1.本发明涉及用于鉴定样品中的生物标志物，并且具体地说，高分子量脂质的方法。
背景技术：
：：2.帕金森病(parkinson'sdisease)(pd)是一种进行性的神经退行性疾病，目前通过观察和测量临床症状来进行诊断。pd最重要的临床症状是运动速度和幅度的降低。包含僵硬和震颤的其它症状也很常见[1]。迫切需要在出现这类临床症状之前检测pd，因为这些症状主要仅在疾病进展到脑黑质中损失超过60％的多巴胺能神经元的阶段[2]时可观察到。[0003]超过40分之1的人会在他们生命中的某个阶段患上帕金森病(pd)。pd的症状随着疾病的进展而恶化，并且由于大多数这些症状仅在神经退行性过程已经非常晚期时才能检测到，因此早期干预的机会很小。这也归因于在分子水平上对pd病因的了解有限，以及pd早期出现的病征和症状的临床变化[4]。[0004]早期的“超级嗅觉器”试点研究表明，pd受试者的皮脂具有明显的麝香气味[3]。这种超级嗅觉器已证明具有通过气味检测pd的独特能力[2]。它们具有极其敏感的嗅觉，这使他们能够检测和区分一般嗅觉能力通常无法检测到的气味。对t恤和医用纱布进行的初步测试表明，气味存在于皮脂分泌较多的区域，即上背部和前额，而腋窝不存在，这更常见于人类气味[2]。皮脂分泌过多、皮脂溢是pd的一种已知的非运动症状[5]，并且帕金森的皮肤最近被证明含有磷酸化的α-突触核蛋白，pd的分子标志[6]。与这种独特的pd气味相关的代谢物的鉴定和量化可实现对pd的快速、早期筛查，以及提供对疾病发作时发生的分子变化的洞察，并使得能够在未来对疾病进行分层。据信，除了pd以外的其它病况也会产生气味，这种气味可被检测到并用作疾病存在或不存在的指示。[0005]挥发性有机化合物(voc)通常与特征气味有关，但是一些挥发物也可能是无味的[7]。使用质谱法的挥发物(挥发性代谢物)分析已被用于医学诊断[8-12]以及分析食品如油和蜂蜜[13-15]、饮料[16]的质量以及健康和美容行业[17]。td-gc-ms已被用作挥发物分析平台，用于检测呼吸机相关性肺炎有关细菌[11]，用于区分人和动物的分解[18]，用于表征活性炭的消耗曲线[19]以及电子烟的气溶胶检测[20]。[0006]高分子量脂质可为诊断帕金森病的重要生物标志物。因此，所属领域需要一种用于鉴定例如来自帕金森病患者的生物样品的高分子量脂质的方法。[0007]虽然电喷雾电离(es)和基质辅助激光解吸电离(maldi)将质谱从物理学家的工具转变为现代科学所有领域的基本技术，尤其是生物学研究[24,25]。尽管如此，它们仍然具有某些缺点，即它们的通量和对样品制备步骤的要求，这些通常是高度特异性的并且可导致样品成分的降解。液相色谱-质谱(lc-ms)通常与esi集成(lc-esi-ms)，并且此技术是代谢组学中的主要分析方法；然而，通常需要冗长的样品制备和lc分离步骤。原位电离是质谱领域的一项最新创新，它提供了在其原生环境中分析普通样品的能力，只需极少或无需样品制备[26]。这一新的质谱领域分别在2004年末和2005年初始于解吸电喷雾电离(desi)[27]和实时直接分析(dart)[28]。这些技术以自然形式示出一种新的采样方式，其中电离过程发生在露天和室温下的仪器外部。在随后的几年中，引入了许多原位电离技术，包含2010年的纸喷雾电离质谱(psims)[26、29-31]。此后，psims已成为最流行的原位电离技术中的一种。psims在通过实时直接分析检测生物流体，如血液、尿液和csf中存在的小分子(50-800da)方面显示出其优点[32-34]。[0008]本发明的一个目的是提供一种可靠的诊断测试，其可用于鉴定或一种或多种疾病状态。技术实现要素：[0009]根据本发明的第一方面，提供一种用于鉴定样品中的一种或多种脂质的方法，所述方法包括对样品执行原位电离质谱和离子迁移质谱。[0010]所执行的原位电离质谱技术可为纸喷雾电离质谱。[0011]优选地，一种或多种脂质具有≥约700da的分子量。更优选地，一种或多种脂质具有≥约1000da的分子量。最优选地，一种或多种脂质具有≥约1200da的分子量。[0012]样品可为生物样品，如皮脂。[0013]方法可用于诊断疾病，如但不限于帕金森病、癌症或肺结核。[0014]离子迁移是一种气相分析技术，可基于离子的大小、形状和电荷分离离子。测量以漂移时间(类似于色谱中的保留时间)的形式出现，所述漂移时间对应于离子在弱电场影响下穿过充气迁移池所需的时间[35]。im与ms联接是强大的分析工具，用于对复杂混合物中存在的分子进行分离、鉴定和结构表征。因此，它是分析科学领域中广泛使用的技术。将原位电离质谱与im组合也正在进入各种应用的现代分析研究[36-39]。作为一个相当新的研究领域，它需要更多的探索来鉴定其在代谢组学以及健康和疾病研究中的效用。在这份手稿中，我们提出了一种这样的可能性。[0015]发明人已发现，原位电离质谱法与离子迁移质谱法的组合是鉴定样品中脂质的有力工具。[0016]这里证明了使用psims评估皮脂作为生物流体的新用途，以测量pd患病者代谢组内的变化。im被集成到psims中，以研究可能存在传统ms方法无法解析的异构体或同量异构物种。串联ms实验与精确质量测量组合，用于鉴定区分pd和对照样品的脂质物种。本研究报告了psims在生物流体皮脂分析中的首次应用，此外还报告了pd生物标志物发现的初步工作，其可发展为目前还没有的快速临床诊断测试。[0017]由于皮肤的非无菌环境和可能存在并影响测试结果的潜在污染物(如肥皂)，所属领域普遍存在反对使用皮脂作为生物流体进行诊断的偏见。然而，发明人已经有利地且出乎意料地发现存在于皮肤表面上的分子可用于区分患有帕金森病的个体与对照受试者。出于多种原因，使用皮脂样品来估计个体的帕金森病状态是有利的。首先，收集皮脂是一种非侵入性方法。其次，应该可直接对皮脂进行采样和分析，而无需从皮脂中制备和提取代谢物，并且因此为开发帕金森病的快速筛查/诊断测试提供了机会。这类测试可作为伴随诊断与神经保护剂治疗一起使用，以延迟帕金森病的发作或减缓其在个体中的进展。帕金森病影响全球人口老龄化，并且非侵入性诊断测试将受到全球众多公共和私人医疗保健提供者的欢迎。[0018]在某些优选的实施例中，方法包括鉴定一种或多种挥发性化合物参照对照皮脂值升高或降低。对所属领域技术人员显而易见的是，对照皮脂值通常是健康个体或被认为未患有疾病如帕金森病的个体的值。替代地，对照皮脂值可为个体对疗法有反应时的值，因为通常个体最初对疗法反应良好，但随后需要随疾病进展增加剂量或随着时间的推移将疗法转换为不同的疗法。[0019]存在于皮脂中的一种或多种分化化合物可包括至少一种或多种脂质、心磷脂、磷脂、甘油磷脂、糖脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脂肪酸、蜡状酯。[0020]一种或多种挥发性化合物可包括选自以下的一种或多种：十二烷、二十烷、二十八烷、马尿酸、十八醛、青蒿酸、紫苏醛(也称为紫苏醛(perillaldehyde或perillaaldehyde))、二甘油、乙酸己酯、3-羟基十四烷酸和/或辛醛。[0021]在某些优选的实施例中，方法包括鉴定发生以下一种或多种：紫苏醛降低；马尿酸升高；二十烷升高；和/或十八醛升高。[0022]术语“挥发性化合物”旨在意指当分离和/或进行质谱分析时容易变成蒸汽或气体的化合物。[0023]方法可用于评估个体是否患有通常很难评估的早发性帕金森病(pd)。方法还可用于评估(或持续评估)具有发展帕金森病的遗传和/或环境风险的个体。[0024]出乎意料地，发明人发现并非所有典型溶剂都适用于从皮脂中提取挥发性化合物。已经鉴定皮脂中的挥发性化合物最好使用甲醇提取。[0025]对所属领域技术人员显而易见的是，可采用多种方法来鉴定和/或量化基于皮脂的化合物。[0026]通常，质谱法(ms)可用于检测、鉴定和/或量化复杂基质(如生物样品)中的分析物(如挥发性化合物)，通常作为联用技术的一部分，例如液相色谱(lc)-ms或气相色谱(gc)-ms。因此，传统的ms电离源例如电喷雾(es)和化学电离(cl)分别是合适的。其它电离源是已知的。[0027]如果ms用于鉴定和/或量化基于皮脂的化合物，优选地，它用于鉴定》约800m/z、》约1000m/z或》约1200m/z的显著更高分子量区域中的化合物。通常，生物流体(如血液和尿液)评估《约1000m/z的较低分子量区域的化合物。本发明人首次出人意料地示出，皮脂可用作psi-ms的采样生物流体，并且它能够检测具有》约800m/z的显著更高分子量的皮肤表面分子。发明人还使用离子迁移质谱(im-ms)来进一步评估这些高分子量代谢物，并且人类皮脂的质谱出人意料地示出在由单电荷峰组成的较高质量区域(m/z约800-约2500)存在四个包络。[0028]举例来说，对于常规临床实验室和护理点应用，需要减少样品预处理和/或简化分析和/或数据解释。因此，原位电离源可能是优选的，例如解吸电喷雾电离(desi)、实时直接分析(dart)、大气固体分析探针(asap)和纸喷雾(ps)。[0029]纸喷雾是质谱分析的直接采样电离方法，包含复杂混合物。将样品(例如0.4μl)加载到三角形纸片上并用溶剂(例如10μl的甲醇:水)润湿。来自样品的离子是通过向纸施加高电压(例如3-5kvdc或4至6kvdc)产生的。通过将在纸的顶点处产生的离子引向质谱仪的入口，可对其进行质谱分析。[0030]在一个实例中，使用质谱仪进行质谱分析，所述质谱仪包括选自以下的离子源：(i)电喷雾电离(“esi”)离子源；(ii)大气压光电离(“appi”)离子源；(iii)大气压化学电离(“apci”)离子源；(iv)基质辅助激光解吸电离(“maldi”)离子源；(v)激光解吸电离(“ldi”)离子源；(vi)大气压电离(“api”)离子源；(vii)硅解吸电离(“dios”)离子源；(viii)电子轰击(“el”)离子源；(ix)化学电离(“cl”)离子源；(x)场电离(“fi”)离子源；(xi)场解吸(“fd”)离子源；(xii)电感耦合等离子体(“icp”)离子源；(xiii)快原子轰击(“fab”)离子源；(xiv)液体次级离子质谱分析(“lsims”)离子源；(xv)解吸电喷雾(“desi”)离子源；(xvi)镍-63放射性离子源；(xvii)大气压基质辅助激光解吸电离离子源；(xviii)热喷雾离子源；(xix)大气压采样辉光放电电离(“asgdi”)离子源；(xx)辉光放电(“gd”)离子源；(xxi)冲击器离子源；(xxii)实时直接分析(“dart”)离子源；(xxiii)激光喷雾电离(“lsi”)离子源；(xxiv)sonicspray电离(“ssi”)离子源；(xxv)基质辅助入口电离(“man”)离子源；(xxvi)溶剂辅助入口电离(“sam”)离子源；(xxvii)大气压固体分析探针(“asap”)离子源；(xxviii)激光消融电喷雾电离(“laesi”)离子源；(xxix)解吸大气压光电离(“dappi”)离子源；(xxx)纸喷雾(“ps”)。