一种atp法快速检测航油微生物污染的试剂和检测方法
技术领域
1.本发明涉及微生物检测领域，尤其是一种atp法快速检测航油微生物污染的试剂和检测方法。
背景技术：
2.航油的微生物污染会严重威胁飞行安全，其主要影响有以下三种：1、堵塞；大量的微生物、微生物分泌物及其腐蚀产物凝结成粘稠的团状或絮状物会堵塞油滤、油泵、燃油调节器和燃油系统其他附件，直接影响发动机的正常供油。2、腐蚀；微生物产生的分泌物会对飞机结构造成腐蚀，主要腐蚀油箱内的结构。3、影响油量表精度；霉菌分泌物能破坏油箱铝合金结构的表面涂层和密封胶，微生物附着在表面繁殖、对其腐蚀，使其失去防护作用，腐蚀严重可使得油箱漏油。这些影响都严重威胁飞行安全，因此做好航油的微生物快速检测，对航油微生物的防治，保障飞行安全都具有极大的意义；
3.atp生物荧光检测仪是主要针对微生物总量进行检测。它可以在1分钟内完成对微生物总量的检测，所以不再像传统微生物培养方法一般需要数天及 2个星期那样才能得知细菌总数。
4.目前atp发光检测被广泛的应用到各种产业领域，如：医院、酒店、食品加工厂、自来水厂和污水处理厂等，确保环境不受肉眼看不到的微生物所影响。我国卫生部门于2005年已把它作为卫生巡查，确保食品加工环境符合卫生标准。
5.atp检测技术的原理是，在荧光素酶和荧光素存在的条件下，atp和它们反应产生光子，产生光子的数量与atp的量成正比，光子的量通过感光仪进行定量检测，根据检测的值(相对光单位rlu)来判断atp的量。此法原为美国太空属于1960年代发展出来用于检测外太空是否有生命存在，后被广泛应用于医疗卫生领域。atp存在地球上各类生物中，以细菌为例，一个细菌体内含有atp的量约为10-18mol；真菌的菌体积较大，一般含有atp的量约为10
‑ꢀ
15-10-16mol。rlu值与atp的量成正比关系，因此rlu值能间接反应微生物的含量。
6.但是现有技术中每个厂家的试剂不同，以及检测流程不同，还是会存在检测效率不高、不够精准、不够直观等问题。
技术实现要素：
7.本发明目的在于：针对上述问题，提供一种atp法快速检测航油微生物污染的试剂和检测方法，解决了现有技术中检测效率不高、不够精准、不够直观等问题等问题。
8.本发明是通过下述方案来实现的：
9.一种atp法快速检测航油微生物污染的检测方法，具体包括以下步骤：
10.步骤一：分别取需要检测的航油各1升，加入到无菌洁净可以密封的塑料容器里，标上序号待检测；
11.步骤二：将所需检测次数的微生物萃取剂和tube c从冰箱内取出，置于25℃室温环境下，检测仪器开机准备，戴上无菌手套；
12.步骤三：将检测试剂的包装盒打开，取出buffera和bufferb置于反应管架上；
13.步骤四：用无菌吸管将步骤三中buffera内的液体全部加到tubec中，盖上tubec管盖用力震荡tubec一段时间，使得tubec管内的固体全部溶解，放在反应管架上静置；
14.步骤五：用无菌吸管将1ml的微生物萃取剂加入到1l的待检测航油中，密封后用力上下振荡并静置；
15.步骤六：用10ml无菌吸管将微生物萃取剂吸回原储存管为待测样品；
16.步骤七：将移液枪调至100μl刻度，在装吸头的袋子中装上吸头；吸取100μl上步骤待测样品，贴壁加入到bufferb中，盖上管盖，上下振荡，上下振荡不少于10次后重新放回反应管架上；
17.步骤八：将移液枪调至50μl刻度，在装吸头的袋子中装上吸头；吸取50μl上步骤中的bufferb管内的液体，加入到bufferc管内的液体中，立即盖上管盖，上下振荡，立即放入检测仪器内进行检测；
18.步骤八：检测结束后，用镊子将检测仪器内bufferc管夹出，记录检测数据，检测仪器关机。
19.步骤四中，盖上tubec管盖用力震荡tubec10s，放在反应管架上静置5min。
20.步骤五中，密封后用力上下振荡10s，静置5min。
21.步骤七中，贴壁加入到bufferb中，盖上管盖，上下振荡5s；在步骤八中，上下振荡30s。
22.本发明还提供一种应用于atp法快速检测航油微生物污染的检测方法的试剂，其主要成分组成为：微生物萃取剂1ml，荧光素酶冻干粉稀释液0.5ml、atp提取液0.1ml和荧光素酶冻干粉。
