荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法

1.本发明属于中药活性成分分析技术领域，具体涉及一种荷叶降糖降脂活性化合物的筛选方法。


背景技术：

2.ii型糖尿病是一种常见的代谢性疾病，典型特征是慢性高血糖。肥胖是另一种广泛存在的脂质代谢紊乱性疾病，其特征是脂肪异常积累。糖尿病和肥胖症的高发和流行给个人和社会带来了巨大的经济压力。加强对血糖和血脂的管理，将这些疾病及其并发症的风险降到最低是非常必要的。其中，α-葡萄糖苷酶和脂肪酶分别是控制血糖和血脂的重要靶点酶。
3.相关技术中，采用大量荷叶样品尽可能分离其药效相关的单体化合物，并利用分离得到的单体化合物在细胞或动物水平逐一筛选有药效活性的单体化合物。但发明人发现该方法所涉及的单体化合物分离步骤复杂耗时，活性测试成本也较高，且通常靶点不明确。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的实施例提供了一种仅需要少量荷叶样品，可快速简便地筛选出明确的降血糖血脂靶酶的活性化合物方法，且筛选成本相对较低。
5.本发明的实施例提供了一种荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法，包括以下步骤：(1)荷叶粗提物样品的制备；将干燥后的荷叶粉碎，取粉碎后的材料浸泡提取超声，多次重复后减压浓缩，冷冻干燥得到荷叶粗提物样品；
6.(2)取上述荷叶粗提物样品对降血糖血脂靶酶的体外酶进行抑制活性测定；
7.(3)取上述荷叶粗提物样品前处理后进行仪器分析，采集荷叶粗提物样品出峰数据；
8.(4)对荷叶粗提物样品进行实验组靶酶和对照组灭活靶酶筛选后仪器分析，采集实验组与对照组出峰数据，根据实验组、对照组、上述荷叶粗提物样品出峰数据计算得到荷叶化合物中各成分与对应靶酶之间的富集因子，筛选出荷叶具有降糖降脂的活性化合物。
9.进一步地，步骤(1)中，将干燥的荷叶粉碎后称取1.0kg于8～12l的75％乙醇溶液中浸泡12h，超声提取20-40min，重复浸泡提取3次，合并3次的提取液，减压浓缩去除有机溶剂后进行冷冻干燥，得到荷叶粗提物样品。
10.进一步地，步骤(2)中，将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph 6.8、浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，取适量不同浓度的溶解液与等量的0.26u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液置于96孔板中，在恒温下孵育后加入适量底物对硝基-α-d吡喃葡萄糖苷溶液，在所述温度下孵育相同时间后加入适量na2co3溶液停止反应，取反应结束后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度ic
50
，其中阳性对照组中采用阿卡波糖。
11.进一步地，步骤(2)中，将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph 7.4、浓度为0.1mol/l
的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，取适量不同浓度的溶解液、适量的0.26u/ml的脂肪酶溶液及pbs缓冲溶液置于96孔板中，在恒温下孵育后加入适量底物对硝基苯磷酸酯溶液，在所述温度下孵育，取孵育后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对脂肪酶的半数抑制浓度ic
50
，其中阳性对照组中采用脂脉康胶囊。
12.进一步地，步骤(3)中，荷叶粗提物样品于90％乙腈溶液中溶解，得到荷叶粗提物溶液浓度为8～14mg/ml。
13.进一步地，步骤(4)中，取适量降血糖靶酶与荷叶粗提物样品分别于pbs缓冲溶液中溶解，取100μl溶解后的酶溶液、荷叶粗提物样品溶液于离心管中在37℃恒温下孵育20～60min，将孵育后的溶液于带有超滤膜的离心管中10000rpm离心5～15min，离心后冲洗，冲洗后离心，取离心后的溶液于乙腈中室温下放置10min，离心收集洗脱液吹干，吹干后加入乙腈，取加入乙腈后的溶液于色谱-质谱仪中检测，采集出峰数据；其中对照组使用在沸水中灭活的降血糖靶酶；取适量降血脂靶酶、荷叶粗提物样品进行与降血糖靶酶、荷叶粗提物样品相同的步骤得到出峰数据。