首选纸喷雾。[0031]本发明人已经有利地证明了热解吸-气相色谱质谱法(td-gc-ms)作为研究挥发性化合物的工具的多功能性，以及其在鉴定导致皮脂中pd的独特气味的代谢物的适用性。[0032]可以多种方式收集和储存皮脂。举例来说，可通过用医用纱布、吸水纸或棉绒擦拭个体的背部来收集皮脂。替代地，可使用如刮刀的刚性工具将皮脂从个体背部刮下，并且然后沉积在收集管或其它装置中。一般来说，皮脂在环境温度下相对稳定，因此在提取挥发性化合物之前无需进一步处理皮脂。然而，如果需要，可在提取前将皮脂与合适的保护剂或缓冲液混合。[0033]在某些实施例中，提供一种智能纸信封，所述信封可用于非侵入性地收集皮脂样品并寄回实验室，然后实验室可使用非常少量的提取溶剂直接分析纸上的样品并很快提供结果此后。[0034]方法还可包括干燥混合物。混合物可通过真空浓缩器，如speedvac浓缩器干燥。皮脂可在任何数量的不同基材上，如任何纺织纤维素介质或织物或人造表面。优选地，皮脂可在基于棉拭子、纱布、木材或纤维素的纸上。[0035]目标分析物可包括一种或多种挥发性化合物，如选自以下的一种或多种：十二烷、二十烷、二十八烷、马尿酸、十八醛或十二烷、青蒿酸、紫苏醛或双甘油、乙酸己酯或十二烷，以及3-羟基十四烷酸或辛醛。或在皮脂中发现的一类化合物，其包括选自以下的一种或多种：脂质、心磷脂、磷脂、甘油磷脂、糖脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脂肪酸、蜡状酯或磷脂酰胆碱。[0036]优选地，方法用于评估个体是否患有疾病，如帕金森病(pd)、癌症或肺结核。[0037]提取的目标分析物可用于随后的质谱分析。[0038]在本发明的另一个方面，提供一种用于鉴定样品中的一种或多种脂质的装置，所述装置包括：[0039](a)用于接收包括一种或多种脂质的样品的装置；[0040](b)用于执行原位电离质谱分析的装置；和[0041](c)用于执行离子迁移质谱分析的装置。[0042]要执行的原位电离质谱技术可为纸喷雾电离质谱。[0043]在本发明的又另一方面，提供一种用于鉴定样品中的一种或多种脂质的试剂盒，所述试剂盒包括：[0044](a)用于获得包括一种或多种脂质的样品的装置；[0045](b)用于执行原位电离质谱分析的装置；和[0046](c)用于执行离子迁移质谱分析的装置。[0047]要执行的原位电离质谱技术可为纸喷雾电离质谱。[0048]除非与本文不兼容，否则结合本发明的特定方面、实施例或实例描述的特征、整数、特性、化合物、方法、测定和装置应理解为适用于本文描述的任何其它方面、实施例或实例。在本说明书(包含任何所附权利要求书、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或工艺的所有步骤可按任何组合形式组合，但此类特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。本发明不限于任何前述实施例的细节。本发明扩展至本说明书(包含任何所附权利要求书、摘要和附图)中所公开的特征中的任一个新颖特征或任何新颖组合，或扩展至如此公开的任何方法或工艺的步骤的任一个新颖步骤或任何新颖组合。具体实施方式[0049]现在将参考附图借助于实例说明本发明的方面和实施例。进一步的方面和实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文中提及的全部文件均通过引用并入本文。[0050]图1示出pls-da分类模型(a.)pls-da预测示出帕金森样品分类的90％正确预测，其中使用5折交叉验证进行验证。(b.)pls-da模型使用置换测试进一步测试(其中输出分类是随机的；n＝26)，并且结果绘制为直方图，其示出正确分类率(ccr)的频率分布，对于置换模型产生的ccr范围在0.4至0.9之间。观察模型明显优于大多数置换模型(p《0.1)；箭头所示；[0051]图2示出感兴趣的分析物的roc曲线、箱线图和auc比较(a.)两种实验共同四种分析物的发现((i)、(iii)(v)和(vii))和验证((ii)、(iv)、(vi)和(viii))队列。括号中的数字是用2000个分层引导复制计算的置信区间，并且灰线表示随机猜测。(b.)四种共同分析物的发现和验证队列的箱线图，比较这些分析物的对数标度峰面积的平均值。(c.)分析物之间的auc比较；[0052]图3示出来自三个未使用药物的帕金森患者的对照和pd纱布gc-ms色谱图的嗅觉图，并且红色阴影区域覆盖的空白纱布示出实时gc-ms分析和使用气味端口的气味之间的重叠。图示出10到21分钟之间的保留时间，其中超级嗅觉器描述与各种峰相关的气味。19.2到21分钟之间的突出区域(右侧放大)特别令人感兴趣，因为4种化合物中有3种与气味端口结果重叠，其中超级嗅觉器将pd的气味描述为非常强烈。在同一时间窗口中，空白纱布中没有看到峰，如每个色谱图中最高峰的归一化相对峰强度所示；[0053]图4示出roc图。(a.)roc图使用来自两个队列和所有五种代谢物的组合样品生成，这在对照组和pd之间是常见的和不同的。阴影区域表示蒙特卡罗交叉验证(montecarlocrossvalidation)(mccv)使用具有多个重复的平衡子采样计算的95％置信区间。(b.)roc图使用两个队列之间共有的所有九种代谢物生成(但不一定使用学生t检验进行区分或在队列之间以相同方向表示)。每个模型都是使用pls-da构建的，对所有变量进行排序，并选择前两个重要变量作为开始。然后在每个后续模型中添加按等级的附加变量以生成roc曲线。置信区间通过蒙特卡洛交叉验证(mccv)使用具有多个重复的平衡子抽样来计算。[0054]图5示出空白纱布与在h2o:acn(50:50)中重构的样品的关系图；[0055]图6示出空白纱布与在h2o:meoh(50:50)中重构的样品的关系图[0056]图7示出在h2o:meoh(50:50)中重构的空白纱布与第1天样品与第2天样品(同一受试者)的关系图；[0057]图8示出图7的放大区域(15分钟-24分钟)；[0058]图9示出基于xcms的反卷积图；[0059]图10示出仅样品独有的特征图；[0060]图11示出甲醇9ml数据的曲线图；[0061]图12示出潜在的peg面积图；[0062]图13示出peg区域中空白中较高特征数量的图；[0063]图14示出peg区域中样品中较高特征数量的图；和[0064]图15示出小瓶的照片，展示实例3中提取方案优化的结果。(a.)使用与甲苯:甲醇(20:80)配对的甲苯重构进行纱布提取示出形成固体残留物-添加氯仿，然后离心(×2步)，允许获得澄清的上清液。(b.)甲苯纱布提取，然后是甲苯:甲醇(50:50)重构已形成固体物质。(c.)纱布拭子的folch提取(甲醇:水:氯仿)和随后对分离的氯仿层进行重构，示出形成混浊溶液，其未在水:甲醇(80:20)中重构-氯仿添加阶段随后进行超声处理和离心，改善了重构结果，但在此过程中丢失了太多样品；[0065]图16示出人类皮脂的psi-ms分析的示意图和从中记录的质谱；[0066]图17示出从whatman42和1(a)作为总离子色谱图和(b)作为平均质谱图记录的psi-ms数据的比较；[0067]图18示出(a)从人体皮脂记录的总离子色谱图，示出不同诊断离子的到达时间分布，(b)指示存在异构结构的单个离子的到达时间分布和(c)漂移时间与m/z图。红点表示相等的m/z值。放大的图像插图指示存在具有相同质量但具有不同漂移时间的物种；[0068]图19示出四个m/z值的箱线图，这些值具有统计学意义，其中p值《0.1；和[0069]图20示出表7中m/z值的m/z与漂移时间的关系图，示出pd样品中这些离子在漂移时间尺度上的分离。在对照样品中没有观察到分离。[0070]图21：x轴＝df1，y轴＝df2。主成分判别因子分析(pc-dfa)得分图显示基于检测到的m/z值的三个不同的集群使用td-gc-ms。前驱参与者是跨df1的一个独特集群，而跨df2的pd和对照之间出现小的差异。支持向量机用于从这些数据中执行机器学习，并通过留一法生成分类。模型在袋外样品上进行测试。[0071]图22示出使用a)接触和滚动转移和b)在100％etoh中快速提取从皮脂收集的质谱，清楚地指示在接触和滚动转移的情况下存在更高质量的分子(在m/z1200-2000之间)。[0072]图23示出使用纸喷雾电离从皮脂收集的放大(m/z800-1000)质谱图，示出具有14da差异的峰包络。[0073]图24示出pd、对照和前驱样品的三维dt与m/z图，示出每个类别的人产生的皮脂的分子组成存在显著差异。红色箭头指示在pd和前驱样品中观察到某些分子种类的特定漂移时间，而在对照参与者的情况下则不存在。[0074]图25：a)所选离子(m/z843.7074)的提取到达时间分布，b)和c)从10.43和6.67ms处的漂移时间峰提取的相应平均质谱。d)示出双电荷峰的放大质谱对应于二聚体物种。[0075]图26示出标准脂质a)l-α-磷脂酰胆碱、b)l-α-磷脂酰丝氨酸(钠盐)和c)18:1心磷脂的串联质谱数据，示出头部基团的碎裂作为它们用于鉴定的指纹。d-f)示出来自皮脂样品的选定m/z值(分别为760.00、839.75、865.77)的msms。所有这些选定的离子都碎裂为m/z202.23。g)示出皮脂的msms谱图，其中设置源参数，以便获得源内碎裂以从其母离子产生m/z202.23碎片，然后分离子离子以进一步碎裂。d的插图示出从皮脂收集的放大质谱图，示出与化学式c42o8h83pn的磷脂酰胆碱的精确质量匹配。[0076]图27示出m/z1500-1700区域中选定离子的ms2谱图。