23.试剂中荧光素酶冻干粉稀释液包括以下一种或多种成分：去离子水≥90％、丙三醇2％-5％、聚乙二醇1％-3％、甘氨酸0.5％-1％、胆固醇0.5％-2％、卵磷脂1％-3％、叠氮化钠0.02％，ph：7.8。
24.试剂中atp提取液包括以下一种或多种成分：去离子水、chex0.04％-0.2％、tritonx-1000.25％-1.0％、ctab0.02-0.1％、tween-200.05％-0.1％、hepes200mm、ph7.8。
25.试剂中荧光素酶冻干粉的制备方法如下：
26.a、制备虫荧光素酶蛋白；
27.1、利用重组的萤火虫荧光素酶大肠杆菌工程菌，在50l的发酵罐中进行扩大培养；
28.2、加入iptg，诱导大肠杆菌表达萤火虫荧光素酶；
29.3、离心收集菌泥，用pbs重悬菌泥，超声破碎；
30.4、离心收集上清；
31.5、用镍柱纯化萤火虫荧光素酶蛋白；
32.b、制备火虫荧光素酶；
33.将a中萤火虫荧光素酶粗酶液50ml加入到1l反应buffert(10mmtris-acetate,50mmnacl,0.1mmcacl2,0.1mmdtt,ph6.5)中,再加入50mgapyrase，25℃反应1h；上镍柱纯化得到纯萤火虫荧光素酶；
34.试剂中试剂中荧光素酶冻干粉组成成分：蛋白纯度为99％的1mg/ml虫荧光素酶液
体，葡萄糖≤5％，海藻糖≤10％，甘露醇≤10％，bsa≤5％，氯化钠≤5％，磷酸氢二钠≤1％，0.5mm虫荧光素。
35.所述荧光素酶冻干粉稀释液包括去离子水≥90％、丙三醇5％、聚乙二醇1％、甘氨酸0.5％、胆固醇1％、卵磷脂2％、叠氮化钠0.02％，ph：7.8；所述atp提取液组分为去离子水、chex0.1％、tritonx-1000.25％、ctab0.02％、hepes200mm、ph7.8；所述荧光素酶冻干粉组分为葡萄糖4％，海藻糖5％，甘露醇8％，bsa3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％。
36.冻干工艺要求：
37.1、-50℃下预冻2h；
38.2、0pa抽真空，温度每小时上升5℃，直到温度上升至5℃维持5h，冻干完成。
39.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
40.1、通过本方案可以高效的对航空煤油的微生物数量、种类进行高效检测，同时本方法的检测速度、准确度和灵敏度均远超传统数据，不仅较少检测时间，而且本方法操作简单，极大的节省了人力资源。
具体实施方式
41.本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
42.本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
43.此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或隐含地包括一个或多个该特征。
44.实施例1
45.一种atp法快速检测航油微生物污染试剂，其主要成分组成为：微生物萃取剂1ml，荧光素酶冻干粉稀释液(buffera)0.5ml、atp提取液(bufferb)0.1ml和荧光素酶冻干粉(tuberc)。
46.试剂中荧光素酶冻干粉稀释液(buffera)包括以下一种或多种成分：去离子水≥90％、丙三醇2％-5％、聚乙二醇1％-3％、甘氨酸0.5％-1％、胆固醇0.5％-2％、卵磷脂1％-3％、叠氮化钠0.02％。ph：7.8；
47.针对荧光素酶冻干粉稀释液(buffera)，发明人进行了4组实验对比；
48.实验组1，取丙三醇2ml、聚乙二醇1g、甘氨酸0.5g、胆固醇0.5g、卵磷脂1g、叠氮化钠0.02g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中搅拌溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
