双标记gFET的制备及其在miRNA检测中的应用

双标记gfet的制备及其在mirna检测中的应用
技术领域
1.本技术属于生物传感器技术领域，具体地，本技术提供了一种双标记石墨烯场效应晶体管的制备及其在mirna检测中的应用。


背景技术：

2.mirna调控网络在人体的生长、代谢、免疫防御等一系列的生命过程中起着重要的作用。大多数疾病的发生发展过程中，mirna表达水平的变化与疾病的诊断、分期、治疗及预后判断等有着密切的联系。此外，mirna的异常表达还可见于一些感染性疾病、急性组织创伤、免疫紊乱相关疾病等。因此，对mirna快速、准确的检测在疾病的预防、诊断、治疗及预后判断等方面发挥重要的作用。然而，传统的mirna检测方法主要为northern blotting、微阵列分析及qrt-pcr法。其中northern blotting曾被认为是mirna检测的金标准方法，然而由于其比较耗时、样品消耗大且灵敏度不高使得其未得到广泛的应用，不能实现对mirna超敏定量测定。mirna微阵列技术具有高通量分析的能力，但同时受制于灵敏度低、反应时间长等缺点，也未得到大面积的推广。至于qrt-pcr法，虽然足够灵敏，但存在操作复杂、耗时较长且依赖高昂仪器等缺点，同时由于mirna的链比较短，因此很难设计引物来区分较为相似的mirna序列，在mirna测定中也具有一定的缺陷。因此亟需开发新的mirna检测方法来满足临床上日益增高的需求。
3.场效应晶体管(fet)生物传感器是近年来最具潜力的生物传感器之一，因为它在检测样本时具有超灵敏和快速等特点。另外，fet芯片易于微型化和集成化，因此在实际应用方面具有更加广阔的空间。其中石墨烯场效应晶体管(gfet)充分利用了石墨烯的大的比表面积，导电性能好、电子迁移率高、生物兼容性强以及表面易于功能化等特点，使其成为生物传感器的最佳选择。目前，基于gfet的生物传感器在mirna上的检测报道相对较少，且其特异性对单碱基错配的mirna区分较低。双链特异性核酸酶(dsn)是一种能高效识别并酶切完全互补配对的dna/rna杂交双链中的dna链，而对单链dna和单/双链rna几乎没有作用的核酸酶，且具有催化效率高，对mirna的高特异性，放大检测信号等优点，在mirna的检测中应用广泛。因此，将dsn与gfet可以实现mirna的高特异性、超敏、快速的检测。同时，考虑到游离dsn从溶液中扩散至gfet表面，尤其是在较低浓度时，需要较长时间，因此对gfet进行dsn和dna探针的双标记，有望实现mirna更加快速的测定，为疾病的实时监控提供有力技术支撑。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本技术提供了一种双标记石墨烯场效应晶体管的制备方法及并将其应用在mirna检测中。对gfet的表面进行双链特异性核酸酶(dsn)和dna探针的双标记修饰，将dsn酶固定在gfet表面。使dsn周围铺有dna探针，同时每个dna探针都在dsn的空间水解范围内。利用双标记的gfet快速测定mirna的浓度时，向gfet的反应池中加入待测mirna，其与dsn附近的dna结合形成异源互补双链后，dsn可迅速水解dna探针并释放mirna，释放的
mirna可再次与其它dna探针结合并引起dna探针不断水解，进而引起电信号的变化，实现mirna的放大检测(原理如图1所示)。
5.一种双标记石墨烯场效应晶体管，其特征在于，所述双标记石墨烯场效应晶体管修饰有双链特异性核酸酶和dna探针；dsn周围铺有dna探针，个dna探针均位于dsn的空间水解范围内。
6.进一步地，所述双标记石墨烯场效应晶体管包括衬底、功能化的单层石墨烯、源/漏极及反应池；单层石墨烯平铺在衬底表面，源/漏极镀在石墨烯表面。
7.进一步地，所述衬底为si/sio2。
8.进一步地，所述双标记石墨烯场效应晶体管通过以下方法功能化：对dsn进行pbase和延长链的修饰，对dna探针进行pbase的修饰；再依据gfet中石墨烯面积的大小，加入特定数量修饰后的dsn，先完成dsn的修饰；随后再加入pbase修饰的dna探针，完成对gfet的双标记功能化。
9.进一步地，在dsn的修饰过程中，首先将pbase与延长链偶联，然后在将dsn与延长链共价偶联；
10.进一步地，dsn的修饰过程为：将50μl 10μm pbase溶液与50μl 10μm 3
’‑
nh
2-u
(50)-cooh-5’室温混合后放置12h。随后向中加入50μl 40μm edc.hcl与50μl 80μm nhs，室温混合30min。再向中加入2u dsn溶液，室温混合18h。随后透析除去多余小分子。
