包含具有尼龙-6和染料的纳米颗粒的校准装置的制作方法

包含具有尼龙-6和染料的纳米颗粒的校准装置
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119要求2020年2月24日提交的系列号为62/980,653的美国临时申请的优先权权益，本文以该申请的内容为基础并将其通过引用全文纳入本文。
技术领域
3.本说明书一般涉及校准装置，更具体而言，涉及具有类似于胞外囊泡(ev)的性质的校准装置。


背景技术：

4.胞外囊泡(ev)研究已经扩展到从血清和细胞中分离和浓缩的方法，以用于治疗应用。词语“胞外囊泡”一般是指从细胞中自然释放的颗粒，该颗粒由脂质体双层界定并且不能复制。这些颗粒可按尺寸和功能细分，其中最小的颗粒是小至30nm的外泌体，而最大的颗粒是大至2μm的微泡。
5.然而，表征方法缺乏适用于ev定量和定尺寸技术的校准标准品。虽然聚苯乙烯珠粒标准品常规用于定尺寸仪器，例如流式细胞分析仪，但是聚苯乙烯珠粒具有与哺乳动物细胞匹配的性质，例如，密度、光散射效应、尺寸和荧光标记结合亲和力。尽管ev是可以源自哺乳动物原始细胞的产物，但是它们的固有性质与它们的原始细胞性质不同，因而与聚苯乙烯珠粒的性质也不同。
6.因此，需要替代性的校准装置，尤其是性质类似于ev的校准装置。


