一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法与流程

1.本发明涉及物质检测分离技术领域，尤其涉及一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法。


背景技术：

2.类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类的黄色、橙红色或红色的色素之中。它是含40个碳的类异戊烯聚合物，即四萜化合物。典型的类胡萝卜素是由8个异戊二烯单位首尾相连形成。类胡萝卜素的颜色因共轭双键的数目不同而变化。共轭双键的数目越多，颜色越移向红色。类胡萝卜素是体内维生素a的主要来源，同时还具有抗氧化、免疫调节、抗癌、延缓衰老等功效。目前现有的高效液相色谱法检测到类胡萝卜素含有大量的叶黄素、玉米黄质以及角黄素，但是它们在液相中保留时间几乎一致，并且还有其他未知类胡萝卜素类同系物混在一起无法分离。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法。本发明提供的方法能够将类胡萝卜素中的玉米黄质以及角黄素成功分离。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法，包括以下步骤：
6.将类胡萝卜素溶解于低级醇中，得到类胡萝卜素溶液；
7.利用超临界流体色谱对所述类胡萝卜素溶液进行分离，得到玉米黄质和角黄质；
8.所述超临界流体色谱的参数包括：
9.色谱柱包括改性硅胶柱；
10.所述改性硅胶柱的填料为表面键合氨基、苯基、氰基、二醇基、c18p或c18c的硅胶；
11.所述色谱柱为单根色谱柱或双根色谱柱串联使用；
12.流动相体系包括流动相a和流动相b；
13.所述流动相a为超临界二氧化碳，所述流动相b为低级醇；
14.梯度洗脱的过程中，所述流动相a和流动相b的体积比为0～95：100～5。
15.优选地，所述低级醇包括甲醇或乙醇。
16.优选地，梯度洗脱20min内，所述超临界二氧化碳的体积分数为90％～80％；20～40min内，所述超临界二氧化碳的体积分数为80％。
17.优选地，所述超临界流体色谱的检测器为pad检测器；所述pad检测器的检测波长为474nm。
18.优选地，当所述改性色谱柱的填料为表面键合c18c的硅胶时，梯度洗脱的程序为：
19.0min：超临界二氧化碳的体积分数为95％，甲醇的体积分数为5％；
20.0～15min：超临界二氧化碳的体积分数由95％匀速变为65％；
21.15～25min；超临界二氧化碳的体积分数维持65％；
22.25～35min：超临界二氧化碳的体积分数由65％匀速变为0％。
23.优选地，当所述改性色谱柱的填料为表面键合苯基的硅胶时，梯度洗脱的程序为：
24.0min：超临界二氧化碳的体积分数为95％，甲醇的体积分数为5％；
25.0～10min：超临界二氧化碳的体积分数由95％匀速变为90％；
26.10～20min；超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为65％；
27.20～25min；超临界二氧化碳的体积分数维持65％。
28.优选地，当所述色谱柱为：填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱时，梯度洗脱的程序为：
29.0min：超临界二氧化碳的体积分数为90％，甲醇的体积分数为10％；
30.0～20min：超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为80％；
31.20～40min；超临界二氧化碳的体积分数维持80％。
32.优选地，当所述色谱柱为：填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱时，梯度洗脱的程序为：
33.0min：超临界二氧化碳的体积分数为90％，甲醇的体积分数为10％；
34.0～20min：超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为80％；
35.20～40min；超临界二氧化碳的体积分数维持80％。
36.优选地，所述色谱柱的尺寸包括4.6
×
250mm、10
×
250mm、20
×
250mm或50
×
250mm。
37.本发明提供了一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法，包括以下步骤：将类胡萝卜素溶解于低级醇中，得到类胡萝卜素溶液；利用超临界流体色谱对所述类胡萝卜素溶液进行分离，得到玉米黄质和角黄质；所述超临界流体色谱的参数包括：色谱柱包括改性硅胶柱；所述改性硅胶柱的填料为表面键合氨基、苯基、氰基、二醇基、c18p或c18c的硅胶；所述色谱柱为单根色谱柱或双根色谱柱串联使用；流动相体系包括流动相a和流动相b；所述流动相a为超临界二氧化碳，所述流动相b为低级醇；梯度洗脱的过程中，所述流动相a和流动相b的体积比为0～95：100～5。本发明提供的方法以超临界二氧化碳和低级醇作为流动相，色谱柱包括改性硅胶色谱柱；所述改性硅胶色谱柱的填料为表面键合氨基、苯基、氰基、二醇基、c18p或c18c的硅胶；所述色谱柱为单根色谱柱或双根色谱柱串联使用；可实现类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的分离以及半制备，其分离时间短，分离效果好。
附图说明
38.图1为实施例1中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图；