[0077]图28示出pd(a和b)和对照(c和d)样品的三维dt与m/z图，示出帕金森病患者产生的皮脂的分子组成存在显著差异。红色箭头表示在对照中不存在的pd样品中观察到某些分子种类的特定漂移时间。e)和f)分别对应于低漂移时间峰和高漂移时间峰的质谱。包络中的峰值为14da(f中)和7da(e中，双电荷)。标签a、b、c和d分别表示包络中的相应系列峰值。[0078]图29示出参与者队列的临床特征总结。[0079]图30示出covid-19阳性(n＝30)与阴性(n＝37)的特征火山图，标记的特征通过ms/ms验证，点按显著性缩放。[0080]图31示出诊断指标与甘油三酯水平的箱线图。[0081]图32示出covid-19阳性与阴性(所有参与者)的混淆矩阵。[0082]图33示出67名参与者的pls-da图，按covid-19阳性/阴性分类。[0083]图34示出不同群体子集的模型参数总结。[0084]图35示出covid-19阳性与阴性(患有高血压的参与者)的混淆矩阵。[0085]图36示出15名患有高血压、covid-19阳性/阴性的参与者的pls-da图。[0086]图37示出按不同子组pls-da模型的共性排序的vip分数热图。[0087]图38示出本研究中使用的质谱仪的操作条件。[0088]图39示出covid-19阳性与阴性(高胆固醇参与者)的混淆矩阵。[0089]图40示出19名接受高胆固醇治疗的参与者的pls-da图，按covid-19阳性/阴性。[0090]图41示出covid-19阳性与阴性(患有ihd的参与者)的混淆矩阵。[0091]图42示出11名接受ihd治疗的参与者的pls-da图，按covid-19阳性/阴性。[0092]图43示出covid-19阳性与阴性(患有t2dm的参与者)的混淆矩阵。[0093]图44示出19名接受t2dm治疗的参与者的pls-da图，按covid-19阳性/阴性。[0094]图45示出covid-19阳性与阴性(服用他汀类药物的参与者)的混淆矩阵。[0095]图46示出15名接受他汀类药物治疗的参与者的pls-da图，按covid-19阳性/阴性。[0096]图47至52示出实施例8中进一步讨论的附加数据。[0097]实例1-评估皮脂中是否存在帕金森病的挥发性生物标志物的实验[0098]研究参与者[0099]研究的参与者是在25个不同的nhs诊所进行的全国性招募过程的一部分。参与者是从这些站点中随机选择的。研究分三个阶段进行。前两个阶段(发现和验证)由30个样品组成(如下表1所示，对照组、药物治疗的pd参与者和未使用药物的pd受试者的混合物)。[0100][0101]表1.英国收集地点的详情。[0102]第一队列用于发现挥发物，第二个队列用于验证在第一个队列中发现的重要特征。第三队列由三名未使用药物的pd参与者组成，用于来自超级嗅觉器的气味分析。这些参与者的元数据分析如下表2所示。[0103][0104]表2.每个波形的参与者人数和元数据。(*指示对照、未使用药物和用药物治疗的pd之间的显著差异)[0105]图4还概述了研究设计。[0106]样品收集[0107]采样涉及用医用纱布擦拭每个受试者的上背部。将具有参与者上背部皮脂样品的纱布密封在背景惰性塑料袋中并运送到中心设施，在那里将它们储存在-80℃直到分析日期。[0108]td-gc-ms分析[0109]技术描述[0110]开发一种动态顶空(dhs)gc-ms方法，用于分析用于擦拭pd患者皮肤的纱布。dhs是一种使用gerstel多功能进样器(mps)进行后续gc应用的样品制备功能。dhs从液体或固体样品中提取和浓缩voc。将样品保温，同时用控制流动的惰性气体通过吸附管吹扫顶部空间。一旦提取和预浓缩完成，吸附管将使用gerstel热脱附装置(tdu)自动脱附。然后将分析物低温聚焦在gerstel冷进样系统(cis)ptv进样器上，然后转移到gc进行分析。[0111]为了将pd分子特征与pd气味相关联，将相同的设置与gerstel嗅觉检测端口(odp)组合使用。odp允许在气味化合物从gc中通过气味洗脱时对其进行检测。事实上，气流在离开所选检测器(在我们的例子中为ms)和odp之间的色谱柱时被分流，以允许在两个分析工具上同时检测。然后可获取额外的气味概况信息。语音鉴定软件和强度配准允许对色谱图进行直接注释。[0112]方法详情[0113]将纱布转移到20ml顶空瓶中，并且然后通过dhs-tdu-gc-ms进行分析。对于dhs预浓缩步骤，样品在60℃下保温5分钟，然后继续进行捕获步骤。通过保持在40℃的ta吸附剂管(德国格斯特尔(gerstel,germany))以50ml.min-1的速度吹扫500ml的样品顶空进行捕集。氮气用作吹扫气体。为了释放分析物，吸附阱在tdu中以不分流模式解吸。tdu在30℃保持1分钟，然后在720℃.min-1升温至250℃保持5分钟。解吸的分析物在cis注入器中进行低温聚焦。cis在溶剂排放模式下操作，使用的排放流量为80ml.min-1并且分流比为10。初始温度保持在10℃2分钟，然以12℃.s-1升温至250℃保持10分钟。gc分析在与配备有在el模式下操作的高效离子源(hes)的agilentmsd5977b联接的agilentgc7890b上执行。使用agilenthp-5ms超高惰性30m×0.25mm×0.25μm柱进行分离。柱流速保持在1ml.min-1。烘箱升温程序设置如下：40℃保持5分钟，10℃.min-1至170℃，8℃.min-1至250℃，10℃.min-1至260℃保持2分钟，总运行时间为31分钟。到ms的转移线保持在300℃。hes源保持在230℃，四极杆保持在150℃。msd以扫描模式运行，质量范围为30至800m/z。对于嗅觉测定方法，色谱流使用安捷伦技术毛细管流技术(配备补充气体的三通分流板)在质谱仪和gerstel嗅觉检测端口(odp3)之间分流。odp3转移线保持在100℃，鼻锥的湿度保持恒定。[0114]数据预处理和反卷积[0115]td-gc-ms数据使用proteowizard转换为开源mzxml格式。使用用r编写的内部xcms脚本分别对每个队列数据进行反卷积。通过将碎片谱与golm数据库、nist文库和fiehngcms文库中存在的化合物光谱进行匹配，为反卷积的分析物分配推定的鉴定。每个队列的结果矩阵由每个样品的变量及其各自的峰下面积组成。所有数据都针对年龄和总离子计数进行了归一化，以考虑混杂变量(见表2)。在如所述的wilcoxon-mann-whitney分析、pls-da和roc曲线产生之前，对数据进行了对数标度和帕累托标度。[0116]结果[0117]在当前研究中，样品顶空的voc在两个队列中进行测量：‑“发现”队列和“验证”队列，如使用代谢组学发现生物标志物的建议[21]，每个队列由30名受试者组成(人口统计见表2)。第三组由三名未使用药物的pd参与者组成，经由气味端口与人类超级嗅觉器一起用于质谱分析。这项主要研究证明首次描述了帕金森病中的皮肤挥发物。[0118]如所述收集、反卷积和预处理质谱数据。使用发现队列数据构建偏最小二乘判别分析(pls-da)模型(图1)。模型通过5折交叉验证(平均正确分类率(ccr)为86％)以及26次置换测试(平均置换ccr为68％，平均ccr为83％，p-值《0a)进行了验证。使用vip》1的预测变量重要性(vip)得分选择有助于分类的变量(n＝17)。验证队列数据(来自与发现阶段不同的人群)中测量的挥发物的目标是这些发现的生物标志物的存在或不存在。在验证队列数据中也发现17种代谢物中的九种(下表3)。[0119][0120]表3.假定鉴定(msi2级)并在两个不同队列中匹配的候选挥发物列表。列出的17种代谢物中有九种被选择用于进一步分析，因为它们在两组实验之间具有可接受的保留时间漂移。[0121]选择这九种常见的生物标志物进行进一步的分析和统计测试。为了从我们的发现和验证队列数据中评估这些常见生物标志物的性能，使用来自发现队列和验证队列的数据进行接受者操作特征(roc)分析。roc曲线和wilcoxon-mann-whitney检验以及对单个代谢物的倍数变化计算示出，这九种常见代谢物中有四种在发现和验证队列之间的pd中具有相似的表达，并且它们的性能也相似，如发现和验证之间的auc测量验证队列(见下表4和图2)。[0122][0123]表4.发现帕金森氏症和对照样品之间存在差异的四种挥发性代谢物的图区，在通过roc分析测量的表达和auc曲线中观察到相似的趋势。紫苏醛和二十烷在pd中分别显著下调和上调(fdr校正p《0.05)。[0124]遵循msi(代谢组学标准倡议)数据分析指南，并将鉴定分配给感兴趣的特征[22]。我们所有鉴定的特征都处于msi二级[22]。紫苏醛和二十烷在pd和两个队列中的对照(p-值《0.05)：在pd样品中观察到紫苏醛含量较低，而观察到二十烷在显著较高的水平上。尽管马尿酸和十八醛没有显著差异(p》0.05)，但两组之间的auc(图2a)和箱线图(图2b)具有可比性，示出相似的趋势。[0125]将两个队列的样品组合，从而增加了样品量并提供了更好的统计能力，同时评估了这组生物标志物的性能。roc曲线是通过monte-carlo交叉验证(mccv)使用平衡子采样生成的。在每个mccv中，三分之二的样品用于评估特征重要性。然后使用前两个、三个、五个、七个和九个重要特征来构建分类模型，并使用其余三分之一的样品进行验证。过程重复500次以计算每个模型的平均性能和置信区间。使用两个潜在变量的pls-da算法执行分类和特征排列(图4)。组合数据的结果指示数据的置信度增加(表1中的p-值和图1中的置信区间)。当从气味端口获得的嗅觉图叠加在总离子色谱图上时(图3)，可以鉴定出许多感兴趣区域(roi)。由于受试者之间的个体差异，均在其外泌体和内体，预计感知到的气味在参与者之间会有差异。然而，样品之间的几个roi始终相似，这进一步指示pd个体之间的相似性。色谱运行19和21分钟之间的roi特别令人感兴趣，因为与保留窗口之间的分析物的混合物相关的气味被描述为“非常强烈”和“麝香”‑pd的气味。在同一区域，已检测到两个队列之间四分种常见挥发物中的三种，即马尿酸、二十烷和十八醛。此处还应注意，所有这三种挥发物在pd受试者中均上调。这可能指示明一种或多种这些化合物的存在可能与pd的气味有关。