一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法及其应用与流程

1.本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法及其应用。


背景技术：

2.类固醇激素是一类典型的内分泌干扰物，在环境中普遍存在，是继臭氧层破坏和全球气候变暖之后的第三大环境问题。类固醇激素在极低的剂量即可引起极强的内分泌干扰效应，这类物质进入环境后会对生物体以及人类产生极大的危害。目前，已有研究表明在中国的污水处理厂、畜禽养殖场、水产养殖、污泥河流、土壤中均可检出较高浓度的类固醇激素。因此我国的类固醇激素污染问题已经较为突出，成为国内学者研究的热点。
3.譬如，谭丽超（参考：水环境中类固醇激素的污染特征及健康风险评价研究[d].南京农业大学,2011.）运用超高压液相色谱串联质谱仪，在esi电离、多反应选择监测(mrm)模式下，通过优化毛细管电压、锥孔电压、碰撞能等质谱参数和流动相组成、流速、梯度洗脱程序等液相色谱分离条件，建立同时检测环境水样中25种类固醇激素的仪器分析方法。采用外标法进行定量分析，标准曲线相关系数良好。该检测方法具有定性准确、灵敏度高、重现性好、简单快速的优点。但目前对于海域中海水、海洋沉积物、生物体中类固醇激素的存在状况很少研究及报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种对海洋沉积物中的类固醇激素具有较高检测精密度和准确度的方法。
[0005]
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，包括以下步骤：（1）将海洋沉积物样本置于容器中，加入混合萃取溶剂超声提取，过滤，得到提取液；（2）将提取液旋蒸，固相萃取，进行液相色谱串联质谱分析；固相萃取装置所用吸附剂为改性聚苯乙烯；改性聚苯乙烯由苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得。
[0006]
本发明采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得改性聚苯乙烯，其具有较大的比表面积，将其作为固相萃取柱的成分，对海洋沉积物中类固醇激素进行检测，提高了类固醇激素的检测精密度和准确度，使其对海洋沉积物中类固醇激素浓度具有较好的检测准确性。
[0007]
优选地，在本发明的一些实施例中，海洋沉积物样本的重量份为10~20份；海洋沉积物样本与混合萃取溶剂的重量比为1:25~50。
[0008]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，混合萃取溶剂中包括甲醇、乙酸乙酯中的至少一种。
[0009]
更优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，混合萃取溶剂为甲醇与乙酸乙酯，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为1~3:1。
[0010]
更优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，混合萃取溶剂中包括甲醇和乙酸乙酯；所述甲醇和乙酸乙酯的重量比为15~35:1。
[0011]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（1）中，超声功率为150~250w，超声时间为30~60min。
[0012]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，固相萃取步骤为：将改性聚苯乙烯柱安装至固相萃取装置上，活化固相萃取柱，上样，淋洗，氮吹，洗脱，定容，过滤，得到滤液。
[0013]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，提取液旋蒸至原提取液体积的1/3~2/3。
[0014]
优选地，在本发明的一些实施例中，改性聚苯乙烯的制备方法为：提供聚苯乙烯，将聚苯乙烯、十二烷基硫酸钠与1-氯十二烷乳液置于容器中进行溶胀，得到物质a；将苯乙烯、二乙烯基苯、甲苯、n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺、过氧化苯甲酰和正庚烷置于十二烷基硫酸钠溶液中超声乳化，得到物质b；将物质a与物质b混合，进行溶胀，然后置于分液漏斗中静置分层，得到下层溶液；将下层溶液与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，在氮气保护条件下，升温进行聚合反应，反应结束后，离心，洗涤，干燥，回流，抽滤，干燥，得到改性聚苯乙烯。