49.实验组2，取丙三醇3ml、聚乙二醇2g、甘氨酸0.8g、胆固醇1g、卵磷脂2g、叠氮化钠0.02g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中搅拌溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
50.实验组3，取丙三醇5ml、聚乙二醇3g、甘氨酸1g、胆固醇1.5g、卵磷脂3g、叠氮化钠
0.02g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中搅拌溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
51.实验组4，取丙三醇5ml、聚乙二醇1g、甘氨酸0.5g、胆固醇1g、卵磷脂2g、叠氮化钠0.02g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中搅拌溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
52.通过4组实验可以得出结论：当去离子水≥90％、丙三醇5％、聚乙二醇1％、甘氨酸0.5％、胆固醇1％、卵磷脂2％、叠氮化钠0.02％。ph：7.8这个配比可以使得荧光素酶冻干粉溶解过后的反应稳定性最佳。
53.试剂中atp提取液(bufferb)包括以下一种或多种成分：去离子水、chex0.04％-0.2％、tritonx-1000.25％-1.0％、ctab0.02-0.1％、tween-200.05％-0.1％、hepes200mm、ph7.8；
54.针对与atp提取液(bufferb)发明人同样做了4组实验组对比：
55.实验组1，取chex0.04g、tritonx-1000.25ml、ctab0.02g、tween-200.05ml、hepes5.2g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中超声溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
56.实验组2，取chex0.1g、tritonx-1000.5ml、ctab0.05g、tween-200.08ml、hepes5.2g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中超声溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
57.实验组3，取chex0.15g、tritonx-1000.75ml、ctab0.1g、tween-200.05ml、hepes5.2g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中超声溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
58.实验组4，取chex0.1g、tritonx-1000.25ml、ctab0.02g、hepes5.2g，按以上顺序分别加入到80ml去离子水中超声溶解，用5％的氢氧化钠溶液和5％的盐酸溶液调节ph至7.8。容量瓶定容到100ml；
59.发明人通过上述案例实验得出结论：当去离子水、chex0.1％、tritonx-1000.25％、ctab0.02％、hepes200mm、ph7.8。这个配比在微生物atp提起过程中效率最高。
60.试剂中荧光素酶冻干粉(tuberc)的制备方法如下：
61.荧光素酶冻干粉中的核心部分为虫荧光素酶，其为萤火虫荧光素酶基因在大肠杆菌表达的产物。具体步骤如下：
62.1、利用重组的萤火虫荧光素酶大肠杆菌工程菌，在50l的发酵罐中进行扩大培养。
63.2、加入iptg，诱导大肠杆菌表达萤火虫荧光素酶。
64.3、离心收集菌泥，用pbs重悬菌泥，超声破碎。
65.4、离心收集上清。
66.5、用镍柱纯化萤火虫荧光素酶蛋白。
67.通过以上步骤，得到萤火虫荧光素酶粗酶液。该粗酶液中含有大量的atp，直接影响后续检测灵敏度；