[0126]从三组独立数据中获得的这些结果中，来自不同人的一个潜在因素(即pd)将他们分开，很明显，在对照组和pd参与者之间发现了几个易变特征显著不同。在药物治疗的pd参与者和未使用药物的pd参与者之间没有观察到显著差异，这指示大多数分析的挥发物可能不含药物代谢物，或皮脂可能缺乏与pd药物相关的高浓度药物代谢物。通常观察到紫苏醛和十八醛作为植物代谢物或食品添加剂。可假设，由于皮脂分泌不规则，这些脂质类疏水代谢物可能会在pd受试者的皮肤上发生改变。这类影响可能归因于代谢的直接变化，导致皮脂中如二十烷的饮食代谢物的排泄失调，或可能归因于pd皮肤的代谢变化，这可能会影响皮肤微生物群落，从而导致代谢物的产生发生变化，如马尿酸[23]。这些观察到的影响也可能是对pd生理表现的间接或次要观察。这项研究强调了对pd患者皮脂进行综合分析的潜力，并提出了可以基于其气味进行非侵入性筛查的可能性。[0127]实例2-纱布-代谢组学提取方案的优化[0128]进行了实验以优化和评估纱布浸渍样品的提取方案。[0129]提取程序[0130]提取时，添加9ml甲苯，离心管振荡1小时，纱布钩在金属丝上并离心10分钟(1500rpm)，取出干纱布。对于每次提取，将溶剂分成2×移液器(1×lc，1×gc)并使用真空离心机干燥。[0131]比较[0132]评估了以下比较：[0133]●空白纱布与在h2o:acn(50:50)中重构的样品[0134]●空白纱布与在h2o:meoh(50:50)中重构的样品[0135]●空白纱布与第1天样品与第2天样品(同一受试者)[0136]●空白与样品(与再悬浮方法无关)[0137]总共测试4个样品和2个空白。提取比较实验的细节在下表5中示出。[0138][0139]表5.[0140]图5至14示出比较实验的结果。具体地，图13示出，如果peg背景干扰信号，我们预计在此处看到更多的代谢物，因为在此图中，我们绘制了任何高2倍的峰，即被视为非常高的噪声。在怀疑高peg的同一rt区域中，信号似乎更高。这指示我们可安全地消除任何纱布相关的背景问题。[0141]图14示出peg掩盖了大约10个特征，但我们有大约一百个没被掩盖，即信噪比要高得多，并且任何可能从纱布上脱落的peg样污染都可通过这种提取来避免。[0142]实例3-提取协议优化[0143]进行实验以优化使用不同溶剂的提取方案。[0144]甲苯提取[0145]甲苯被确定为与用于去除纱布残留物的过滤器不相容。甲苯无法在真空离心机中去除-尤其是在如此大的体积中。在实验室中发现它会损坏普通真空离心机的密封件。[0146]特别是对于将程序按比例调整到大量样品时：在通风橱中蒸发是不可行的，并且将移液器(不带盖子)长时间留在公共实验室是不好的做法。虽然评估了使用加热块来加速溶剂的去除，但这并没有在较低温度下将蒸发加速到合理的速度，而且高温可能不利于样品的完整性。[0147]由于这些问题，重构组合物难以优化，并且样品之间不一致。[0148]图15a示出在甲苯:甲醇(20:80)中重构过程中形成的固体残留物。添加氯仿，然后离心(x2步)，得到澄清的上清液。[0149]图15b示出在甲苯:甲醇(50:50)中重构时形成固体物质。[0150]folch提取[0151]经评估，此溶剂组合与用于去除纱布残留物的过滤器不相容。用于lc-ms的氯仿层没有重构为水:甲醇(80:20)并形成混浊溶液[0152]虽然评估了在重构过程中添加氯仿，但需要太多体积才能存活，从而增加了离心循环次数，损失了太多样品[0153]甲醇提取[0154]在此提取方案中，测试了9ml、15ml和20ml溶剂提取体积。已经确定，较低的溶剂产生了最高的信号，并且由于纱布尺寸及其吸收的溶剂体积，需要最少9ml。[0155]通常，在有机溶剂中提取的样品可重构为有机溶剂。举例来说，在甲醇中提取然后干燥形成颗粒的样品通常应在甲醇以及乙醇、乙腈或异丙醇中重构。然而，我们发现通过我们的方案提取的脂质和脂质类分子在很长一段时间内倾向于在甲醇下不稳定。在代谢组学或lc-ms分析中，标准是用水和甲醇的各种组合(％)重构提取物。然而，这破坏我们的分析物，并在短时间内形成如上照片所示的固体残留物。即使将样品储存在环境温度和冷盘上，这也重现。评估有机溶剂的混合物，甲醇和乙醇(50:50v/v)稳定了重构的皮脂。这指示从皮脂中提取的分子是非典型的并且需要有机溶剂的组合而不是有机-水混合物或单一有机溶剂以保持在溶液中。[0156]实例4-优选的提取协议[0157]因此，确定以下提取方案具有最佳性能：[0158]q-tip提取[0159]1.将qtip的木柄卡入2ml移液器[0160]2.添加1mlmeoh[0161]3.涡旋10秒[0162]4.声波处理10分钟[0163]5.去除qtip[0164]6.离心5分钟[0165]7.将800ul移入新的移液器中(如果需要两个部分，那么分成两半)[0166]8.在真空离心机浓缩器中干燥～6小时[0167]9.储存在-80度冰箱[0168]纱布提取[0169]1)使用镊子将纱布放入50ml离心管中[0170]2)添加9ml甲醇，振荡至纱布在管底[0171]3)涡旋10秒[0172]4)声波处理30分钟[0173]5)吸管从纱管中提取甲醇[0174]6)使用注射器和过滤器使提取的溶剂进入新管中-回收～7ml[0175]7)在移液器中将其拆分为3x2ml级分[0176]8)使用真空离心机浓缩器干燥～10/12小时8)储存在-80度[0177]实例5-用于帕金森病诊断的人皮脂纸喷雾电离质谱[0178]研究参与者[0179]对于使用皮脂的纸喷雾电离质谱(psi-ms)的初始方法开发，使用了来自健康对照的样品。在从人类皮脂收集的质谱达到令人满意的重现性后，方法使用来自帕金森病参与者的样品进一步测试。这项研究的参与者是全英国28家不同nhs诊所招募过程的一部分。从当地诊所(也参与帕金森病研究)收集的来自更大募集活动的子集(65个pd和52个对照样品)用于这项工作。[0180]样品收集[0181]使用医用q-tip拭子从参与者的上/下背部无创擦拭皮脂样品。然后将带有皮脂样品的q-tip拭子固定在各自的盖子中，并用密封的信封运送到曼彻斯特大学的中央设施，在那里它们在-80°℃下储存直到分析日期。[0182]方法：纸喷雾电离质谱(psi-ms)[0183]对于所有psi-ms实验，使用市售的whatman滤纸(1级和42级)作为纸基材。通过轻轻摩擦将皮脂样品从q-tip拭子转移到纸质基材上。样品转移后，将纸切成三角形(底部5mm，高10mm)。然后用镊子将三角纸小心地夹在铜鳄鱼夹上。小心处理纸张对于避免污染很重要。铜夹在使用前通过在丙酮中超声清洗。对于每个样品，使用新的夹子和镊子来避免样品间的交叉污染。然后将夹子连接到自制的纸喷雾支架上，该支架适用于现有的质谱仪进行psi-ms测量，然后使用可调节台将支架放置在ms入口的前面。以这类方式调整支架，使纸尖与ms入口相距5-7mm。将纸三角放置在所需位置后，通过夹子对其施加2.5-3kv范围内的高压。当保持在高电位的纸用极性溶剂洗脱时，在纸的尖端观察到泰勒锥(taylorcone)形成，紧随其后的是仪器软件中可观察到的m/z信号。所有质谱均记录在50-2000m/z范围内。每个psi-ms实验的主要仪器参数设置为毛细管电压3kv、源温度100℃、采样锥30v和源偏移40v。不使用去溶剂化或锥气。[0184]使用内标[0185]为了检查不同样品的纸喷雾的重现性，使用了内标。在这些实验中，将3.5μl内标溶液点样在三角纸上并在室温下风干。按照前一段中描述的相同方法，使用干燥的三角纸对皮脂样品进行psi-ms测量。[0186]数据处理[0187]数据以waters专有格式记录。每个样品的总分析时间为2分钟内120次扫描。这120次扫描被聚合为一个单一的组合光谱。以表格形式记录每个样品的组合光谱，以便每一行都有m/z测量值和绝对离子计数。这些数据是为实验中的所有文件生成的。然后将每个文件的数据分别保存为.csv格式。[0188]使用开源统计软件r完成进一步的数据处理。编写内部脚本以将.csv文件作为数据框导入r。每个m/z分箱使用两个步骤-首先，如果m/z在样品中是独一无二的，将其保存，并且如果m/z已经在之前的样品中检测到，将其组合。生成的数据框具有所有可能的m/z在整个数据集中检测到的值。在下一步中，m/z值被四舍五入到最准确的仪器测量表示，即道尔顿质量的小数点后4位。最后，连续m/z如果它们相同并且将它们的峰面积相加，那么认为它们表示相同的离子。[0189]结果数据被组合成一个矩阵，其中每一行显示一个m/z值和总离子计数，每列表示一个样品。[0190]数据分析[0191]使用用于纸喷雾的内标峰强度评估数据再现性和质量。在所有样品中检测到内标参考峰。数据质量由内标峰比的方差系数确定。单向t检验用于确定对照和pd样品的每个变量的平均值之间的显著差异。p《0.05的每个变量都被认为是显著的，并被用于推定的鉴定。通过匹配进行推定鉴定m/z在线数据库中的值-人类代谢组数据库(hmdb)和脂质图，质量精度为20ppm。[0192]结果与讨论[0193]图16示出使用psi-ms技术分析人体皮脂样品的实验工作流程示意图。whatman1级和42级用于psi-ms分析，两张纸示出相同的结果(图17)。测试了不同的溶剂和溶剂混合物以产生稳定和可重复的喷雾。经过相当多的测试，4:1h2o/etoh被选为优化的溶剂系统，以在本特定研究中获得最佳结果。纸尖和ms进样口之间的距离也通过反复试验进行了优化。将纸尖放置在距ms入口最佳距离处后，用4.5μl溶剂对其进行洗脱。以2秒/扫描的扫描速率记录质谱两分钟。共有60次扫描用于进一步的数据分析。图16的插图示出从人体皮脂收集的表示性质谱。人体皮脂的质谱显示在较高质量区域存在三个包络(m/z1200-1800)由单电荷峰组成。psi-ms已用于检测血液、尿液等生物流体中存在的小分子。这项研究首次示出，皮脂可用作psi-ms的采样生物流体，并且能够检测皮肤具有显著更高分子量《1200m/z的表面分子。离子迁移质谱(im-ms)也被用于进一步评估这些高分子量代谢物，特别是解析构象异构体和同量异位结构异构体，正如先前报道的低分子量脂质(《自然通讯(naturecommunications)》|(2019)10：985|https://doi.org/10.1038/s41467-019-08897-5)。图18示出可从离子迁移和质谱组合中发现的增强分离和诊断特征(在较高和较低质量区域中)的实例。