14.进一步地，步骤(4)中，根据采集的实验组、对照组的出峰数据与对应荷叶粗提物样品的出峰数据，计算荷叶粗提物样品中各成分与对应靶酶之间的富集因子，得到荷叶中筛选后的降血糖血脂活性化合物；其中富集因子计算公式为
15.ef＝(a
活酶-a
灭活酶
)/a
样品
×
100％
16.式中，ef代表靶酶与抑制剂之间的富集因子，a
活酶
代表荷叶粗提物与靶酶筛选后色谱峰的峰面积，a
灭活酶
代表荷叶粗提物与灭活酶筛选后色谱峰的峰面积，a
样品
为荷叶粗提物样品色谱峰的峰面积。
17.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明的荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法，根据荷叶中不同活性化合物对降血糖血脂靶酶的亲和力不同，通过荷叶粗提物样品及其与实验组靶酶、对照组灭活靶酶筛选前后色谱-质谱仪检测的出峰数据计算得到富集因子，筛选出荷叶中具有降糖降脂的活性化合物；本发明实施例的方法仅需少量的荷叶样品、筛选过程简单、灵敏度高、靶点明确，快速地从复杂的荷叶粗提物样品中识别与生物靶酶相结合的药物配体；极大地提高了荷叶提取物中活性化合物的筛选效率和可靠性；且筛选的特异性强，同时选择两种酶作为筛选靶标，与单一酶靶标相比，多酶靶标能够有效的揭示化合物与不同酶靶标之间的协同效应。同时，本发明实施例的方法有助于荷叶资源以降血糖降血脂协同功效为导向的充分开发利用；还可应用于其他复杂中药中活性成分的筛选。
附图说明
18.图1是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例一的流程图；
19.图2是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例二的色谱图；
20.图3是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例三的色谱图；
21.图4是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例二、三的筛选得到的降糖降脂的生物碱1结构示意图；
22.图5是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例二、三的筛选得到的降糖
降脂的生物碱2结构示意图；
23.图6是本发明荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法实施例二、三的筛选得到的降糖降脂的黄酮结构示意图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。
25.荷叶是一种常见的药用和食用植物，资源非常丰富。相关技术中，荷叶通常用作减肥茶以及一些减肥中成药的主要配方，具有较高的药用和食用价值。研究发现，荷叶具有丰富的药理活性，在降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化、肝保护和抗病毒等方面均具有较好的作用。相比于合成药物(如：奥利司他)，荷叶提取物在治疗或保健方面具有天然产物副作用低、宜长期服用等优势。然而，荷叶提取物成分复杂，在单体化合物层面明确其降血糖以及降血脂药效物质基础仍十分困难；且通常只采用单一疾病模型筛选药物单体，无法同时得到具有降血糖和降血压协同作用的活性化合物。#
26.实施例一
27.请参考图1，本发明的实施例提供了一种荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法，包括以下步骤：
28.(1)荷叶粗提物样品的制备；
29.具体地，将干燥后的荷叶粉碎，取粉碎后的材料浸泡提取超声，多次重复后减压浓缩，冷冻干燥得到荷叶粗提物样品；