[0015]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，固相萃取所用洗脱液为纯水、乙酸乙酯、乙腈中的至少一种。
[0016]
更优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，固相萃取所用洗脱液为乙酸乙酯、乙腈。
[0017]
更优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，固相萃取步骤为：制备改性聚苯乙烯柱，并将其安装至固相萃取装置上，用5~8ml甲醇、5~8ml超纯水活化固相萃取柱，调节真空度，使样品以2.5~4.5ml/min的恒定流速过柱，上样完毕后，用5~10ml超纯水淋洗固相萃取柱，除去水样和淋洗液；将固相萃取柱置于35~45℃下氮吹，然后分别用5~10ml乙酸乙酯、5~10ml乙腈洗脱固相萃取柱，洗脱速度为1~2滴/s，收集洗脱液，采用甲醇定容至1~2ml，过滤，得到滤液。
[0018]
进一步优选地，改性聚苯乙烯柱的制备方法为：按重量份计，将12~17份改性聚苯乙烯浸泡在体积分数为70~80%乙醇中2~3h，不断搅拌以除去气泡，然后装入层析柱中，用3~5倍体积的70~80%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣；再用3~5倍体积质量分数为3~5%氢氧化钠水溶液、2~4倍的蒸馏水、3~4倍体积的体积分数5~10%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至ph至中性，得到改性聚苯乙烯柱，其容量为10~30mg。
[0019]
优选地，在本发明的一些实施例中，步骤（2）中，液相色谱串联质谱分析中，液相色谱条件为：流动相a：0.1~0.2%甲酸水溶液，流动相b：乙腈；其中流动相a与流动相b的体积比为20~50:50~80；柱温：30~35℃；进样体积：5~10μl；流速：0.15~0.25ml/min；质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子源温度：110~120℃；多反应检测模式正、负
离子模式；去溶剂辅助加热温度：320~350℃；去溶剂气和锥孔气：氮气；去溶剂气和锥孔气流速：550~600l/h和45~55l/h；碰撞气：高纯氩气；碰撞室的压力：0.25~0.35pa。
[0020]
本发明还公开了海洋沉积物中类固醇激素包括睾酮、宝龙酮、甲基睾酮、雄烯二酮、皮质醇、孕烯醇酮、己烯雌酚。
[0021]
本发明采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得改性聚苯乙烯，其具有较大的比表面积，将其作为固相萃取柱的成分，对海洋沉积物中类固醇激素进行检测，提高了类固醇激素的检测精密度和准确度，使其对海洋沉积物中类固醇激素浓度具有较好的检测准确性。因此，本发明是一种对海洋沉积物中的类固醇激素具有较高检测精密度和准确度的方法。
附图说明
[0022]
图1为实施例1中聚苯乙烯与改性聚苯乙烯的红外光谱图；图2为esi
+
模式下类固醇激素的mrm色谱图；图3为esi-模式下类固醇激素的mrm色谱图；附图标号：1. 睾酮；2. 宝龙酮；3. 表雄酮；4. 孕烯醇酮；5.雄烯二酮；6. 炔雌醇；7. 雌酮；8. 己烯雌酚。
具体实施方式
[0023]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明进行详细描述，但是应当理解，这些实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明的保护范围也不限于下述的实施例。本发明下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0024]
进一步优选地，在在本发明的一些实施例中，改性聚苯乙烯的制备方法为：配制十二烷基硫酸钠溶液；按重量份计，将十二烷基硫酸钠、无水乙醇和蒸馏水置于容器中，配制成固含量为0.35~0.55wt%十二烷基硫酸钠溶液；然后将15~20份十二烷基硫酸钠溶液与0.25~0.45份1-氯十二烷在100~150w超声条件下超声分散20~30min，得到1-氯十二烷乳液；提供聚苯乙烯，将0.25~0.45份聚苯乙烯置于0.3~0.5份十二烷基硫酸钠溶液中超声分散20~30min，得到聚苯乙烯乳液，将其与上述1-氯十二烷乳液置于容器中，在氮气保护条件下进行机械搅拌，搅拌速率为300~500r/min，并在30~40℃下溶胀10~15h，