39.图2为实施例2中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图；
40.图3为实施例3中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图；
41.图4为实施例4中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图；
42.图5为实施例4中收集到的2号和浓度为5mg/ml的角黄质标准溶液的hplc谱图；
43.图6为实施例4中收集到的5号和浓度为5mg/ml的玉米黄质标准溶液的hplc谱图；
44.图7为实施例5中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图；
45.图8为实施例6中类胡萝卜素溶液利用超临界流体色谱得到的分离谱图。
具体实施方式
46.本发明提供了一种超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法，包括以下步骤：
47.将类胡萝卜素溶解于低级醇中，得到类胡萝卜素溶液；
48.利用超临界流体色谱对所述类胡萝卜素溶液进行分离，得到玉米黄质和角黄质；
49.所述超临界流体色谱的参数包括：
50.色谱柱包括改性硅胶柱；
51.所述改性硅胶柱的填料为表面键合氨基、苯基、氰基、二醇基、c18p或c18c的硅胶；
52.所述色谱柱为单根色谱柱或双根色谱柱串联使用；
53.流动相体系包括流动相a和流动相b；
54.所述流动相a为超临界二氧化碳，所述流动相b为低级醇；
55.梯度洗脱的过程中，所述流动相a和流动相b的体积比为0～95：100～5。
56.在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
57.本发明将类胡萝卜素溶解于低级醇中，得到类胡萝卜素溶液。
58.在本发明中，所述低级醇优选包括甲醇或乙醇，进一步优选为甲醇。
59.在本发明中，所述类胡萝卜素溶液的浓度优选为40～50mg/ml。
60.得到类胡萝卜素溶液后，本发明利用超临界流体色谱对所述类胡萝卜素溶液进行分离，得到玉米黄质和角黄质。
61.在本发明中，所述超临界流体色谱的流动相体系包括流动相a和流动相b；所述流动相a为超临界二氧化碳，所述超临界二氧化碳在通过泵时的温度优选为5～10℃，密度优选为890～950kg/m3。在本发明中，所述流动相b为低级醇，所述低级醇优选包括甲醇或乙醇，进一步优选为甲醇。
62.梯度洗脱的过程中，所述流动相a和流动相b的体积比为0～95：100～5；进一步优选为：梯度洗脱20min内，所述超临界二氧化碳的体积分数优选为90％～80％；20～40min内，所述超临界二氧化碳的体积分数优选为80％。
63.在本发明中，所述超临界流体色谱的参数包括：
64.色谱柱包括改性硅胶柱；所述改性硅胶柱的填料为表面键合氨基、苯基、氰基、二醇基、c18p或c18c的硅胶；优选为：填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶柱单根使用、填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶柱单根使用、填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱、填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱，进一步优选为：填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱、填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱，更优选为填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱。
65.在本发明中，当所述改性色谱柱的填料为表面键合c18c的硅胶时，梯度洗脱的程
序优选为：
66.0min：超临界二氧化碳的体积分数为95％，甲醇的体积分数为5％；
67.0～15min：超临界二氧化碳的体积分数由95％匀速变为65％；
68.15～25min；超临界二氧化碳的体积分数维持65％；
69.25～35min：超临界二氧化碳的体积分数由65％匀速变为0％。
70.在本发明中，当所述改性色谱柱的填料为表面键合苯基的硅胶时，梯度洗脱的程序优选为：
71.0min：超临界二氧化碳的体积分数为95％，甲醇的体积分数为5％；
72.0～10min：超临界二氧化碳的体积分数由95％匀速变为90％；
73.10～20min；超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为65％；
74.20～25min；超临界二氧化碳的体积分数维持65％。
75.在本发明中，当所述色谱柱为：填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱时，梯度洗脱的程序优选为：
76.0min：超临界二氧化碳的体积分数为90％，甲醇的体积分数为10％；
77.0～20min：超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为80％；
78.20～40min；超临界二氧化碳的体积分数维持80％。
79.在本发明中，当所述色谱柱为：填料为表面键合苯基的硅胶的改性硅胶色谱柱串联填料为表面键合c18c的硅胶的改性硅胶色谱柱时，梯度洗脱的程序优选为：