30.优选地，将干燥的荷叶粉碎后称取1.0kg于8～12l的75％乙醇溶液中浸泡12h，超声提取20～40min，重复浸泡提取3次，合并3次的提取液，减压浓缩去除有机溶剂后进行冷冻干燥，得到荷叶粗提物样品；样品置于4℃冰箱保存；
31.(2)取上述荷叶粗提物样品对降血糖血脂靶酶的体外酶进行抑制活性测定；
32.具体地，将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph 6.8、浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，取适量不同浓度的溶解液与适量的0.26u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液置于96孔板中，在恒温下孵育后加入适量底物对硝基-α-d吡喃葡萄糖苷溶液，在所述温度下孵育相同时间后加入适量na2co3溶液停止反应，取反应结束后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度ic
50
(半数抑制浓度ic
50
为酶抑制率在50％时对应的样品浓度)，酶抑制率的计算公式如下：
33.酶抑制率(％)＝1-(o
样品-o
样品对照
)/(o
空白-o
空白对照
)
×
100％
34.式中，o
样品
、o
样品对照
、o
空白
、o
空白对照
分别为待测样品(有样品和酶)、样品对照(加样品不加酶)、对照(有酶但不加样品)、空白对照(不加样品和酶)的吸光度值；其中阳性对照组中采用阿卡波糖；
35.具体地，将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph 7.4、浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，取适量不同浓度的溶解液、适量的0.26u/ml的脂肪酶溶液及pbs缓冲溶液置于96孔板中，在恒温下孵育后加入适量底物对硝基苯磷酸酯溶液，在所述温度下孵育，取孵育后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对脂肪酶的半数抑制浓度ic
50
，其中阳性对照组中采用脂脉康胶囊；
36.(3)取上述荷叶粗提物样品前处理后进行仪器分析，采集荷叶粗提物样品出峰数据；
37.具体地，将荷叶粗提物样品溶解于乙腈中，取适量溶解后的溶液于色谱-质谱仪中检测，采集荷叶粗提物样品出峰数据；
38.(4)对荷叶粗提物样品进行实验组靶酶和对照组灭活靶酶筛选后仪器分析，采集实验组与对照组出峰数据，根据实验组、对照组、上述荷叶粗提物样品出峰数据计算得到荷叶化合物中各成分与对应靶酶之间的富集因子，筛选出荷叶具有降糖降脂的活性化合物。
39.具体地，取适量降血糖靶酶与荷叶粗提物样品分别于pbs缓冲溶液中溶解，取适量溶解后的酶溶液、荷叶样品溶液于离心管中在恒温下孵育，将孵育后的溶液于带有超滤膜的离心管中离心，离心后冲洗，冲洗后离心，取离心后的溶液于乙腈中室温下放置10min，离心收集洗脱液吹干，吹干后加入乙腈，这个过程中荷叶粗提物样品中活性与非活性成分分离，超滤离心后与靶酶结合的活性成分保留，非活性成分被去除，取加入乙腈后的溶液于色谱-质谱仪中检测，采集出峰数据；其中对照组使用在沸水中灭活的降血糖靶酶；取适量降血脂靶酶、荷叶粗提物样品进行与降血糖靶酶、荷叶粗提物样品相同的步骤得到出峰数据；根据采集的实验组、对照组的出峰数据与对应荷叶粗提物样品的出峰数据，计算荷叶粗提物样品中各成分与对应靶酶之间的富集因子，富集因子是通过计算与靶酶孵化筛选前后荷叶粗提物样品中小分子配体的浓度变化得到的，初步反映荷叶中小分子与靶酶之间的结合亲和力；根据富集因子即可确定荷叶中筛选后的降血糖血脂活性化合物；其中富集因子计算公式为
40.ef＝(a
活酶-a
灭活酶
)/a
样品
×
100％
41.式中，ef代表靶酶与抑制剂之间的富集因子，a
活酶
代表荷叶粗提物与靶酶筛选后色谱峰的峰面积，a
灭活酶
代表荷叶粗提物与灭活酶筛选后色谱峰的峰面积，a
样品
为荷叶粗提物色谱峰的峰面积。
42.本发明实施例的方法还有助于荷叶资源以降血糖降血脂协同功效为导向的充分开发利用；还可应用于其他复杂中药中活性成分的筛选。
43.实施例二