技术实现要素：

7.本文所述的各个实施方式提供了性质类似于ev的纳米颗粒的校准装置。特别地，所述校准装置包括共价结合到第一染料的尼龙-6的第一纳米颗粒以及共价结合到第二染料的尼龙-6的第二纳米颗粒。第一纳米颗粒具有第一平均直径，并且第二纳米颗粒具有第二平均直径，所述第二平均直径与所述第一平均直径不相同。所述纳米颗粒具有类似于ev的尺寸范围、密度和光散射效应，并且可用作定尺寸和定量技术的校准标准品，如下文将更详细所述。
8.根据本文公开的第1方面，一种校准装置，其包括第一纳米颗粒和第二纳米颗粒，所述第一纳米颗粒包含共价结合到第一染料的尼龙-6，第一纳米颗粒具有第一平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第一多分散指数；所述第二纳米颗粒包含共价结合到第二染料的尼龙-6，所述第二染料与所述第一染料不相同，第二纳米颗粒具有第二平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第二多分散指数，其中：第一平均直径与第二平均直径不相同；第一平均直径和第二平均直径各自独立地大于或等于30nm且小于或等于3000nm；并且第一平均直径是第二平均直径的至少两倍。
9.根据本文公开的第2方面，一种校准装置包括根据第1方面所述的校准装置，其中，第一染料和第二染料各自包括亲脂性荧光染料。
10.根据本文公开的第3方面，一种校准装置包括根据前述任一方面所述的校准装置，其中：第一染料包括第一最大激发波长λex1；第二染料包括第二最大激发波长λex2；λex1与λex2不相同；并且λex1和λex2各自为350nm至750nm。
11.根据本文公开的第4方面，一种校准装置包括根据前述任一方面所述的校准装置，其中，所述校准装置包括容器，所述容器包括含有第一纳米颗粒和第二纳米颗粒的混合物。
12.根据本文公开的第5方面，一种校准装置包括根据前述任一方面所述的校准装置，其中，第一平均直径和第二平均直径中的至少一者为30nm至250nm。
13.根据本文公开的第6方面，一种校准装置包括根据前述任一方面所述的校准装置，其中，第一纳米颗粒和第二纳米颗粒各自具有1.15g/ml至1.19g/ml的密度。
14.根据本文公开的第7方面，一种校准装置包括根据前述任一方面所述的校准装置，其中，第一纳米颗粒和第二纳米颗粒各自包括rna。
15.根据本文公开的第8方面，一种方法，其包括：将第一纳米颗粒和第二纳米颗粒均匀地分散在校准悬浮液中，第一纳米颗粒包括共价结合到第一染料的尼龙-6，第二纳米颗粒包括共价结合到第二染料的尼龙-6，第二染料与第一染料不相同；向样品缓冲液中添加一定体积的包含均匀分散的第一纳米颗粒和第二纳米颗粒的校准悬浮液，以产生在样品缓冲液中包含预定浓度的第一纳米颗粒和第二纳米颗粒的样品；用定尺寸仪器分析样品以获得关于第一染料的荧光输出和第二染料的荧光输出的至少一个数据输出；以及基于所述至少一个数据输出调整定尺寸仪器的一个或多个设置。
16.根据本文公开的第9方面，一种方法包括根据第8方面所述的方法，其中：第一纳米颗粒具有第一平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第一多分散指数；并且第二纳米颗粒具有第二平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第二多分散指数。
17.根据本文公开的第10方面，一种方法包括根据第8或第9方面所述的方法，其中，所述定尺寸仪器是流式细胞分析仪。
18.根据本文公开的第11方面，一种方法包括根据第8至10方面中任一方面所述的方法，其中，调整所述一个或多个设置包括使信号最大化，使变异系数最小化，或者它们的组合。
19.根据本文公开的第12方面，一种方法包括根据第8至11方面中任一方面所述的方法，其中，调整所述一个或多个设置包括调整关于下述的设置：粒度测量的分辨极限、粒度测量的范围、散射光电倍增管的灵敏度、基线仪器噪声、激光对准、光学对准、流式细胞分析仪的液流系统的稳定性、细胞分选仪液滴延迟(drop delay)、细胞分选仪效率、或者其组合。
20.根据本文公开的第13方面，一种方法包括根据第8至12方面中任一方面所述的方法，其中，第一染料和第二染料各自包括亲脂性荧光染料。
21.根据本文公开的第14方面，一种方法包括根据第8至13方面中任一方面所述的方法，其中，第一平均直径和第二平均直径中的至少一者为30nm至250nm。
22.根据本文公开的第15方面，一种方法包括根据第8至14方面中任一方面所述的方法，其中，第一纳米颗粒和第二纳米颗粒各自具有1.15g/ml至1.19g/ml的密度。
23.根据本文公开的第16方面，一种校准装置，其包括：多组包含尼龙-6的纳米颗粒，其中，一组纳米颗粒中的每个纳米颗粒还包括与不同组纳米颗粒中的对应染料不同的染
料，其中：每组纳米颗粒具有对应的平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的多分散指数；每组纳米颗粒的对应平均直径与多个组中的另外每组纳米颗粒的对应平均直径相差至少2倍；并且每个对应的平均直径大于或等于30nm且小于或等于3000nm。
24.根据本文公开的第17方面，一种校准装置包括根据第16方面所述的校准装置，其中，所述染料中的每一种包括亲脂性荧光染料。
25.根据本文公开的第18方面，一种校准装置包括根据第16或17方面所述的校准装置，其中，所述校准装置包括容器，所述容器包括含有多组纳米颗粒的混合物。