80.0min：超临界二氧化碳的体积分数为90％，甲醇的体积分数为10％；
81.0～20min：超临界二氧化碳的体积分数由90％匀速变为80％；
82.20～40min；超临界二氧化碳的体积分数维持80％。
83.在本发明中，所述超临界流体色谱的色谱柱的柱温优选为30～35℃，进一步优选为35℃。
84.在本发明中，所述超临界流体色谱的背压优选为12mpa。
85.在本发明中，所述超临界流体色谱的检测器优选为pad检测器；所述pad检测器的检测波长优选为474nm。
86.在本发明中，所述超临界流体色谱的色谱柱的尺寸优选包括4.6
×
250mm、10
×
250mm、20
×
250mm、50
×
250mm或100
×
250mm。
87.在本发明中，当所述超临界流体色谱的色谱柱的尺寸优选为4.6
×
250mm，所述流动相体系的流速优选为3ml/min，进样体积优选为50～100μl，进一步优选为100μl。
88.在本发明中，当所述超临界流体色谱的色谱柱的尺寸优选为10
×
250mm，所述流动相体系的流速优选为10ml/min，进样体积优选为150～200μl，进一步优选为200μl。
89.在本发明中，当所述超临界流体色谱的色谱柱的尺寸优选为20
×
250mm，所述流动相体系的流速优选为40ml/min，进样体积优选为800μl。
90.在本发明中，当所述超临界流体色谱的色谱柱的尺寸优选为50
×
250mm，所述流动相体系的流速优选为250ml/min，进样体积优选为5ml。
91.下面结合实施例对本发明提供的超临界流体色谱分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
92.实施例1
93.选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为4.6
×
250mm，流动相体系的流速为3ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为100μl，检测波长为474nm。
94.表1为实施例1的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
95.表1实施例1中sfc分离条件
[0096][0097]
实施例1对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置成40mg/ml的类胡萝卜素溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera c18c 5μm 4.6
×
250mm作为色谱柱，按照表1控制流动相中超临界二氧化碳和甲醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃，对类胡萝卜素溶液进行分离，其分离效果图如图1所示。从图1可以看出：nucifera c18c色谱柱可以实现类胡萝卜素的分离。
[0098]
实施例2
[0099]
选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为4.6
×
250mm，流动相体系的流速为3ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为100μl，检测波长为474nm。
[0100]
表2为实施例2的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
[0101]
表2实施例2中sfc分离条件
[0102]
[0103][0104]
实施例2对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置成浓度为40mg/ml的类胡萝卜素溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera phenyl 5μm 4.6
×
250mm作为色谱柱，按照表2控制流动相中超临界二氧化碳和甲醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃；对类胡萝卜素溶液进行分离，其分离效果图如图2所示。从图2可以看出：nucifera phenyl可以实现类胡萝卜素的分离。
[0105]
实施例3
[0106]
选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为10
×
250mm，流动相体系的流速为10ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为200μl，检测波长为474nm。
[0107]
表3为实施例3的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
[0108]
表3实施例3中sfc分离条件
[0109][0110][0111]
实施例3对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置
成浓度为40mg/ml的类胡萝卜素溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera c18c和nucifera phenyl 5μm 10
×