[0194]图18a示出关于不同离子到达时间分布的总离子色谱图。箭头表示产生的离子(被鉴定为脂质)相对于漂移时间的清晰分离。图18b示出单个离子的到达时间分布(m/z689.1)。单个漂移时间尺度上存在两个峰值m/z值表示存在异构体的可能性。图18c示出漂移时间与m/z图，其中点表示m/z值。插图中的点(分别在标记为1和2的框中)示出在漂移时间尺度上分开的m/z689.1(用方框1突出显示)和m/z1394.8(用方框2突出显示)的放大视图。此数据示出，im与psi-ms组合可用于分离从人体皮脂样品中产生的气相离子。[0195]在相同条件下记录所有参与者样品的质谱后，如前所述处理数据并进行统计分析。表6示出m/z值以及我们数据中统计上重要分子的可能分子物种。有趣的是，可能鉴定出一类称为心磷脂的分子(在表6中表示为cl)在统计上重要的分子列表中占主导地位。[0196][0197][0198][0199]表6.统计上重要的列表m/z值以及我们数据集中可能的分子物种。[0200]考虑到这些分子，在pd和对照样品之间进行了比较研究。观察到这些分子在pd皮脂中被下调。图19示出比较pd和对照样品之间的m/z1668和1520(假定鉴定为心磷脂)以及m/z1452和1454(假定鉴定为神经节苷脂)。[0201]仔细查看im-ms数据，可鉴定在pd样品中上调的许多物种。表7示出这些物种的m/z值和各自的漂移时间。[0202][0203]表7.统计上重要的m/z值列表，这些值在漂移时间方面也存在显著差异(在pd样品与对照中)。[0204]图20示出上述离子的m/z与漂移时间图(数据平均超过34个pd和30个对照样品)。箭头表示具有相同的离子m/z值，但pd样品中的漂移时间不同(对照中不存在)。此数据示出psi-ms与离子迁移相组合在帕金森病诊断中的潜力。[0205]实例6-热解吸气相色谱质谱法(td-gc-ms)[0206]仪器仪表[0207]将纱布拭子(hypacover)转移到20ml顶空小瓶中，并在戴着丁腈手套的同时使用gilson移液管尖端向下推。gerstal多用途采样器(mps)用于浓缩挥发性化合物。臂将样品从托盘输送到动态顶空(dhs)端口，在那里它们被保温并通过顶空吹扫惰性气体以收集挥发性化合物。tenax吸附剂管(德国gerstal)放置在样品瓶上方，吹扫气体流过，捕获挥发性分析物。然后将tenax运送到热解吸单元(tdu)所在的gc入口。吸附剂管通过加热解吸，挥发性化合物进入冷却进样系统(cis)，所述系统迅速升温，使分析物均匀地注入gc色谱柱。我们的qc是香味分子的混合物，其中5ul被移液到顶空小瓶中。我们无法合并样品，因此使用qc来检查仪器稳定性。[0208]方法详情[0209]在dhs中，对样品进行保温并浓缩挥发性化合物。将小瓶在80度加热10分钟。随后用流速为70ml/min的1000ml氮气吹扫。tenax吸附剂管保持在40度。然后将tenax运送到处于不分流模式的tdu。分析物在30℃的温度程序下解吸并释放到cis中1分钟，然后以720℃/min的速率达到280℃的温度并保持5分钟。cis以溶剂排放模式运行，流速为80ml/min，分流比为10。cis的温度为10℃保持0.01分钟并且以12℃/分钟升温至280℃并保持5分钟。[0210]分析中使用的gc是配备vf-5ms色谱柱(30mx250umx0.25um)和氦气作为载气的agilent7890a。柱流速为1ml/min，烘箱程序为40℃1分钟，25℃/分钟至180℃，8℃/分钟至240保持1分钟，20℃/分钟至300并保持2.9分钟。总运行时间为21分钟。gc与在el模式下运行的agilent5975ms联接。转移线保持在300℃，源保持在230，四极杆保持在150。扫描的质量范围为30-800m/z。我们的qc使用一种改进的方法运行，以优化信号和分离，同时运行尽可能短的方法：dhs在80℃下保温2分钟，并以50ml/min的速度用250ml气体吹扫。在tdu中，温度程序为30℃1分钟，然后以600℃/分钟的升温至250℃，并保持3分钟。cis的流量为60ml/min，分流比为20，温度为10℃保持0.1分钟，然后以10℃/秒的升至240℃并保持2分钟。烘箱程序为40℃保持1.5分钟，24℃/分钟至280℃并保持2分钟(总共13.5分钟)。扫描的质量范围为30-550m/z，转移线保持在280℃。[0211]数据处理[0212]td-gc-ms数据使用proteowizard转换为开源mzml格式。使用r中带有erah包的内部脚本对数据集进行反卷积，产生了分配给检测到的峰的206个特征。通过使用golm数据库将碎片谱与化合物光谱进行匹配，反卷积分析物被指定为推定的标识。所得矩阵包括变量及其对应的每个样品的峰面积。删除了所有样品中超过5％的特征。在统计分析之前，将所得数据归一化为总离子计数和对数转换。[0213]结果[0214]使用td-gc-ms生成的所有数据，每个m/z被视为单独的离子物种，并使用集群技术来鉴定组内的潜在相似性和组间的不同。使用有监督的多变量方法-主成分判别因子分析。在这种方法中，首先计算主成分以减少数据的维度，然后对这些成分进行判别分析。这提供了降维，同时仍然保持方差和区分能力，使用因子分析进行检查。图21示出观察到的三种不同表型的三个不同集群。这指示使用td-gc-ms测量的代谢物/脂质在前驱、对照和pd表型中具有明显的特征(强度或存在/不存在)。这些数据用于创建机器学习模型，即支持向量机(svm)。目的是确定这些测量的m/z分类精度在确定参与者皮脂样品的类别中。从表中可清楚地看出，此测量能够以71％和74％的正确分类率，区分前驱样品和对照样品以及前驱样品和pd样品。这指示我们能够通过皮肤拭子清楚地区分具有前驱症状但没有pd的参与者。我们注意到，主要是图22和23所示的高m/z物种，其表型明显不同。[0215]实例7-纸喷雾电离和离子迁移质谱(psi-im-ms)[0216]研究参与者[0217]最初，使用来自健康对照的皮脂样品开发了一种用于纸喷雾电离离子迁移质谱(psi-im-ms)的方法。此项目的伦理批准(iras项目id191917)由nhs健康研究局(rec参考：15/sw/0354)获得。对于临床研究数据集，从pd(15)、对照(14)和前驱参与者(15)收集皮脂样品，这些样品是在因斯布鲁克(innsbruck)的一个收集点收集的。[0218]样品收集[0219]用医用q-tip和纱布拭子从参与者的上背部擦拭皮脂样品。然后将带有样品的拭子固定在其单独的盖子/拉链锁袋中(如果是纱布)，并用密封的信封运送到曼彻斯特大学的中央设施，在那里将它们储存在-80℃直到分析日期.[0220]仪器设置[0221]对于psims测量，通过轻轻触摸将皮脂样品从q-tip拭子转移到三角纸上，然后使用镊子小心地夹在铜鳄鱼夹上。小心处理纸张对于避免污染至关重要。psims使用安装在可移动台上的自制纸喷雾源进行。将纸三角形放置在所需位置后，对其施加2.5-3kv范围内的高压。在高电位下用极性溶剂洗脱后，在纸的尖端观察到微小带电液滴的喷雾羽流，仪器软件中记录为m/z信号。所有质谱均记录在m/z50-2000。每个psims实验的主要仪器参数设置为毛细管电压3kv、源温度100℃、采样锥30v和源偏移40v。不使用去溶剂化或锥气。以2秒/扫描的扫描速率记录质谱两分钟。共有60次扫描用于进一步的数据分析。[0222]数据处理[0223]在相同条件下记录来自所有参与者样品的imms数据后，使用progenesisq1(英国威姆斯洛的沃特斯(waters,wilmslow,uk))对原始数据进行反卷积。参考数据集中的最佳候选样品，通过一组参数选择峰值拾取、对齐和面积归一化。峰值选择限制设置为自动，默认噪声水平，以平衡信噪比。色谱峰宽不适用于该直接注入数据，但之前的离子0.1在处理过程中忽略输注分钟和输注后1.4分钟，只保留可重现的信号。使用这些参数，总共找到了4150个特征。使用与人类代谢组数据库(hmdb)和lipidmaps的质量匹配对从原始数据中提取的特征进行注释。[0224]方法[0225]采用经验方法开发了一种使用psims测量皮脂样品质谱的可重现方法。方法开发的关键部分是将样品从q-tip转移到纸基材。测试了两种方法，首先，以“触摸和滚动”方法直接转移到纸三角形，然后从中记录psims，和替代地通过涡旋混合在乙醇(800pl)中采样的q-tip进行快速溶剂提取5秒。在第二种情况下，psims是从提取的溶液中测量的。图21示出使用这两种方法收集的质谱图，清楚地表明存在更高质量的分子(在m/z1200-2000之间)在接触和滚动传递质谱中(图22b)。另一方面，这些更高质量的分子在对应于溶剂提取物的质谱中不存在(图22a)。可以推测以下两个原因：提取时间太短而无法完全提取所有存在的代谢物，或由于这些较大的分子降解为较小的碎片。因此，使用psims对所有进一步的皮脂分析选择了触摸滚动方法。[0226]人体皮脂的质谱显示在较高质量区域存在三个单电荷物质包络(m/z700-1800)。这些包络是一系列相差14da的峰。放大的质谱图m/z区域800-1000在图23中示出。[0227]离子迁移质谱(imms)用于进一步评估这些高分子量代谢物，特别是解析构象异构体和同量异位结构异构体，如先前报道的低分子量脂质。有趣的是，我们可鉴定一类称为脂质的分子在统计学上重要的分子列表中占主导地位(在pd、对照和前驱组(p《0.05))分子列表中。这些是总共4150个反卷积特征中的500个特征。在分析漂移时间与m/z(dt与m/z)图的统计上重要分子时，对于某些类别的分子观察到pd、对照和前驱样品之间的显著差异(被鉴定为脂质，有关支持的数据将在后面部分讨论)。[0228]从上面的分析中，一个统计重要特征的子集(p《0.05)被鉴定为在特定的漂移时间峰值m/z仅在pd和前驱样品中存在而在对照中不存在的值。图24示出pd(蓝色框)和对照(洋红色框)和前驱(橙色框)样品的m/z700-900区域中的几个三维dt与m/z图的几个实例。红色箭头表示在pd和前驱样品中观察到某些分子种类但在对照样品中不存在的特定漂移时间(6.67ms)。图24中的峰集群表示单个离子的同位素分布。较高漂移时间(10.43ms)处的峰表示单电荷单体物质的同位素分布，在pd和前驱样品的情况下，较低漂移时间(6.67ms)处的迹线对应于具有2+电荷的二聚体物种加合物。