一种单硝酸异山梨酯中甲醛的检验方法与流程

1.本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种单硝酸异山梨酯中甲醛的检验方法。


背景技术：

2.单硝酸异山梨酯是硝酸异山梨酯的活性代谢产物，药理作用与母体化合物相似，能扩张静脉血管、降低静脉血液回流和心脏负荷、促进心肌供氧需氧平衡，临床广泛用于冠心病、心绞痛预防及心肌梗死后续心绞痛，是新一代硝酸酯类抗心绞痛药物。
3.单硝酸异山梨酯合成工艺中用到了二氯甲烷溶剂和氢氧化钠，二氯甲烷在强碱作用下可能会产生甲醛，可能残留在单硝酸异山梨酯中，甲醛已被世界卫生组织和美国环境保护局确定为潜在危险致癌物与重要的环境污染物，参考ich.m7，甲醛的ttc值为1.35μg/天，而单硝酸异山梨酯最大日剂量为120mg，根据公式限度= ttc /最大日剂量，计算得到甲醛在成品单硝酸异山梨酯中的限度为11.25ppm，为保证单硝酸异山梨酯的产品质量，需要对合成工艺中可能存在于单硝酸异山梨酯中的甲醛进行有效控制。
4.目前，关于甲醛的检测方法有分光光度法、气相色谱法、气相色谱质谱联用法和液相色谱法等，光度法设备简单灵活，但存在灵敏度不高、定性不准确、操作繁琐且选择性不强等缺点，气相色谱法，由于甲醛在气相色谱中出峰较快，杂质干扰大，气相色谱质谱联用法定性、定量准确，但仪器价格昂贵，难以推广使用，而高效液相色谱法可以弥补光度法上述缺陷，其分离能力和选择能力均很强。
5.目前，还未有文献报道关于单硝酸异山梨酯中甲醛的检测方法，本发明首次公开了采用衍生溶液进行柱前衍生化，优化检测参数，检测单硝酸异山梨酯中甲醛的含量，为解决单硝酸异山梨酯中甲醛的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确、检测限低的检测方法，该方法能检测单硝酸异山梨酯中甲醛的含量，从而有效保障用药安全，便于单硝酸异山梨酯的质量控制。


