测限分别为0.068u/l和0.11 u/l。此外利用智能手机读取比色信号的便捷传感系统实现对生物标志物alp的即时检测，具有良好的准确性，检测限为0.4u/l，对于实现日常生活中alp的即时检测和实时监测很有意义。
12.所述基于fms和pma的荧光-比色双模生物传感器的制备及应用：
13.(1)用cutsmart缓冲液配制含aap和alp(0-150u/l)的溶液2ml，混匀后25℃反应15min。
14.(2)25℃下，向步骤(1)反应后溶液中加入pma和fms。
15.(3)步骤(2)反应溶液反应5min，在紫外吸收扫描范围为500-900nm，检测样品紫外吸收强度。
16.(4)步骤(2)溶液反应180min后，在荧光发射波长λmax＝625nm(激发光波长λex ＝365nm)，发射峰范围为600-675nm条件下检测样品荧光强度。
17.所述步骤(1)中cutsmart缓冲液为50mm ch3cook+30mm tris-ch3cooh，10mmch3coomg+100μg/ml牛血清白蛋白ph＝7.9；aap溶液浓度为5mm；alp的反应浓度溶液为0-150u/l。
18.所述步骤(2)中pma的浓度为2mm，fms的浓度为5μg/ml。
19.所述便携式纸基比色传感系统的构建及应用：
20.(1)圆形吸收垫放入超纯水配制的pma溶液浸泡5s，拿出后室温放置待其自然晾干，获得便携式纸基。
21.(2)用cutsmart缓冲液配制含aap和alp的溶液2ml，混匀后反应15min，反应后的溶液滴加到步骤(1)制备的纸基上。
22.(3)20min后将经步骤(2)处理的纸基放置于室内白色日光灯下，将智能手机放置于纸基正上方进行拍照，再用可读取rgb数值的智能手机app对拍摄的照片进行数值读出。
23.所述步骤(1)中pma溶液浓度为2mm；fms的浓度为5μg/ml。
24.所述步骤(2)中aap溶液浓度为5mm；alp的反应浓度溶液为0-80u/l；圆形吸收垫直径为2cm；滴加到晾干纸基上溶液取10μl。
25.本发明具有以下有益效果：
26.1、本发明中fms具有优异的光学性能，能够与许多试剂和生物分子相互作用，发生荧光猝灭或荧光增强。pma能被aa快速还原生成的磷钼蓝具有较宽的吸光范围可提供比色信号，可通过内滤作用使fms发生荧光猝灭，使得fms在作为荧光信号时可以免于复杂的表面修饰过程。该方法具有操作简便，检测快速等优点。基于fms和pma构建的使得基于fms 和pma构建的生物传感器能够提供比色和荧光双重信号，提高了检测的准确性和灵敏度。
27.2、利用智能手机读取比色信号的便捷传感系统实现对生物标志物alp的即时检测，具有良好的准确性。该传感系统能够满足临床对alp活性检测的需求，对于实现日常生活中alp 的即时检测和实时监测很有意义。
28.3、相对于传统的使用fms生物传感器的构建，本方法所设计的生物传感器能够抵抗血浆中同时存在的氨基酸(leu、phe、tyr和cys)、其他分子(ua和nadh)和酶(gox和haase)等物质的干扰，解决了传统方法假阳性的问题，提高了检测的准确度。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1为实施例1所制备的双模传感器，以及纸基-智能手机比色生物传感系统检测alp 的原理图。
31.图2为实施例1所制备的双模传感器对alp的响应光谱图。
32.图3为实施例1所制备的双模传感器实验条件优化——优化aap的浓度。
33.图4为实施例1所制备的双模传感器实验条件优化——优化pma的浓度和显色反应时间。
34.图5为实施例1所制备的双模传感器对alp的响应曲线——pma对alp显色反应。
35.图6为实施例1所制备的双模传感器对alp的响应曲线——fms荧光猝灭反应。
36.图7为实施例1所制备的双模生物传感器的选择性考察。
37.图8为实施例1所制备的纸基-比色传感系统对alp的响应曲线。
38.图9为实施例1pma溶液的稳定性探究pma水溶液的稳定性
具体实施方式
39.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.实施例1
41.一种基于fms和pma的荧光-比色双模生物传感器的制备方法，并提出一种纸基-智能手机比色生物传感系统实现对alp的快速定量，其制备原理如图1所示：室温下将配置的 aap和alp溶液分别加入cutsmart缓冲液溶液，孵育15min。反应后溶液中加入pma和 fms得到荧光-比色双模生物传感器。实验步骤如下：
42.所述的比色-荧光双模生物传感器包括pma，fms以及aap等。