44.本发明的实施例采用的降血糖靶酶是α-葡萄糖苷酶，本发明实施例提供了一种荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法，包括以下步骤：
45.(1)将干燥的荷叶粉碎后称取1.0kg于10l(体积比为1:10)75％乙醇溶液中浸泡12h，超声提取20～40min，重复浸泡提取3次，合并3次的提取液，减压浓缩去除有机溶剂后进行冷冻干燥，得到荷叶粗提物样品；
46.(2)将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph 6.8、浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，分别取25μl不同浓度的荷叶粗提物溶解液与等量的0.26u/ml的α-葡萄糖苷酶溶液置于96孔板中，在37℃下孵育15min后加入50μl底物对硝基-α-d吡喃葡萄糖苷溶液，在所述温度下孵育15min后加入50μl 0.2mol/l的na2co3溶液停止反应，取反应结束后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度ic
50
，其中阳性对照组中采用阿卡波糖；
47.根据检测数据计算得到荷叶粗提物其ic
50
值为6.83
±
0.63μg/ml，约为阳性对照阿卡波糖ic
50
(172.52
±
15.95μg/ml)值的25分之一，表明荷叶粗提物样品中具有对α-葡萄糖
苷酶非常强的活性抑制化合物；
48.(3)取适量荷叶粗提物样品于90％乙腈溶液中溶解，得到荷叶粗提物溶液浓度为8～14mg/ml，取所述荷叶粗提物提取液进行色谱-质谱分析；
49.其中，高效液相色谱：色谱柱为agilent c18(9.4
×
250mm，7μm)、phenomenex ods(2.0
×
150mm，5μm)，waters symmetry c18(4.6
×
250mm，5μm)中的一种，流动相a为水(含0.1％甲酸)、水(含0.1％乙酸)中的一种，流动相b为甲醇、乙腈、甲醇(含0.1％甲酸)、乙腈(含0.1％甲酸)中的一种，梯度洗脱，39分钟内流动相b从5％上升至56％，流速0.6～1ml/min，进样量10μl，检测波长280nm；
50.质谱分析条件为：质谱仪为tsq quantis、tsq quantum access max、tsq quantum ultra中的一种，电喷雾离子化(esi)，负离子模式，3000伏特喷雾电压，40v锥孔电压，350℃毛细管温度，40lb/in2鞘气压，10lb/in2辅助气压(氮气)，碰撞能量30-45ev，分子量扫描范围150～1500道尔顿；
51.参照附图2，荷叶粗提物样品的色谱图中发现了11个主成分峰，通过主成分峰的信息与标准品的质谱碎片进行比对可确定荷叶化合物种类；
52.(4)取6u分装后的α-葡萄糖苷酶与1mg荷叶粗提物样品分别于ph6.8浓度0.1mol/l的pbs缓冲溶液中溶解，使酶溶液浓度为6u/100μl、荷叶粗提物样品浓度为10mg/ml，取100μl溶解后的酶溶液、荷叶样品溶液于2ml离心管中在37℃恒温下孵育60min，将孵育后的混合溶液转移至带有30000道尔顿超滤膜的离心管中10000rpm下离心10分钟，离心后冲洗，冲洗后离心，去除样品中未与α-葡萄糖苷酶结合的成分，在离心后的溶液中加入200μl 90％的乙腈于室温下放置10min，这个过程中α-葡萄糖苷酶失去活性，再离心收集洗脱液吹干，吹干后加入90％的乙腈复溶，取复溶后的溶液于色谱-质谱仪中检测，检测条件与上述相同，采集出峰数据；其中对照组使用在沸水中灭活的α-葡萄糖苷酶，其余步骤与活α-葡萄糖苷酶均相同。
53.α-葡萄糖苷酶与不同化合物的亲和活性可通过与α-葡萄糖苷酶超滤离心筛选前后荷叶粗提物样品溶液中各个化合物色谱峰的峰面积的变化进行评价。
54.参照附图2、4、5、6，将荷叶粗提物样品中的11个色谱峰数据、荷叶粗提物样品与α-葡萄糖苷酶筛选前后的色谱峰数据计算得到富集因子；其中，峰1～11的富集因子分别为3.95％、0.26％、0.21％、0.88％、9.33％、0.26％、0.64％、0.12％、1.38％、1.84％、1.10％，而峰1、峰5和峰10表现出较高的富集因子，根据荷叶粗提物样品的色谱图确定的化合物可得到峰1、峰5和峰10分别对应的化合物为生物碱1、生物碱2、黄酮。这三个峰所对应的三种种化合物与α-葡萄糖苷酶具有好的结合亲和活性，可作为潜在的α-葡萄糖苷酶的抑制剂，用于人体降血糖；而峰5和峰10所对应的生物碱2、黄酮的降糖活性是通过本发明实施例的方法筛选得到。