技术实现要素：

6.本发明提供一种单硝酸异山梨酯中甲醛的检验方法，为解决单硝酸异山梨酯中甲醛的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确的检测方法，该方法能检测单硝酸异山梨酯中甲醛的含量，从而有效保障用药安全，便于单硝酸异山梨酯的质量控制，该方法便捷、高效、准确，在系统适用性、重复性、专属性、准确度方面完全符合中国药典方法验证的指导原则，可用于单硝酸异山梨酯的质量控制。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种单硝酸异山梨酯中甲醛的检验方法，其特征在于，使用液相色谱法测定单硝酸异山梨酯中甲醛含量，所述检测方法包括以下步骤：（1）配制溶液，分别配制空白溶液、衍生溶液、灵敏度溶液、参比溶液和测试溶液。
8.（2）测定方法：采用液相色谱法测定单硝酸异山梨酯中甲醛含量，待系统稳定后，
分别进空白溶液、灵敏度溶液、参比溶液和测试溶液，记录色谱图；色谱条件如下:色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱，流速：0.8ml/min，检测波长：360nm，进样量：10μl，柱温：30℃，以乙腈：水体系为流动相，采用梯度洗脱。
9.进一步的，所述色谱柱为agilent zorbax sb-c18 4.6
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150mm，5μm或效能相当的色谱柱；所述衍生溶液为2，4-二硝基苯肼衍生溶液，称取适量2，4-二硝基苯肼，置于容量瓶中，加入适量稀释液，再加入适量 85%磷酸溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀备用，避光；所述稀释液为乙腈；所述空白溶液：取容量瓶，加稀释液适量，在加入适量衍生溶液，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热后，放冷至室温；甲醛储备液：取容量瓶，加稀释液适量，移取适量甲醛溶液置于该容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；所述参比溶液：取容量瓶，加稀释液适量，移取适量甲醛储备液，量取适量2，4-二硝基苯肼衍生溶液置于该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热后，放冷至室温；所述灵敏度溶液：取容量瓶，加稀释液适量，移取适量甲醛储备液置于该瓶中，量取适量2，4-二硝基苯肼衍生溶液置于该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热后，放冷至室温；所述测试溶液：取适量单硝酸异山梨酯样品，精密称定，置于容量瓶中，加适量稀释液溶解，量取适量2，4-二硝基苯肼衍生溶液置于该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热后，放冷至室温。
10.进一步的，所述流动相梯度过程如下：为了确保此方法的准确性，对此方法进行方法学验证：系统适用性、专属性、检测限和定量限、线性和范围、精密度和溶液稳定性，其方法学验证结果如下：
本发明首次公开了采用衍生溶液进行柱前衍生化，优化检测参数，检测单硝酸异山梨酯中甲醛的含量检测方法，为解决单硝酸异山梨酯中甲醛的检测问题，提供了一种便捷、高效、准确、检测限低的检测方法，该方法能检测单硝酸异山梨酯中甲醛的含量，从而有效保障用药安全，便于单硝酸异山梨酯的质量控制。
附图说明
11.图1为本发明空白溶液图谱图2为本发明参比溶液图谱图3为本发明测试溶液图谱图4为本发明系统适用性图谱
具体实施方式
12.以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
13.实施例1：（1）配制溶液：稀释液：乙腈；2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液：称取dnph约0.1g，精密称定，置200ml量瓶中，加入适量稀释液，再加入3ml 85%磷酸溶解，加稀释液稀释至刻度，摇匀备用，避光。（浓度：0.5mg/ml）空白溶液：取50ml量瓶，加稀释液适量，移取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液1.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。
14.甲醛储备液：取20ml量瓶，加稀释液适量，精密移取甲醛标准溶液（10mg/ml）1.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；取200ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述溶液9.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；取200ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述溶液10.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀。（浓度：1.125μg/ml）参比溶液（甲醛定位溶液）：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液10.0ml，移取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.1125μg/ml）灵敏度溶液：取50ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液5.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；取20ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述溶液5.0ml，移取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.4ml，置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.0281μg/ml）测试溶液：取单硝酸异山梨酯样品约0.5g，精密称定，置50ml量瓶中，加适量稀释液溶解，移取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液1.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：单硝酸异山梨酯10mg/ml）测试溶液（加标）：取单硝酸异山梨酯样品约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释液溶解，精密移取上述甲醛储备液1.0ml，量取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温；同法配制6份。（浓度：甲醛0.1125μg/ml、单硝酸异山梨酯10mg/ml）loq溶液：根据灵敏度溶液所得甲醛的s/n值，调节稀释比例至甲醛的s/n值≥10；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温；同法配制6份。
15.lod溶液：精密移取loq溶液3.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml，置10ml容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。