由于离子的电荷状态是离子迁移分离的主要因素，尽管较短的dt物种是二聚体，但它通过漂移管的速度更快，漂移时间更短。图25示出提取的到达时间分布图以及所述物种在m/z843.7074的相应质谱图。呈现放大的质谱图(图25d)以证明具有6.67ms漂移时间的双电荷离子是具有10.42ms漂移时间的单电荷离子的二聚体。这三个类别之间引人注目的视觉差异表明psims与im组合作为帕金森病快速诊断工具的潜力。[0229]将统计上重要特征的m/z值与已发布的数据库进行匹配，以揭示多类脂质的假定鉴定，主要属于磷脂酰胆碱和心磷脂类。因此，进行了串联质谱研究以增加对这些假定注释的信心。对于这些实验，购买了一系列市售天然脂质，包含：l-α-磷脂酰胆碱(脑、猪)(pc)、l-α-磷脂酰丝氨酸(脑、猪)(钠盐)(ps)、14:1心磷脂和18:1心磷脂(cl)。使用psims记录这些脂质的ms/ms光谱。pc于chi3/meoh中、ps于chcl3中和cl于meoh中的1mm溶液用于串联质谱测量。图26a-c分别示出pc、ps和cl的ms2光谱。在所有情况下，都观察到碎片离子，它对应于相应脂质类别的极性头部基团的质量(图26a-c以红色突出显示)。这可以被认为是脂质类别的指纹，用于使用串联质谱法对其进行鉴定。[0230]在了解了不同脂质的碎裂模式后，ms2为选择m/z700-900区域中不同离子的皮脂样品记录光谱。图26d-f示出三个物种的实例m/z760.00、839.75和865.77，其被分离并随后使用碰撞诱导解离(cid)进行碎裂。在所有这些情况下，在m/z202.23下的碎片离子在ms2光谱中观察到，这可能对应于m/z184.08的水性加合物(pc胆碱头组)。因此，需要进一步调查m/z202.23来证明这一推测。由于我们在synaptg2-si仪器上无法进行ms3实验，实施源内碎裂方法以产生在m/z202.23下的物种的另外的碎片。在此实验中，提高温度和锥电压以促进存在于皮脂中的代谢物的源内碎裂(苛刻条件)。经证实，在m/z202.23下的此物种在这些条件下存在，并且然后使用cld对此物种进行质量分离和碎裂，这在图26g中显示。在m/z184.11处峰值的存相当于损失了18da，这对应于pc脂质头部基团的损失。此数据证明在m/z202.23处观察到的碎片离子是pc的胆碱头基团的水性加合物，并且在皮脂的psims期间在m/z700-900区域中观察到脂质分子属于磷脂酰胆碱脂质类。精确的质量测量也支持上述说法。在精确质量测量之前，使用1ppm质量误差阈值校准仪器。图26d的插图示出在m/z760.5990处的峰的放大视图，其对应于具有化学式c42o8h83pn的磷脂酰胆碱分子。还进行了更高分子量的峰的ms2。图27示出在m/z1500-1700区域中选定离子的ms2光谱(另一个具有脂质类特征的峰包络)。串联质谱显示范围为m/z750-900区域内的碎片离子峰，其与标准cl(18:1心磷脂)的碎片模式一致(图26c)。两者之间的唯一区别是在皮脂的情况下，我们在所述区域看到一系列碎片峰。此观察结果可归因于皮脂是不同分子的复杂混合物这一事实。它有可能含有多个具有密切相关化学结构的cl，这有助于观察到的碎片离子阵列。虽然碎片离子类似于极性头基的质量(图26c中的m/z296.9)在皮脂的情况下不可见，它很可能作为不同m/z值下的加合物存在。举例来说，在m/z365.29观察到的碎片离子可为[cl的头部基团+na+k+3h2o]+。为了更好地鉴定碎片离子，需要仔细的msn实验。但是，根据这些符合cl标准的更高质量分子的碎片模式，以及在线数据库搜索报告，我们推测它们是cl。从上述数据可看出，pc和cl是皮脂的重要组成部分，可使用psiimms进行鉴定，并且在参与者有帕金森症状的情况下它们是对比的。因此，psims与im组合可以作为一种有效的工具，在非常早期的阶段快速诊断帕金森病。[0231]实例8-通过皮肤快速采样观察到covid-19感染后皮脂脂质组的变化[0232]介绍[0233]sars-cov-2是一种新型冠状病毒，导致2019年冠状病毒病(covid-19)。世界卫生组织已将大规模检测鉴定为对抗covid-19以遏制疫情和减少住院的关键武器[42]。目前的检测方法需要经由聚合酶链反应(pcr)检测从上呼吸道收集的sars-cov-2病毒rna呼吸道。虽然这些类型的测试很容易部署并且对病毒具有高度选择性，但它们会遭受很大比例的假阴性事件；此外，试剂的稀缺性可能是所需测试规模的一个问题。此外，当前部署的方法不携带预后信息。[0234]测量病毒对宿主影响的方法(与直接测量病毒本身相反)可在临床或大规模测试环境中提供补充解决方案；例如，最近一项可行性研究鉴定covid-19患者的呼吸生化紊乱[43]。由于冠状病毒需要脂质进行繁殖，因此covid-19有望破坏脂质组[44]。脂质组失调的证据表明通过血浆分析在covid-19患者中观察到[45-48]；皮肤的失调也与犬科动物通过气味区分covid-19阳性和阴性的能力一致[49]。因此，脂质组学为更好地理解和潜在诊断covid-19提供了一条有希望的途径。[0235]皮脂是皮脂腺分泌的一种生物流体，富含脂质。通过轻轻擦拭富含皮脂的皮肤区域(例如面部、颈部或背部)，可轻松且无创地采集样品。先前已经从皮脂中鉴定一些疾病的特征，例如帕金森病和1型糖尿病[50-52]。此外，虽然皮脂在屏障功能中的作用机制尚未完全描述，但皮脂脂质屏障功能直接，也通过共生细菌相互作用；脂质失调将对皮肤健康产生影响[53]。在此工作中，我们探讨了患有和未患有covid-19患者的皮脂脂质谱的差异，以期探索皮脂未来作为非侵入性采样介质进行测试的用途，以及扩展对皮脂作为采样矩阵的理解。[0236]2020年5月，几个英国机构宣布打算合并资源并组建covid-19国际质谱(ms)联盟[54]。此联盟的近期目标是提供有关感染人类sars-cov-2的分子水平信息，远期目标是了解新型冠状病毒对代谢途径的影响，以便更好地诊断和治疗covid-19感染病例。此工作是作为covid-19ms联盟的一部分进行的，所有数据都将存储在ms联盟开放存储库中并可完全访问。[0237]方法[0238]参与者招募和道德规范[0239]此项目(iras项目id155921)的伦理批准是通过nhs健康研究局(rec参考：14/lo/1221)获得的。包含在本研究中的参与者是在nhsfrimleyparknhstrust招募的，共有67名参与者。样品的收集由萨里大学弗里姆利公园nhs基金会信托医院的研究人员进行。参与者由临床工作人员鉴定，以确保他们有能力同意研究，并被要求签署知情同意书；没有这种能力的人没有被抽样。同意的参与者被医院分类为“查询covid”(意味着临床怀疑covid-19感染)或“covid阳性”(意味着在入院期间记录了阳性covid测试结果)。向所有参与者提供了解释研究目标的患者信息表。[0240]样品收集、灭活和提取[0241]在招募到研究后立即对患者进行采样。这意味着症状发作和皮脂采样之间的时间范围为1一天到》1个月，这是在大流行情况下收集样品的必然结果。使用15cmx7.5cm的纱布对每个参与者的上背部右侧进行擦拭，每个纱布折叠两次以形成四层。采样的表面积约为5cmx5cm，均匀施加压力，同时将拭子移过上背部十秒。将纱布放入sterilin聚苯乙烯30ml通用容器中。[0242]样品在收集后4小时内通过快递从医院转移到萨里大学(universityofsurrey)，然后将样品在室温下隔离七天，以使病毒灭活。最后，将小瓶转移至负80℃储存直至需要。除了皮脂收集，还收集了所有参与者的元数据，其中包括性别、年龄、并存病(基于参与者是否接受治疗)、covidpcr(聚合酶链反应)测试的结果和日期、双侧胸部x光变化、吸烟状况以及参与者是否出现covid-19的临床症状。还采集了淋巴细胞、crp和嗜酸性粒细胞的值-这里记录入院期间的最极端值。这些不是与皮脂样品一起收集的。[0243]所得样品的提取、储存和重构遵循sinclaire、trivedid、sarkard等人。[55]。样品在五天内进行了分析。每天由运行并入溶剂空白注入(n＝5)、合并qc注入(n＝3)，然后是16个参与者样品(每个样品三次注入)，每六次注入一次合并qc注入。每天的运行通过合并的qc注入(n＝2)和溶剂空白(n＝3)完成的。还获得了现场空白的三次注入。[0244]仪器仪表和软件[0245]使用配备二元溶剂管理器、柱温箱和自动进样器的dionexultimate3000hplc模块进行样品分析，所述模块与萨里大学离子束中心的orbitrapq-exactiveplus质谱仪(英国赛默飞世尔科技(thermofisherscientific,uk))联接。在watersacquityuplcbehc18柱(1-7pm，2-1mmx100mm)上进行色谱分离，在55℃下以0-3mlmin-1的流速操作。[0246]流动相如下：流动相a是乙腈:水(v/v60:40)和0-1％甲酸，而流动相b是2-丙醇:乙腈(v/v,90:10)与0-1％甲酸(v/v)。使用5pl的注入体积。初始溶剂混合物为40％b，在1分钟内增加到50％b，然后在3-6分钟时增加到69％b，最后在12分钟时逐渐上升到88％的b。将梯度降至40％b并保持2分钟以使色谱柱平衡。q-exactiveplus质谱仪的分析是在拆分扫描模式下进行的，总扫描范围为150m/z至2000m/z，质量精度为5ppm。选择分散扫描以将m/z范围从150扩展到2000m/z，同时最大化鉴定特征的数量[56-57]。使用数据相关采集模式对合并的qc样品进行特征的ms/ms验证。操作条件总结在图38中。[0247]材料和化学品[0248]本研究中使用的材料和溶剂如下：纱布拭子(reliancemedical，uk)、30mlsterilintm管(thermoscientific，uk)、10ml注射器(西班牙碧迪(bectondickinson,spain))、2ml微量离心管(英国艾本德(eppendorf,uk))、0.2μm注射器过滤器(美国康宁公司)、200pl微量移液管尖端(英国starlab)和qserttm透明玻璃内插lc样品瓶(英国supelco)。optimatm(lc-ms)级甲醇用作提取溶剂，optimatm(lc-ms)级甲醇、乙醇、乙腈和2-丙醇用于制备进样溶剂和流动相。