43.在本发明中，比色反应显色剂pma，荧光反应底物fms以及aap等材料通过购买获得。
44.fms和pma荧光-比色双模生物传感器的制备如下：
45.用cutsmart缓冲液配制含5mmaap和10u/l的alp的溶液混匀后25℃反应15min，向反应后的溶液中加入2mm pma和5μg/ml fms，25℃反应5min后，在紫外吸收扫描范围为500-900nm，检测样品紫外吸收强度。反应180min后，在荧光发射波长λmax＝625 nm(激发光波长λex＝365nm)，发射峰范围为600-675nm条件下检测样品荧光强度见图2。
46.便携式纸基比色传感方法的构建如下：
47.用超纯水配制2mm pma溶液，将直径为2cm的圆形吸收垫放入pma溶液中浸泡5s，拿出后室温放置30min待其自然晾干，用cutsmart缓冲液配制含5mmaap和一定浓度alp 的溶液2ml，混匀后反应15min，取10μl反应后的溶液滴加到晾干后的纸基上，20min后将纸基放置于室内白色日光灯下，将智能手机放置于纸基正上方30cm高度处进行拍照，再用可读取rgb数值的智能手机app对拍摄的照片进行数值读出。
48.由图2所示，可知溶液中的fms、单独存在的alp和aap均不会使pma显蓝色，只有当alp和aap共同存在生成aa才能使pma显色。只有当alp和aap共同存在生成aa，将pma还原成磷钼蓝后，fms的荧光才会发生明显的猝灭。说明，证实了该传感器检测目标物alp的可行性。由图3和图4可知，紫外吸收信号在aap浓度大于5mm后上升趋势缓慢，荧光信号在aap浓度大于5mm后也基本平稳，2mm的pma溶液的反应平衡时间小于1mm的pma溶液反应平衡时间，3h后微球荧光趋于稳定。由图5和图6可知，当外加alp的浓度从0.2-35u/l,比色信号越来越强，荧光信号越来越弱，说明该传感器可用于检测alp。由图7可知，当存在目标物alp时，可以观察的较明显的比色信号和荧光信号，而对于其他物质几乎不响应。结果验证了该双模传感器对alp具有好的选择性，可用于alp 活性的特异性测定。如图8所示，采用纸基-比色传感系统对不同浓度的alp(0-80u/l)进行测定，纸基上磷钼蓝颜色的深浅与alp的活性浓度大小相关，可通过纸基-智能手机比色生物传感系统实现对alp的快速定量。如图9所示，将配好的pma放置1-120天，它在纸基上输出的比色信号基本稳定。结果说明pma溶液能够长期保持性质的稳定。
49.实施效果例
50.本技术实施例1基于fms和pma的荧光-比色双模生物传感器在检测人血清中alp的应用，步骤如下：
51.用cutsmart缓冲液配制1％的胎牛血清溶液。用1％的胎牛血清溶液配制含5mm aap 和不同浓度的alp(0、5、10、20u/l)的溶液2ml，混匀后反应15min，将反应后的溶液加入2mm pma和5μg/ml fms，反应5min后，用紫外可见分光光度计记录产物的紫外吸收光谱，反应180min后用荧光分光光度计记录产物的荧光发射光谱。
52.用超纯水配制2mm pma溶液，将直径为2cm的圆形吸收垫放入pma溶液中浸泡5s，拿出后室温放置30min待其自然晾干，用cutsmart缓冲液配制含5mmaap和不同浓度的 alp(0-80u/l)的溶液2ml，混匀后反应15min，取10μl反应后的溶液滴加到晾干后的纸基上，20min后将纸基放置于室内白色日光灯下，将智能手机放置于纸基正上方30cm高度处进行拍照，再用可读取rgb数值的智能手机app对拍摄的照片进行数值读出。用1％的胎牛血清溶液(cutsmart缓冲液)配制含5mmaap和不同浓度的alp(0、5、10、20u/l) 的溶液，按照上述步骤在纸基上进行血清样本中alp的检测。
53.由表1可知，采用加标回收法检测5％胎牛血清中alp的活性，考虑到正常人血清中alp 活性的正常水平在46-190u/l范围内，本方法的灵敏度能够检测到稀释20倍后的血清中的 alp活性。具有令人满意的回收率。因此，这些结果验证了该传感策略在复杂生物环境中是可行的，有潜力用于临床alp活性监测。
54.由表2可知，用加标回收法检测5％胎牛血清中alp活性具有令人满意的回收率，表明基于纸片-手机的比色生物传感系统在血清样本中是可行的，有潜力用于临床alp活性监测。
55.表1 alp双模传感的血清样本分析
[0056][0057][0058][0059]
表2便携纸基上胎牛血清中alp的检测
[0060][0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。