得到物质a；将1.5~2.5份苯乙烯、5.5~7.5份二乙烯基苯、10~15份甲苯、1.8~2.7份n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺、0.1~0.2份过氧化苯甲酰和5~8份正庚烷置于十二烷基硫酸钠溶液中超声乳化，得到物质b；将上述物质a与上述物质b混合，在30~40℃下继续溶胀10~15h，然后置于分液漏斗中静置15~20min分层，得到下层溶液；将聚乙烯吡咯烷酮溶于蒸馏水中配制成浓度为5~10wt%的溶液；将上述下层溶液与2.5~5份聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，在氮气保护条件下，升温至60~80℃进行聚合反应18~24h，反应结束后，向其中加入无水乙醇浸泡过夜，离心除去上清液，反复洗涤3~5次，然后置
于55~75℃下干燥18~24h，向上述干燥产物加入80~100份二氯甲烷在75~85℃下回流18~24h，抽滤，置于55~75℃下干燥18~24h，得到改性聚苯乙烯。
[0025]
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：实施例1：改性聚苯乙烯的制备方法为：配制十二烷基硫酸钠溶液；按重量份计，将十二烷基硫酸钠、无水乙醇和蒸馏水置于容器中，配制成固含量为0.5wt%十二烷基硫酸钠溶液；然后将18份十二烷基硫酸钠溶液与0.35份1-氯十二烷在150w超声条件下超声分散25min，得到1-氯十二烷乳液；提供聚苯乙烯（购自武汉浩荣生物科技有限公司，含量≥99%），将0.25份聚苯乙烯置于0.35份0.5wt%十二烷基硫酸钠溶液中超声分散25min，得到聚苯乙烯乳液，将其与上述1-氯十二烷乳液置于容器中，在氮气保护条件下进行机械搅拌，搅拌速率为500r/min，并在35℃下溶胀12h，得到物质a；将1.75份苯乙烯、6.5份二乙烯基苯、12份甲苯、2.1份n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺、0.15份过氧化苯甲酰和7份正庚烷置于十二烷基硫酸钠溶液中超声乳化，得到物质b；将上述物质a与上述物质b混合，在35℃下继续溶胀12h，然后置于分液漏斗中静置20min分层，得到下层溶液；将聚乙烯吡咯烷酮溶于蒸馏水中配制成浓度为7.5wt%的溶液；将上述下层溶液与4.5份聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，在氮气保护条件下，升温至70℃进行聚合反应24h，反应结束后，向其中加入无水乙醇浸泡过夜，离心除去上清液，反复洗涤3次，然后置于60℃下干燥24h，向上述干燥产物加入80份二氯甲烷在75℃下回流24h，抽滤，置于60℃下干燥18h，得到改性聚苯乙烯。
[0026]
实施例2：改性聚苯乙烯的制备方法，与实施例1不同的是：将2.2份苯乙烯、7.0份二乙烯基苯、15份甲苯、2.7份n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺、0.18份过氧化苯甲酰和8份正庚烷置于十二烷基硫酸钠溶液中超声乳化，得到物质b。
[0027]
实施例3：一种改性聚苯乙烯柱的制备方法为：按重量份计，将15份实施例1中的改性聚苯乙烯浸泡在体积分数为75%乙醇中2h，不断搅拌以除去气泡，然后装入层析柱中，用4倍体积的75%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣；再用3倍体积质量分数为5%氢氧化钠水溶液、3倍的蒸馏水、4倍体积的体积分数5%醋酸水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至ph至中性，得到改性聚苯乙烯柱。
[0028]
实施例4：一种改性聚苯乙烯柱的制备方法，与实施例3不同的是，将实施例1中的改性聚苯乙烯替换为实施例2中的改性聚苯乙烯。
[0029]
实施例5：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，包括以下步骤：（1）将10重量份海洋沉积物样本置于容器中，加入混合萃取溶剂在200w下超声提取40min，其中海洋沉积物样本与混合溶剂的重量比为1:30，混合萃取溶剂为甲醇与乙酸乙酯，其中甲醇与乙酸乙酯的体积比为1:1，过滤，得到提取液；