将0.1％(v/v)的甲酸添加到流动相溶剂中。溶剂购自英国赛默飞世尔科技。[0249]数据处理[0250]使用progenesisql(non-lineardynamics,waters,wilmslow,uk)对lc-ms输出(.raw文件)进行预处理以进行比对、归一化和峰鉴定，这是一种用于lc-ms数据的独立于平台的小分子发现分析软件。参照合并的qc样品进行峰值拾取(质量公差±5ppm)、对齐(rt窗口±15秒)和面积归一化。在ms中鉴定的特征最初使用progenesisq1中的lipidblast的精确质量匹配进行注释，同时使用lipidsearch(英国赛默飞世尔科技)和compounddiscoverer(英国赛默飞世尔科技)使用数据相关的ms/ms分析进行验证。这个过程产生具有14,160个特征的初始峰值表。所有合并的qc中变异系数超过20％的所有特征都被删除，至少90％的合并qc注入中不存在的那些特征也被删除。然后对这些特征进行现场空白调整：所有信噪比低于3倍的特征也被拒绝。剩下的998个特征被认为是稳健的、可重复的，并且与在空白字段中发现的特征有适当的区别。[0251]纳入标准也适用于参与者数据，既要求完整完成元数据，又要求pcrcovid-19测试结果(y/n)与covid-19临床诊断(y/n)之间的一致性。虽然这些纳入标准将参与者总数从n＝87减少到n＝67，但考虑到误诊可能会混淆统计模型的发展，这被认为是值得的。[0252]统计分析[0253]帕累托标度峰值的数据处理和分析：面积矩阵通过r包mixomics[58]的组合进行，辅以统计编程语言r[59]中用户编写的脚本，pls-da用于分类和数据预测。分离和分类是基于观察之间的mahalabonis距离。留一法交叉验证用于pls-da模型验证，以测试准确性、敏感性和特异性；预测变量重要性(vip)得分用于评估特征重要性。[0254]结果[0255]人口元数据概述[0256]在这项工作中分析的研究人群包含67名参与者，其中30名参与者出现covid-19临床症状(以及相关的covid-19rt-pcr检测呈阳性)和37名参与者没有出现。图29示出元数据的摘要。[0257]covid-19阳性组的男性参与者(m:f比为0.57)与总体参与者人群(m:f比为0.52)相比更多；鉴于招募是在医院环境中进行的，这可能反映了男性的严重程度增加[60]，covid-19阳性和阴性队列的年龄分布几乎相同(平均年龄分别为64.7岁和65.0岁)。并存病与covid-19感染的住院和更严重的结果有关，但也会改变参与者的代谢组，既是致病因素，也是混杂因素。这些并存病对分类准确性的影响是通过按并存病对参与者数据进行分层来测试的，以查看分离是否有所改善；此过程将在以下各节中描述。在这项试点研究中，与covid-19阴性参与者队列相比，covid-19阳性参与者队列中的并存病较少。[0258]covid-19参与者的c-反应蛋白(crp)水平明显较高，而淋巴细胞和嗜酸性粒细胞水平较低。crp指标的双尾mannwhitneyu检验提供的p-值为0031，淋巴细胞的p-值为0004。效应量(由cohen'sd计算)分别为0.56和0.85。covid-19阳性参与者也更有可能出现双侧胸部x光变化(30名covid-19阳性患者中有21名，而37名covid-19阴性患者中有2名)。covid-19阳性参与者经历了更高的氧气/cpap需求率、更高的升级率和更低的存活率。这些观察结果与文献对covid-19症状和进展的描述一致[61]。[0259]液相色谱质谱(lc-ms)鉴定的特征概述[0260]通过lc-ms可重复鉴定998个特征(存在于大于90％的合并qclc-ms注入中，合并qc的变异系数低于20％，信噪比大于三)，这些构成了分析的基础在这项工作中。在一系列脂质和代谢物上观察到covid-19阳性和阴性参与者之间的差异，其中最一致的差异是血脂水平降低，尤其是甘油三酯(图30)。[0261]ms/ms鉴定covid-19阳性参与者的甘油三酯总水平下降，并且神经酰胺也下降，尽管后一类的脂质被鉴定和验证的较少。shapiro-wilk正态性检验[62]未将按类别聚集的脂质离子计数的自然对数分布表征为正常。进行双尾mann-whitneyu检验以测试这些脂质类别的聚集水平的显著性。[0262]这些导致甘油三酯和神经酰胺的p-值分别为0.022和0.015，效应量(由cohen'sd计算)为0.44和0.57，表示中等效应量。这些结果提示由于covid-19引起的角质层血脂异常。阳性组和阴性组之间甘油三酯水平的变化与crp或淋巴细胞作为covid-19状态指标的变化相当(图31)。[0263]其它工作已经发现covid-19阳性患者血浆中存在血脂异常的证据[46、45、48]，尽管上调或下调在这些脂质类别中占主导地位的证据是混合的。已发现轻度covid-19病例血浆中的血浆甘油三酯(tag)水平升高，但随着covid-19严重程度的增加，血浆中的tag水平也可能下降[63]。[0264]然而，应该记住，皮肤的主要作用是屏障功能，而角质层中的脂质表达取决于从头脂肪生成-事实上，非皮肤来源(如血浆)对皮脂脂质的贡献很小[64]，这限制了更广泛的途径分析与这种生物流体的相关性。就病毒为自身繁殖而隔离脂质的程度来说，这可能导致皮脂脂质表达不足。[0265]人口级别的集群分析[0266]通过主成分分析(pca)，即通过无监督分析，在总人口水平上没有可鉴定的集群。对同一数据集执行的偏最小二乘判别分析(pls-da)显示有限的分离(图33)，接收器操作曲线下的面积超过(auroc)0.88的两个分量。auroc仅用于单个训练数据集时可能会被夸大，因此使用留一法构建混淆矩阵。以这种方式验证准确度(图32)显示灵敏性仅为57％，特异性为68％。鉴于并存病的范围很广，这并不出人意料。[0267]混杂因素的调查[0268]为了测试年龄和诊断指标(crp、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞)的影响，这些变量被帕累托缩放并包含在pls-da建模的矩阵中。[0269]淋巴细胞、crp和嗜酸性粒细胞的预测(vip)得分的可变重要性分别为2.47、1.77和0.72，在1,002个总特征中排名第1、90和465。作为一个单一特征，淋巴细胞水平降低与covid-19阳性状态具有高度相关性，这与淋巴细胞计数既是诊断又是预后生物标志物一致[65]。作为载体的年龄的vip得分仅为0.05(在1,002个特征中排名第958位)，指示年龄对角质层脂质的影响比其它因素小。[0270]总体来说，pls-da分离通过添加淋巴细胞和crp指标得到改善，当这两个变量包含在特征矩阵中时，模型精度略有提高(例如，总体人群的精度从62％提高到64％)。然而，鉴于这项工作侧重于皮脂采样，在分析中仅包含从皮脂获得的特征，即从分类模型中排除来自其它诊断指标的信息。[0271]为了测试仅基于皮脂的分离是否会在更小/更同质的组中得到改善，针对并存病的每个人群划分建立了单独的pls-da模型。如果模型性能得到改善(通过预测能力-q2y-以及通过留一法交叉验证的敏感性和特异性来衡量)，那么这可能表明如果基于分层和匹配的数据集构建模型，皮脂脂质分析将表现更好。表示出跨不同建模子集的这些指标的结果。[0272]随着数据被更精细地分组并且模型预测能力提高，分离通常得到改善。根据这些子集的加权平均，敏感性提高到75％，特异性提高到81％。举例来说，接受高血压药物治疗的参与者子集的pls-da建模(图36)示出良好的分离和更好的灵敏性和特异性(图35)。这些数据表明，并存病是皮肤脂质组学中的混杂因素。[0273]同样，接受高胆固醇药物治疗的参与者子集的pls-da模型显示出良好的分离(图40)，灵敏性为100％，特异性为80％。此子组接受了降脂药物治疗，特别是他汀类药物。包括接受缺血性心脏病(ihd)治疗的参与者的子组也表现出更好的分离(图42)，具有更好的总体准确性，其中敏感性和特异性分别为50％和86％。此子组接受了不同的药物治疗，但出现ihd的参与者也服用了他汀类药物。最后，接受t2dm药物治疗的参与者子集(图36)也表现出良好的分离和更好的敏感性和特异性(分别为71％和75％)。此子组通常使用口服降糖药治疗，例如二甲双胍，在某些情况下使用胰岛素，在某些情况下仅使用饮食控制。[0274]对于基于那些服用他汀类药物的参与者(敏感性为55％，特异性为90％)的分层数据集，模型性能(图46)相对于基本人群也有所改善。鉴于他汀类药物控制胆固醇和血脂水平，这可能提供了一个更相似的“基线”，用于测量covid-19对脂质组的干扰；服用他汀类药物的患者包含接受高胆固醇治疗的参与者以及糖尿病控制不佳或有缺血性心脏病史的参与者，其中定期预防性添加他汀类药物以改善长期结果。[0275]纵观这些模型，鉴定为在区分covid-19阳性和阴性方面具有重要意义的特征存在共性。许多特征在vip得分高于2的所有子集中都有特征(图37中的深灰色)，但其它特征没有，这可能是由于分层时较小的组而导致的过度拟合的指标。在特征之间确实发生重叠的情况下，这可能反映了子群之间的自然重叠，例如患有缺血性心脏病和高胆固醇的参与者的子集主要是接受他汀类药物治疗的参与者的子集。[0276]在具有最高常见vip得分的特征中，最高的两个是甘油三酯-tg(16.1/21.0/22.6)和tg(17.0/22.1/22.6)-最高的二十个中的八个也是如此，这与之前观察到的脂质失调一致，尤其是甘油三酯，是covid-19对皮肤影响的一个显著特征。[0277]讨论[0278]在聚集水平上，对本研究参与者的元数据分析说明了在大流行期间构建精心设计的样品集所面临的挑战。参与者的年龄范围很大，并且存在多种并存病，导致许多混杂因素。鉴于可用于按药物或并存病进行严格分层的数据点太少，在这项试点研究中尚未证明明确的分离是可能的。尽管如此，在聚集水平上，临床covid-19诊断呈阳性的参与者出现脂质水平下降(特别是甘油三酯和神经酰胺)，并可能降低屏障功能和皮肤健康。此外，这些发现表明，对参与者进行更好的分层可以通过他们的脂质组学特征更清楚地区分阳性和阴性covid-19参与者。分层组79％的总体准确性与最近使用呼吸生物化学报告的81％相当[43]，尽管在任何小n的试点研究中过度拟合都是一种风险。