11.进一步地，所述dna探针的修饰过程为：将pbase溶液与修饰氨基dna探针混合后孵育；优选地，将50μl 0.1mm pbase溶液与50μl 0.1mm 3端修饰氨基dna探针混合，并室温放置12h。
12.进一步地，所述dna探针在dna一端依次连有氨基、linker和可与目标mirna完全碱基互补配对的序列，其中linker为含有不定数量的亚甲基和腺嘌呤或者胸腺嘧啶。
13.进一步地，所述双标记石墨烯场效应晶体管通过以下方法功能化：向gfet反应池中加入50μl修饰后的dsn溶液，室温放置2h并吸出；向中加入100μl修饰后的dna探针溶液，室温放置2h后洗涤；向中加入1％吐温-20溶液于室温静置2h并洗涤，完成gfet的双标记。
14.另一方面，本技术提供了使用上述双标记石墨烯场效应晶体管检测mirna的方法，其特征在于，其包括配制包括目标mirna、dsn、rnase抑制剂、dsn buffer的反应溶液；将其加入gfet的反应池内，反应，实时观察电信号的变化。
15.进一步地，所述方法包括配制总体积为20-500μl的反应溶液，其中反应体系内含有包括目标mirna、10-40u rnase抑制剂、0.1-1x dsn buffer；将其加入gfet的反应池内，与锁相或者半导体分析仪的连接，于37-60℃条件下反应10-120min，实时观察电信号的变化。
16.本技术中的：场效应晶体管和gfet、1-芘丁酸n-羟基琥珀酰亚胺酯和pbase、dsn和双链特异性核酸酶可以交换使用。
17.本技术中的延长链可以为多种形式，包括peg、多聚胸腺嘧啶、多聚腺嘌呤或者其它具有延长作用的脂肪链，其长度在10-100nm。延长链的一端连有氨基，一端连有羧基。
18.本技术的产品和方法可用于检测人体或动物体样本病原体等的诊断用途；也可以用于检测环境、食品样本等中病原体；检测非病原体的其他核酸等的非诊断用途。
附图说明
19.图1：双标记场效应晶体管放大检测mirna的传感原理图；
20.图2：检测方法对mir-10b特异性的验证结果；
21.图3：胃癌患者尿液样品中mir-10b的检测结果。
具体实施方式
22.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
23.实施例1：双标记gfet器件的制备与mirna检测
24.gfet器件的制备与双标记修饰，包括如下步骤：
25.(1)将铜基单层石墨烯切割成约3mm宽，9mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡16h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为1mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，40℃加热使其凝固。
26.(2)将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃片，放置于0.3m过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。
27.(3)利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，完成gfet的制备。
28.(4)dsn的修饰。将50μl 10μm pbase溶液与50μl 10μm 3
’‑
nh
2-u
(50)-cooh-5’室温混合后放置12h。随后向中加入50μl 40μm edc.hcl与50μl 80μm nhs，室温混合30min。再向中加入2u dsn溶液，室温混合18h。随后透析除去多余小分子。
29.(5)dna探针修饰。将50μl 0.1mm pbase溶液与50μl 0.1mm 3端修饰氨基dna探针混合，并室温放置12h。
30.(6)向gfet反应池中加入50μl修饰后的dsn溶液，室温放置2h并吸出；向中加入100μl修饰后的dna探针溶液，室温放置2h后洗涤；向中加入1％吐温-20溶液于室温静置2h并洗涤，完成gfet的双标记。
31.将双标记的gfet用于mirna的检测，测定工作曲线。其步骤如下：配制总体积为100μl的反应溶液，其中反应体系内含有不同浓度的目标mirna((0.1fm、1fm、10fm、100fm、1pm、10pm、100pm、1nm、10nm))、30u rnase抑制剂、0.5x dsn buffer。随后将其加入gfet的反应池内并与锁相连接，于37℃条件下反应40min，实时观察电信号的变化。每个标准点，重复测定三次。
32.实施例2：双标记gfet器件的制备与mirna检测方法特异性的考察