（2）将上述提取液旋蒸至原提取液体积的1/2，进行固相萃取；其中固相萃取步骤为：将容量为12mg的实施例3中的改性聚苯乙烯柱安装至固相萃取装置上，用7ml甲醇、7ml超纯水活化固相萃取柱，调节真空度，使上述旋蒸后的提取液以2.5ml/min的恒定流速过柱，上样完毕后，用8ml超纯水淋洗固相萃取柱，除去水样和淋洗液；将固相萃取柱置于40℃下氮吹，然后分别用8ml乙酸乙酯、8ml乙腈洗脱固相萃取柱，洗脱速度为1.5滴/s，收集洗脱液，采用甲醇定容至1ml，过滤，得到滤液；液相色谱串联质谱分析步骤如下：液相色谱条件为：流动相a：0.1%甲酸水溶液，流动相b：乙腈；其中流动相a与流动相b的体积比为20:80；柱温：32℃；进样体积：5μl；流速：0.15ml/min；质谱条件为：采用电喷雾离子源，离子源温度：120℃；多反应检测模式正、负离子模式；去溶剂辅助加热温度：340℃；去溶剂气和锥孔气：氮气；去溶剂气和锥孔气流速：550l/h和45l/h；碰撞气：高纯氩气；碰撞室的压力：0.25pa。
[0030]
实施例6：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例5不同的是：步骤（2）中，将实施例3中的改性聚苯乙烯柱改为实施例4中的改性聚苯乙烯柱。
[0031]
实施例7：为了进一步提高海洋沉积物中类固醇激素的检测准确度与精密度，采取的优选措施包括：在步骤（1）中的混合萃取溶剂中加入新橙皮苷，其中混合萃取溶剂中甲醇与新橙皮苷的体积比为1~2:1，由于新橙皮苷含有醚键、羰基以及较多的羟基等活性基团，将其添加至萃取溶剂中，与甲醇起协同作用，将海洋沉积物中的类固醇激素更好的萃取出来，进而提高海洋沉积物中类固醇激素的检测准确度与精密度。
[0032]
一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例5不同的是：步骤（1）中，混合萃取溶剂为甲醇与新橙皮苷，其中甲醇与新橙皮苷的体积比为1:1。
[0033]
实施例8：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例5不同的是：步骤（1）中，混合萃取溶剂为甲醇、新橙皮苷与乙酸乙酯，其中甲醇、新橙皮苷与乙酸乙酯的体积比为1:1:1。
[0034]
实施例9：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例7不同的是：步骤（2）中，将实施例3中的改性聚苯乙烯柱改为聚苯乙烯柱；其中聚苯乙烯柱的制备方法同实施例3中的改性聚苯乙烯柱；且聚苯乙烯购自购自武汉浩荣生物科技有限公司，含量≥99%。
[0035]
实施例10：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例7不同的是：步骤（2）中，将实施例3中的改性聚苯乙烯柱改为聚苯乙烯-二乙烯苯柱；其中苯乙烯-二乙烯苯柱的制备方法同实施例3中的改性聚苯乙烯柱；且聚苯乙烯购自购自上海时代生物科技有限公司，含量≥98%。
[0036]
对比例1：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例5不同的是：步骤（2）中，将实施例3中的改性聚苯乙烯柱改为聚苯乙烯柱；其中聚苯乙烯柱的制备方法同实施例3中的改性
聚苯乙烯柱；且聚苯乙烯购自购自武汉浩荣生物科技有限公司，含量≥99%。
[0037]
对比例2：一种海洋沉积物中类固醇激素检测方法，与实施例5不同的是：步骤（2）中，将实施例3中的改性聚苯乙烯柱改为聚苯乙烯-二乙烯苯柱；其中苯乙烯-二乙烯苯柱的制备方法同实施例3中的改性聚苯乙烯柱；且聚苯乙烯购自购自上海时代生物科技有限公司，含量≥98%。
[0038]
测试表征：1. 改性聚苯乙烯红外光谱测试采用ftla-2000104型ftir傅立叶变换红外光谱仪，对聚苯乙烯和改性聚苯乙烯进行红外扫描，扫描范围为4000-500cm-1
。
[0039]
图1为实施例1中聚苯乙烯与改性聚苯乙烯的红外光谱图。由图1可以看出，聚苯乙烯在3092cm-1
、3067cm-1
附近出现的特征吸收峰为苯环上c-h的伸缩振动；在2921cm-1
、2843cm-1
附近出现的特征吸收峰为c-h的伸缩振动；而改性聚苯乙烯在1715cm-1
附近出现的特征吸收峰为c=o的伸缩振动；因此，采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得改性聚苯乙烯。
[0040]
2. 改性聚苯乙烯比表面积测试采用st-2000测定仪器比表面积和孔径测定仪对聚苯乙烯和改性聚苯乙烯的进行测试，得到比表面积。
[0041]
表1 聚苯乙烯和改性聚苯乙烯的比表面积由表1可以看出，实施例1与实施例2中的改性聚苯乙烯的比表面积高于395m2/g，高于实施例1中聚苯乙烯的比表面积；这说明本发明采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得的改性聚苯乙烯具有较大的比表面积，进而具有较高的吸附容量。