250mm的两根色谱柱进行串联(c18c在前phenyl在后)，按照表3控制流动相中超临界二氧化碳和甲醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃；对类胡萝卜素溶液进行分离，其分离效果图如图3所示。从图3可以看出：nucifera c18c和nucifera phenyl 5μm 10
×
250mm的两根色谱柱进行串联后会产生nucifera c18c和nucifera phenyl 5μm 10
×
250mm两支色谱柱单独分离时不同的效果。
[0112]
实施例4
[0113]
选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为10
×
250mm，流动相体系的流速为10ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为200μl，检测波长为474nm。
[0114]
表4为实施例4的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
[0115]
表4实施例4中sfc分离条件
[0116][0117]
实施例4对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置成浓度为40mg/ml的类胡萝卜素溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera phenyl和nuciferac18c5μm 10
×
250mm的两根色谱柱进行串联(phenyl在前c18c在后)，按照表4控制流动相中超临界二氧化碳和甲醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃。对类胡萝卜素进行分离，其分离效果图如图4所示。从图4可以看出：nucifera phenyl和nuciferac18c 5μm 10
×
250mm的两根色谱柱进行串联后的分离效果最佳，纯化后可以得到玉米黄质和角黄素单体。
[0118]
将玉米黄质和角黄素标准品分别用甲醇配制成浓度为5mg/ml的玉米黄质标准溶液和角黄素标准溶液。对实施例4分离得到的2号样品和5号样品及玉米黄质标准溶液和角黄质标准溶液按照表5所示的hplc检测条件进行检测。
[0119]
表5 hplc检测条件
[0120][0121]
结果如图5～6所示。从图5可以看出：经过超临界流体色谱纯化后收集的2号和5号物质分别为角黄质和玉米黄质，且纯度较高。
[0122]
实施例5
[0123]
选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为20
×
250mm，流动相体系的流速为40ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为800μl，检测波长为474nm。
[0124]
表6为实施例5的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
[0125]
表6实施例5中sfc分离条件
[0126][0127]
实施例5对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置成40mg/ml的溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera phenyl和nucifera c18c 10μm 20
×
250mm的两根色谱柱进行串联(phenyl在前c18c在后)，按照表6控制流动相中超临界二氧化碳和低级醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保
二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃。对类胡萝卜素进行分离，其分离效果图如图7所示，从图7可以看出：按照小试摸索的工艺，在nucifera phenyl 20
×
250mm和nucifera c18c 20
×
250mm色谱柱串联小试放大，放大效果较好，完全成线性关系，为工业生产奠定基础。
[0128]
实施例6
[0129]
选用的色谱仪为江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪，色谱柱规格为50
×
250mm，流动相体系的流速为250ml/min，背压设定12mpa，类胡萝卜素甲醇溶液的浓度为40mg/ml，进样体积为5ml，检测波长为474nm。
[0130]
表7为实施例6的使用超临界流体色谱(sfc)分离类胡萝卜素中玉米黄质和角黄质的方法的条件。
[0131]
表7实施例6中sfc分离条件
[0132][0133]
实施例6对应的具体步骤为：现将类胡萝卜素样品溶解在甲醇中，超声助溶，配置成40mg/ml的溶液，在江苏汉邦科技有限公司超临界流体色谱仪上，选用nucifera phenyl和nucifera c18c 10μm 50
×
250mm的两根色谱柱进行串联(phenyl在前c18c在后)，按照表7控制流动相中超临界二氧化碳和低级醇的体积比、总流速，背压和色谱柱柱温，同时确保二氧化碳进入泵时的温度为5～10℃。对类胡萝卜素进行分离，其分离效果图如图8所示。从图8可以看出：在使用nucifera phenyl 50
×
250和nucifera c18c 10μm 50
×
250mm色谱柱串联工业级sfc制备色谱进行放大生产，可以达到很好的线性放大效果，和小试、半制备实验结果一致。
[0134]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。