16.线性50%溶液：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液5.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.0563μg/ml）线性80%溶液：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液8.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.0900μg/ml）
线性100%溶液：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液10.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.1125μg/ml）线性120%溶液：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液12.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.1350μg/ml）线性150%溶液：取100ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液15.0ml，量取2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液2.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.1688μg/ml）准确度loq储备液：取量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液适量，同置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制3份。
17.准确度100%储备液：取20ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液10.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制3份。（浓度：0.5625μg/ml）准确度150%储备液：取20ml量瓶，加稀释液适量，精密移取上述甲醛储备液10.0ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀；同法配制3份。（浓度：0.5625μg/ml）准确度loq溶液：取单硝酸异山梨酯样品约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释液溶解，精密移取上述准确度loq储备液适量，量取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温；同法配制3份。（浓度：甲醛loq浓度、单硝酸异山梨酯10mg/ml）准确度100%溶液：取单硝酸异山梨酯样品约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释液溶解，精密移取上述准确度100%储备液2.0ml，量取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温；同法配制3份。（浓度：甲醛0.1125μg/ml、单硝酸异山梨酯10mg/ml）准确度150%溶液：取单硝酸异山梨酯样品约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释液溶解，精密移取上述准确度150%储备液3.0ml，量取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温；同法配制3份。（浓度：甲醛0.1688μg/ml、单硝酸异山梨酯10mg/ml）选择性溶液：取单硝酸异山梨酯样品约0.1g，精密称定，置10ml量瓶中，加适量稀释液溶解，精密移取上述甲醛储备液1.0ml，量取上述2，4-二硝基苯肼（dnph）衍生溶液0.2ml置该瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，密封；置水浴60℃中加热30min后，放冷至室温。（浓度：甲醛0.1125μg/ml、单硝酸异山梨酯10mg/ml）（2）色谱条件：仪器：高效液相色谱仪。
18.色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱（如：agilentzorbaxsb-c184.6
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150mm，5μm或效能相当的色谱柱）；流速：0.8ml/min；检测波长：360nm；进样量：10μl；柱温：30℃；梯度表：
（3）测定方法：待系统稳定后，进空白溶液1针，灵敏度溶液1针，参比溶液6针，测试溶液1针，记录色谱图。
19.计算：结果（ppm）=(ru/rs)
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(cs/cu)其中：ru：测试溶液中甲醛的峰面积；rs：6针参比溶液中甲醛的平均峰面积；cs：参比溶液中甲醛的浓度（μg/ml）；cu：测试溶液的浓度（g/ml）。
20.实施例2：系统适用性系统适用性是通过测定灵敏度溶液中甲醛的s/n值以及6针参比溶液中甲醛峰面积的rsd而实现的；要求灵敏度溶液中甲醛的s/n值应≥10，6针参比溶液中甲醛峰面积的rsd应≤10.0%。
21.实施例3：专属性专属性是通过测定空白溶液对甲醛检测有无干扰，选择性溶液中甲醛与相邻峰之间的分离度而实现的。要求空白溶液对甲醛检测应无干扰，选择性溶液中甲醛与相邻峰之间的分离度应≥1.2。
22.实施例4：精密度重复性：重复性是通过测定6份测试溶液（加标）中甲醛测定结果的rsd而实现，要求6份测试溶液（加标）中甲醛测定结果的rsd应≤10.0%。
23.实施例5：检测限和定量限检测限是通过检测其响应信号与噪声之比（s/n）≥3而得到的，定量限是通过检测其响应信号与噪声之比（s/n）≥10而得到的。在该浓度水平，重复考察6份loq溶液，要求6份loq溶液中甲醛单位浓度峰面积的rsd应≤10.0%；loq
甲醛
≤3.375ppm，s/n
甲醛
≥10；且lod
甲醛
＜loq
甲醛
，s/n
甲醛
≥3。
24.实施例6：线性和范围甲醛在loq~150%限度浓度范围内选6个浓度点，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标画曲线，要求在loq~150%限度浓度范围内应呈线性，曲线的线性相关系数的平方（r2）应≥0.99，y轴截距的绝对值应在100%浓度响应值的25%以内。
25.实施例7：准确度准确度是通过测定被测组分实测浓度和理论浓度之间的回收率和回收率的总rsd（n=9）而实现的。要求加入loq限度浓度、100%限度浓度、150%限度浓度的准确度溶液中甲醛的回收率应在80.0%~120.0%之间，回收率的总rsd（n=9）应≤10.0%。
26.实施例8：耐用性考察参比溶液、测试溶液和选择性溶液在室温放置一段时间内进样，检测结果随时间变化规律，为检测时参比溶液和测试溶液的放置时间提供依据。与0小时相比较，参比溶液在室温下放置24小时内，甲醛的回收率为95.5%~100.0%，参比溶液在室温下放置24小时内稳定；测试溶液0hr未检出甲醛，测试溶液在室温放置24小时内，仍未检出甲醛，测试溶液在室温下放置24小时内稳定；选择性溶液在室温下放置24小时内，甲醛的回收率为95.2%~99.8%，选择性溶液在室温下放置24小时内稳定。（标准规定：与0小时相比较，参比溶液在室温放置一段时间内，甲醛的回收率应在90.0%~110.0%之间，则参比溶液在考察期间内稳定；（1）若测试溶液0hr有检出甲醛，测试溶液在室温放置一段时间内，测定结果变化值在限度的20%以内，则测试溶液在室温考察期间稳定；（2）若测试溶液0hr未检出甲醛，测试溶液在室温放置一段时间内，仍未检出甲醛，则测试溶液在室温考察期间稳定；选择性溶液在室温放置一定时间内，甲醛的回收率应在80.0%~120.0%之间，则选择性溶液在考察期间内稳定）。