[0042]
3.目标化合物的质谱分析数据采用实施例5中的质谱分析参数对目标化合物进行质谱测试。
[0043]
表2目标化合物的质谱分析数据
由表2可以看出，各目标化合物的质谱分析数据中的分子离子峰与保留时间。
[0044]
图2、图3分别为esi
+
与esi-模式下8种激素的mrm色谱图；由图2、图3可以看出，没有其他杂峰出现，说明采用本发明中的液相色谱串联质谱分析步骤能够较好地检测出类固醇激素。
[0045]
4.类固醇激素线性方程与检出限取类固醇激素的混标储备液，分别配制成浓度为1μg、5μg、15μg、45μg、90μg、180μg的混合标准溶液，并根据实施例5中液相色谱串联质谱分析步骤进行检测，每个浓度重复3次，绘制标准曲线；分别以3倍信噪比(s/n)和10倍信噪比(s/n)计算方法的检测限和定量限。
[0046]
表3 类固醇激素的线性曲线、检测限和定量限由表3可以看出，采用实施例5中的液相色谱串联质谱分析步骤对7种类固醇激素进行检测，该7种类固醇激素均表现出较好的线性范围，且其检测限范围为0.09~6.92ng/g，定量限范围为2.83~28.73ng/g，即具有较低的检测限，灵敏度较好，得到激素检测要求。
[0047]
5.方法回收率与精密度测试采用gbw07314海洋沉积物分析标准物质（购自武汉睿辰标物科技有限公司）；向海洋沉积物分析标准物质中分别添加30ng/g的8种类固醇激素（睾酮、宝龙酮、雄烯二酮、表雄酮、孕烯醇酮、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇），每个浓度重复5次；采用实施例5~10、对比例1-2的检测方法进行检测，并计算加标回收率与rsd值。
[0048]
表4 类固醇激素的加标回收率和rsd值
由表1可以看出，实施例5与实施例6的7中类固醇激素的加标回收率范围为98.6~107.16%，rsd值为1.17~2.58%，即本发明建立的对海洋沉积物中类固醇检测方法具有较好的精密度和准确度；对比实施例5与对比例1、对比例2，实施例5的加标回收率高于对比例1、对比例2，且rsd值低于对比例1、对比例2，这说明采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得改性聚苯乙烯，将其作为固相萃取柱的成分，对海洋沉积物中类固醇激素进行检测，提高了类固醇激素的检测精密度和准确度。
[0049]
表5类固醇激素的加标回收率和rsd值由表5可以看出，实施例7与实施例8中类固醇激素的加标回收率范围为101.81~110.27%，rsd值为0.96~2.24%；根据表4与表5的实验数据，对比实施例5与实施例7、实施例8，实施例9、实施例10与对比例1、对比例2，实施例7、实施例8的加标回收率高于实施例5，且rsd值低于实施例5，实施例9的加标回收率高于对比例1，rsd值低于对比例1，实施例10的加标回收率高于对比例2，rsd值低于对比例2，这说明混合萃取溶剂中添加新橙皮苷，由于新橙皮苷含有醚键、羰基以及较多的羟基等活性基团，将其添加至萃取溶剂中，与甲醇起协同作用，进一步提高了类固醇激素的检测精密度和准确度。
[0050]
6.方法应用
选取广西近岸海域中海洋沉积物，并采用实施例5-10、对比例1-2的检测方法对海洋沉积物中的类固醇激素进行检测（nd表示未检出）。
[0051]
表6 海洋沉积物中类固醇激素浓度(ng/g)由表6可以看出，实施例5与实施例6中对海洋沉积物中类固醇激素的检测浓度较高，即本发明建立的对海洋沉积物中类固醇检测方法具有较好的检测准确性；对比实施例5与对比例1、对比例2，实施例5对海洋沉积物中类固醇激素的检测浓度高于对比例1、对比例2，这说明采用苯乙烯、二乙烯基苯与n-(4-乙烯苯)顺丁烯二酰亚胺聚合制得改性聚苯乙烯，将其作为固相萃取柱的成分，对海洋沉积物中类固醇激素进行检测，提高了类固醇激素的检测准确度。
[0052]
表7 海洋沉积物中类固醇激素浓度(ng/g)由表6与表7可以看出，对比实施例5与实施例7、实施例8，实施例9、实施例10与对比例1、对比例2，实施例7、实施例8的类固醇激素浓度高于实施例5，实施例9的类固醇激素浓度高于对比例1，实施例10的类固醇激素浓度高于对比例2，这说明混合萃取溶剂中添加新橙皮苷，由于新橙皮苷含有醚键、羰基以及较多的羟基等活性基团，将其添加至萃取溶剂中，与甲醇起协同作用，进一步提高了类固醇激素的检测准确度。
[0053]
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
[0054]
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。