这种风险只能通过更大的数据训练集和随后在未来验证集上测试模型来降低，这可以通过如mscoalition的工作的凝聚力的努力来实现。[0279]另一点需要注意的是，参与者人群中可能缺乏季节性呼吸道病毒的混杂因素。虽然covid阴性患者包含患有呼吸道疾病(例如copd、哮喘)和covid样症状的患者，但样品是在5月至7月期间收集的，当时呼吸道病毒的发病率普遍较低。[0280]普通感冒和流感都有一些与covid-19重叠的症状，并可能导致脂质代谢的改变，从而干扰与covid-19感染相关的特征的鉴定。在英国，这类病毒在秋冬季节更为流行[66]。虽然季节性呼吸道病毒似乎不太可能是这项工作中的主要混杂因素，但这是在未来研究中需要考虑的一个因素，并且还可能有机会测试皮脂在以下方面的选择性和特异性其它呼吸道病毒。[0281]总之，我们提供的证据表明covid-19感染导致角质层血脂异常。我们进一步发现，使用多变量分析方法pls-da可分离covid阳性和阴性患者的皮脂谱，当根据某些并存病对患者进行分割时，分离度会提高。鉴于可以快速、无痛地提供皮脂样品，我们得出结论，皮脂值得将来考虑用于covid-19感染的临床采样。[0282]附加数据[0283]正交偏最小二乘判别分析(opls-da)显示分离。使用成对敲除法构建混淆矩阵，建立训练模型；将这些模型投射到被排除的参与者身上以测试准确性，结果显示灵敏性仅为63％，特异性为70％。鉴于并存病范围广泛且缺乏年龄匹配，这并不意外(图47)。[0284]包括接受缺血性心脏病(ihd)治疗的参与者的子组也表现出更好的分离(r2y为1.00，同样具有更好的敏感性和特异性，分别为75％和86％。此子组接受了不同的药物治疗，但出现ihd的参与者也服用了他汀类药物(图48)。[0285]随着数据被更精细地分组，分离通常得到改善，但对于大多数亚群，建模的预测能力没有改善。然而，四个子集在模型性能方面确实表现出更有趣的改进。这些是正在接受药物治疗(高胆固醇、t2dm和ihd)的具有特定并存病的亚群和接受他汀类药物治疗的亚群。接受高胆固醇药物治疗的参与者子集的opls-da模型显示两者分离良好(r2y为1.00)。此子组接受了降脂药物治疗，特别是他汀类药物(图49)。[0286]接受2型糖尿病(t2dm)药物治疗的参与者子集的opls-da模型示出良好的分离，敏感性为78％，特异性为75％。此子组通常使用口服降糖药治疗，例如二甲双胍，在某些情况下使用胰岛素，在某些情况下仅使用饮食控制(图50)。[0287]鉴于他汀类药物控制胆固醇和血脂水平，这可能提供了一个更相似的“基线”，据此测量covid-19对脂质组的干扰。分析所有服用他汀类药物的患者(包含接受高胆固醇治疗的参与者以及糖尿病控制不佳或有缺血性心脏病病史的参与者，其中定期预防性添加他汀类药物以改善长期结果)示出通过opls-da建模改进了分离，其中r2y为0.74，灵敏性为71％，特异性为76％(图51)。[0288]纵观这些模型，鉴定为在区分covid-19阳性和阴性方面具有重要意义的特征的共性有限。虽然某些特征在所有子组中的vip分数都很高，但许多特征却没有，这可能是由于分层时较小的组而导致的过度拟合的指标。在特征之间确实发生重叠的情况下，这可能反映了子群之间的自然重叠，例如患有缺血性心脏病和高胆固醇的参与者的子集主要是接受他汀类药物治疗的参与者的子集(图52)。[0289]前述实施例并非旨在限制权利要求提供的保护范围，而是描述如何将本发明付诸实践的实例。[0290]参考文献[0291]1.demaagd,g.和a.philip,帕金森病及其管理：第1部分：疾病实体、风险因素、+病理生理学、临床表现和诊断(parkinson'sdiseaseanditsmanagement:part1:diseaseentity,riskfactors,+pathophysiology,clinicalpresentation,anddiagnosis)。《药学与治疗学(pharmacyandtherapeutics)》,2015。40(8):p.504-532。[0292]2.cheng,h.-c.,c.m.ulane和r.e.burke,帕金森病的临床进展和轴突的神经生物学(clinicalprogressioninparkinson'sdiseaseandtheneurobiologyofaxons.)。《神经病学年鉴(annalsofneurology)》,2010.。67(6):p.715-725。[0293]3.morgan,j.,超级嗅觉的乐趣：pd诊断的皮脂线索(joyofsupersmeller:sebumcluesforpddiagnostics)。《柳叶刀神经病学(thelancetneurology)》。15(2):p.138-139。[0294]4.wood-kaczmar,a.,s.gandhi和n.wood,了解帕金森病的分子原因(understandingthemolecularcausesofparkinson'sdisease)。《分子医学趋势(trendsinmolecularmedicine)》,2006。12(11):p.521-528。[0295]5.krestin,d.,脂溢性相作为脑炎后帕金森症和相关疾病的表现(theseborrhoeicfaciesasamanifestationofpost-encephaliticparkinsonismandallieddisorders.)。《qjm：国际医学杂志(qjm:aninternationaljournalofmedicine)》，1927.os-21(81):p.177-186。[0296]6.donadio,v.等人,皮肤神经α-突触核蛋白沉积物：特发性帕金森病的生物标志物(skinnervealpha-synucleindeposits:abiomarkerforidiopathicparkinsondisease)。《神经病学(neurology)》,2014。82(15):p.1362-9。[0297]7.shirasu,m.和k.touhara,疾病的气味：与疾病和紊乱有关的人体挥发性有机化合物(thescentofdisease:volatileorganiccompoundsofthehumanbodyrelatedtodiseaseanddisorder)。《生物化学杂志(thejournalofbiochemistry)》,2011。150(3):p.257-266。[0298]8.pizzini,a.等人,慢性阻塞性肺疾病稳定或急性加重期患者呼吸中挥发性有机化合物的分析(analysisofvolatileorganiccompoundsinthebreathofpatientswithstableoracuteexacerbationofchronicobstructivepulmonarydisease)。《呼吸研究杂志(journalofbreathresearch)》,2018。[0299]9.ishibe,a.等人,气体成分检测作为一种新的结直肠癌诊断方法(detectionofgascomponentsasanoveldiagnosticmethodforcolorectalcancer)。《胃肠外科年鉴(annalsofgastroenterologicalsurgery)》,2018。[0300]10.chang,j.-e.等人,使用传感器系统分析用于肺癌诊断的呼出气中的挥发性有机化合物(analysisofvolatileorganiccompoundsinexhaledbreathforlungcancerdiagnosisusingasensorsystem)。《传感器和执行器b：化学(sensorsandactuatorsb:chemical)》,2018。255:p.800-807。[0301]11.lawal,o.等人,通过td-gc/ms分析来自与呼吸机相关性肺炎有关的细菌的顶空挥发性有机化合物(headspacevolatileorganiccompoundsfrombacteriaimplicatedinventilator-associatedpneumoniaanalysedbytd-gc/ms)。《呼吸研究杂志》,2018。12(2):p.026002。[0302]12.rattray,n.j.w.等人,让您大吃一惊：代谢组学为个性化医疗注入了活力(takingyourbreathaway:metabolomicsbreatheslifeintopersonalizedmedicine)。《生物技术趋势(trendsinbiotechnology)》,2014。32(10):p.538-548。[0303]13.xie,j.等人,油脂细胞病果皮挥发性成分变化及萜类代谢相关基因表达分析(analysisofchangesinvolatileconstituentsandexpressionofgenesinvolvedinterpenoidmetabolisminoleocellosispeel)。《食品化学(foodchemistry)》,2018。243:p.269-276。[0304]14.gatzias,i.等人,基于物理化学参数、脂肪酸组成和挥发性成分的希腊品种羊奶的表征和区分(characterizationanddifferentiationofsheep'smilkfromgreekbreedsbasedonphysicochemicalparameters,fattyacidcompositionandvolatileprofile)。《粮食和农业科学杂志(journalofthescienceoffoodandagriculture)》,2018。[0305]15.gerhardt,n.等人,使用顶空气相色谱-离子迁移谱(hs-gc-ims)的挥发性化合物指纹图谱对蜂蜜作为1h-nmr分析的台式替代品进行真实性评估(volatilecompoundfingerprintingbyheadspacegaschromatography-ionmobilityspectrometry(hs-gc-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