55.实施例三
56.本发明实施例采用的降血脂靶酶为脂肪酶，本发明实施例提供了一种荷叶降糖降脂活性化合物筛选方法，包括以下步骤：
57.(1)将干燥的荷叶粉碎后称取1.0kg于10l(体积比为1:10)75％乙醇溶液中浸泡12h，超声提取20-40min，重复浸泡提取3次，合并3次的提取液，减压浓缩去除有机溶剂后进行冷冻干燥，得到荷叶粗提物样品；
58.(2)将适量的荷叶粗提物样品溶解于ph7.4、浓度为0.1mol/l的pbs缓冲溶液中，得到不同浓度的荷叶粗提物溶解液，分别取100μl不同浓度的荷叶粗提物溶解液、60μl的0.26u/ml的脂肪酶溶液、置于40μlpbs缓冲溶液于96孔板中，在37℃下孵育5～10min后加入20μl底物对硝基苯磷酸酯溶液，在37℃下孵育20min，将孵育后的溶液于酶标仪上，得到405nm处的吸光度，以此计算荷叶粗提物样品对脂肪酶的半数抑制浓度ic
50
，其中阳性对照组中采用脂脉康胶囊；
59.根据检测数据计算得到荷叶粗提物其ic
50
值为241.65
±
28.25μg/ml，阳性对照脂脉康胶囊的ic
50
值为3.91
±
0.36mg/ml，表明荷叶粗提物样品中具有对脂肪酶较强的活性抑制化合物；
60.(3)取适量荷叶粗提物样品于90％乙腈溶液中溶解，得到荷叶粗提物溶液浓度为8～14mg/ml，取所述荷叶粗提物提取液进行色谱-质谱分析；色谱-质谱仪分析条件与实施例二中相同；
61.参照图3，荷叶粗提物样品的色谱图中发现了11个主成分峰，通过主成分峰的信息与标准品的质谱碎片进行比对确定其化合物种类；
62.(4)取6u分装后的脂肪酶与1mg荷叶粗提物样品分别于ph6.8浓度0.1mol/l的pbs缓冲溶液中溶解，使酶溶液浓度为6u/100μl、荷叶粗提物样品浓度为10mg/ml，取100μl溶解后的酶溶液、荷叶样品溶液于2ml离心管中在37℃恒温下孵育60min，将孵育后的混合溶液转移至带有10000道尔顿超滤膜的离心管中10000rpm下离心10分钟，离心后冲洗，冲洗后离心，去除样品中未与脂肪酶结合的成分，在离心后的溶液中加入200μl90％的乙腈于室温下放置10min，这个过程中脂肪酶失去活性，再离心收集洗脱液吹干，吹干后加入90％的乙腈复溶，取复溶后的溶液于色谱-质谱仪中检测，检测条件与上述相同，采集出峰数据；其中对照组使用在沸水中灭活的脂肪酶，其余步骤与活脂肪酶均相同。
63.脂肪酶与不同化合物的亲和活性可通过与脂肪酶超滤离心筛选前后荷叶粗提物样品溶液中各个化合物色谱峰的峰面积的变化进行评价。
64.参照附图3、4、5、6，将荷叶粗提物样品溶液中的11个色谱峰面积、荷叶粗提物样品与脂肪酶筛选前后的色谱峰面积计算富集因子；其中，峰1～11的富集因子分别为3.75％、0.22％、0.56％、0.49％、5.03％、2.14％、0.44％、1.09％、2.28％、4.05％、1.41％，而峰1、峰5和峰10表现出较高的富集因子，与实施例二中对应的峰1、峰5、峰10相同，为生物碱1、生物碱2、黄酮，推测这三个峰所对应的三种活性化合物与脂肪酶酶具有好的结合亲和活性，可作为脂肪酶抑制剂，用于人体降血血脂；而峰5和峰10所对应的化合物的降脂活性是通过本发明实施例的方法筛选得到。表明本发明实施例的方法选择两种酶作为筛选靶标，筛选结果表示两种靶酶所对应的荷叶中活性化合物相同，与单一酶靶标相比，多酶靶标能够有效的揭示化合物与不同酶靶标之间的协同效应。
65.在本文中，所涉及的前、后、上、下等方位词是以附图中零部件位于图中以及零部件相互之间的位置来定义的，只是为了表达技术方案的清楚及方便。应当理解，所述方位词的使用不应限制本技术请求保护的范围。
66.在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
67.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。