68.将上述萤火虫荧光素酶粗酶液50ml加入到1l反应buffert(10mmtris-acetate,50mmnacl,0.1mmcacl2,0.1mmdtt,ph6.5)中,再加入50mgapyrase，25℃反应1h。上镍柱纯化得到纯萤火虫荧光素酶。
69.试剂中试剂中荧光素酶冻干粉(tuber c)组成成分：蛋白纯度为99％的 1mg/ml虫荧光素酶液体，葡萄糖≤5％，海藻糖≤10％，甘露醇≤10％，bsa≤ 5％，氯化钠≤5％，磷酸氢二钠≤1％，0.5mm虫荧光素；
70.针对荧光素酶冻干粉(tuber c)，发明人进行了4组实验对比；
71.实验组1，总体积0.5ml，虫荧光素酶液体中加入，葡萄糖5％，海藻糖 5％，甘露醇10％，bsa 5％，氯化钠5％，磷酸氢二钠1％，0.5mm虫荧光素。冻干粉形态完好，活性保持90％，37℃下7天活性保持50％、14天活性保持10％、 21天活性保持10％；
72.实验组2，总体积0.5ml，虫荧光素酶液体中加入，葡萄糖1％，海藻糖 1％，甘露醇5％，bsa 1％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％，0.5mm虫荧光素。冻干粉形态完好，活性保持95％，37℃下7天活性保持40％。14天活性保持6％、 21天活性保持2％；
73.实验组3，总体积0.5ml，虫荧光素酶液体中加入，葡萄糖2％，海藻糖 5％，甘露醇10％，bsa 2％，氯化钠2％，磷酸氢二钠0.3％，0.5mm虫荧光素。冻干粉形态完好，活性保持98％，37℃下7天活性保持65％。14天活性保持 45％、21天活性保持30％；
74.实验组4，总体积0.5ml，虫荧光素酶液体中加入，葡萄糖4％，海藻糖 5％，甘露醇8％，bsa 3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％，0.5mm虫荧光素。冻干粉形态完好，活性保持99％，37℃下7天活性保持90％。14天活性保持86％、21天活性保持82％；
75.发明人通过4组实验对比得出结论：当葡萄糖4％，海藻糖5％，甘露醇 8％，bsa 3％，氯化钠1％，磷酸氢二钠0.1％这个个配比在微生物atp提起过程中效率最高。
76.本方案中对
77.冻干工艺要求：
78.1、-50℃下预冻2h
79.2、0pa抽真空，温度每小时上升5℃，直到温度上升至5℃维持5h，冻干完成。
80.实施例2
81.基于上述实施例1中提供的试剂，本实施例提供一种atp法快速检测航油微生物污染的检测方法，其具体包括以下步骤：
82.1、分别取需要检测的航油各1升，加入到无菌洁净可以密封的塑料容器里，标上序号待检测；
83.2、将所需检测次数的微生物萃取剂和tube c从冰箱内取出，置于25℃室温环境下，检测仪器开机准备，戴上无菌手套；
84.3、将检测试剂的包装盒打开，取出buffer a和buffer b置于反应管架上；
85.4、用无菌吸管将buffer a内的液体全部加到tube c中，盖上tube c 管盖用力震荡tube c 10s，使得tube c管内的固体全部溶解，放在反应管架上静置5min；
86.5、用无菌吸管将1ml的微生物萃取剂加入到1l的待检测航油中，密封后用力上下振荡10s，静置5min；
87.6、用10ml无菌吸管将微生物萃取剂吸回原储存管为待测样品；
88.7、将移液枪调至100μl刻度，在装吸头的袋子中装上吸头；吸取 100μl上步骤待测样品，贴壁加入到buffer b中，盖上管盖，用手指捏住buffer b管的两头上下振荡5s，上下振荡不少于10次后重新放回反应管架上；
89.8、将移液枪调至50μl刻度，在装吸头的袋子中装上吸头；吸取50μl 上步骤中的
buffer b管内的液体，加入到buffer c管内的液体中(吸头尖插入到液面下加入)，立即盖上管盖，用手指捏住buffer c管的两头上下振荡 30s，立即放入检测仪器内进行检测；
90.9、检测结束后，用镊子将检测仪器内buffer c管夹出，记录检测数据，检测仪器关机。
91.通过上述方法可以快速且高效的对微生物中的含量进行精准检测。
92.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。