33.gfet器件的制备与双标记修饰，包括如下步骤：
34.(1)将铜基单层石墨烯切割成约4mm宽，10mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡10h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为1.5mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，60℃加热使其凝固。
35.(2)将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃片，放置于0.4m过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。
36.(3)利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，完成gfet的制备。
37.(4)dsn的修饰。将100μl 20μm pbase溶液与100μl 20μm3
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nh
2-u
(50)-cooh-5’室温混合后放置16h。随后向中加入100μl 70μm edc.hcl与100μl 100μm nhs，室温混合50min。再向中加入4u dsn溶液，室温混合20h。随后透析除去多余小分子。
38.(5)dna探针修饰。将100μl 0.15mm pbase溶液与100μl 0.15mm 5端修饰氨基dna探针混合，并室温放置18h。
39.(6)向gfet反应池中加入100μl修饰后的dsn溶液，室温放置3h并吸出；向中加入200μl修饰后的dna探针溶液，室温放置3h后洗涤；向中加入0.5％吐温-20溶液于室温静置3h并洗涤，完成gfet的双标记。
40.将双标记的gfet用于mirna的检测，验证方法的特异性。其步骤如下：配制总体积为200μl的反应溶液，其中反应体系内含有5pm目标mir-10b/mismatch 1/mismatch 2/mismatch 3(核酸序列如表1所示)、40u rnase抑制剂、0.7x dsn buffer。随后将其加入gfet的反应池内并与锁相连接，于45℃条件下反应40min，实时观察电信号的变化。每个标准点，重复测定三次。如图2所示，该方法对mir-10b有较好的特异性。
41.表1本发明中涉及到的核酸序列
[0042][0043]
实施例3：双标记gfet器件的制备与慢性肾病患者尿液中mir-10b检测
[0044]
gfet器件的制备与双标记修饰，包括如下步骤：
[0045]
(1)将铜基单层石墨烯切割成约2mm宽，8mm长的矩形小块，于丙酮中浸泡20h后洗涤。将环氧树脂胶平铺于玻璃片上，厚度为1mm，然后将切割好的石墨烯放置在环氧树脂表面，70℃加热使其凝固。
[0046]
(2)将铜基单层石墨烯背面残缺石墨烯经等离子体刻蚀后，用去离子水清洗玻璃，将上述玻璃片擦洗，放置于0.15m过硫酸铵溶液中进行刻蚀并洗涤。
[0047]
(3)利用环氧树脂和银浆对石墨烯进行封装，完成gfet的制备。
[0048]
(4)dsn的修饰。将100μl 10μmpbase溶液与100μl 10μm3
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nh
2-u
(50)-cooh-5’室温混合后放置19h。随后向中加入100μl 60μm edc.hcl与100μl 70μm nhs，室温混合45min。再向中加入2u dsn溶液，室温混合24h。随后透析除去多余小分子。
[0049]
(5)dna探针修饰。将100μl 0.16mm pbase溶液与100μl 0.16mm 5端修饰氨基dna探针混合，并室温放置20h。
[0050]
(6)向gfet反应池中加入100μl修饰后的dsn溶液，室温放置3h并吸出；向中加入150μl修饰后的dna探针溶液，室温放置3h后洗涤；向中加入0.2％吐温-20溶液于室温静置3h并洗涤，完成gfet的双标记。
[0051]
将双标记的gfet用于胃癌患者尿液中mir-10b的检测。其步骤如下：配制总体积为100μl的反应溶液，其中反应体系内含有5μl待测样品、40u rnase抑制剂、1x dsn buffer。
随后将其加入gfet的反应池内并与锁相连接，于60℃条件下反应30min，实时观察电信号的变化。每个样品重复测定三次。健康志愿者的尿液作为对比。其检测结果如图3所示，胃癌患者尿液中mir-10b的含量明显高于健康志愿者。