26.根据本文公开的第19方面，一种校准装置包括根据第16至18方面中任一方面所述的校准装置，其中，多组纳米颗粒具有1.15g/ml至1.19g/ml的密度。
27.根据本文公开的第20方面，一种校准装置包括根据第16至19方面中的任一方面所述的校准装置，其中，多组纳米颗粒中的至少一组包括rna。
28.在以下的具体实施方式中给出了另外的特征和优点，其中的部分特征和优点对于本领域的技术人员而言通过所作描述是显而易见的，或者通过实施本文所述的实施方式，包括以下的具体实施方式、权利要求书以及附图在内的本文所描述的实施方式而被认识。
29.应理解，前述的一般性描述和下文的具体实施方式都描述了各个实施方式且都旨在提供用于理解所要求保护的主题的性质和特性的总体评述或框架。包括的附图提供了对各个实施方式的进一步理解，附图并入本说明书中并构成说明书的一部分。附图例示了本文所描述的各个实施方式，并且与说明书一起用于解释所要求保护的主题的原理和操作。
附图说明
30.图1示意性地例示了根据本文所示和所述的一个或多个实施方式的纳米颗粒的组，所述纳米颗粒相比于各种胞外囊泡具有不同的平均直径。
具体实施方式
31.在各个实施方式中，一种校准装置包括第一纳米颗粒和第二纳米颗粒，所述第一纳米颗粒包括共价结合到第一染料的尼龙-6，所述第二纳米颗粒包括共价结合到第二染料的尼龙-6，所述第二染料与所述第一染料不相同。第一纳米颗粒具有第一平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第一多分散指数；并且第二纳米颗粒具有第二平均直径和大于或等于1.15且小于或等于1.19的第二多分散指数。在各个实施方式中，第一平均直径与第二平均直径不相同，并且第一平均直径和第二平均直径中的每一者大于或等于30nm且小于或等于3000nm，其中，第一平均直径是第二平均直径的至少两倍。
32.下面将详细说明各个实施方式，这些实施方式的实例在附图中示出。在附图中尽可能得使用相同的附图标记表示相同或相似的部分。
33.本文中，范围可表示为从“约”一个具体值开始和/或至“约”另一个具体值终止。表述这样的范围时，另一种实施方式包括自所述一个具体值始和/或至所述另一具体值止。类似地，用先行词“约”将数值表示为近似值时，应理解该具体值构成另一个实施方式。还应理解，每个范围的端点在与另一个端点有关及独立于另一个端点时都是重要的。
34.本文所用的方向术语，例如上、下、左、右、前、后、顶、底，仅仅是参照绘制的附图而言，并不用来暗示绝对的取向。
35.除非另有明确说明，否则本文所述的任何方法不应理解为其步骤需要按具体顺序进行，或者要求使任何设备具有特定取向。因此，如果方法权利要求或实施方式没有实际叙述其步骤要遵循的顺序，或者任何设备权利要求或实施方式没有实际叙述各组件的顺序或取向，或者权利要求书或说明书中没有另外具体陈述步骤限于具体顺序，或者没有叙述设备组件的具体顺序或取向，那么在任何方面都不应推断顺序或取向。这适用于解释上的任何可能的非表达性基础，包括：涉及步骤安排的逻辑问题、操作流程、组件的顺序或组件的取向问题；由语法组织或标点派生的明显含义问题和说明书中描述的实施方式的数量或类型问题。
36.除非上下文另外清楚地说明，否则，本文所用的单数形式“一个”、“一种”以及“该/所述”包括复数指代。因此，例如，提到的“一种”部件包括具有两种或更多种这类部件的方面，除非文本中有另外的明确表示。
37.术语“由
……
形成”可意为包含、基本上由
……
组成或由
……
组成中的一种或多种情况。例如，由特定材料形成的部件可包含该特定材料，基本上由该特定材料组成，或者由该特定材料组成。
38.包含尼龙-6和亲脂性荧光染料的纳米颗粒
39.图1示例性例示了校准装置100的一个实施方式，其包括多组纳米颗粒102，其中每个单独的组被认定为102a-102f，并且附图标记102总地指任何一个或多个组。单独组102a-102f显示为成排的各个纳米颗粒，并且来自每组的单个纳米颗粒分别认定为102a1-102f1。虽然图1所示的实施方式包括六组纳米颗粒，但是认为在校准装置100中可包括任何数目组的纳米颗粒。
40.每组102包括含有尼龙-6的纳米颗粒，所述尼龙-6共价结合到对应的染料，例如有机染料[例如，荧光素、若丹明、氨基甲基香豆素(amca)]，生物荧光体[例如，绿色荧光蛋白、藻红蛋白、别藻蓝蛋白(allophycocyanain)]，量子点，或者亲脂性荧光染料。因此，在图1中，第一组纳米颗粒102a包括共价结合到第一染料的尼龙-6，第二组纳米颗粒102b包括共价结合到第二染料的尼龙-6，第三组纳米颗粒102c包括共价结合到第三染料的尼龙-6，第四组纳米颗粒102d包括共价结合到第四染料的尼龙-6，第五组纳米颗粒102e包括共价结合到第五染料的尼龙-6，并且第六组纳米颗粒102f包括共价结合到第六染料的尼龙-6。每组纳米颗粒中的染料与其他组纳米颗粒中的其他染料中的每一种不相同，因此，染料对于特定组的纳米颗粒是独特的并且指示了特定组的纳米颗粒。
[0041]
在各个实施方式中，每种染料是亲脂性荧光染料，其包含亲脂性羰花青(carbocyanine)染料。合适的商购新脂性羰花青包括，例如但不限于作为dib、dia、dio、dii、did的dir销售的亲脂性荧光示踪染料，它们均可购自biotium公司(biotium,inc.，加利福尼亚州海沃德)。这些示例性染料中的每一种的颜色、最大激发波长(λex)和最大发射波长(λem)示于下表1。
[0042]
表1：
[0043][0044]
如表1所示，亲脂性荧光染料具有353nm至750nm的最大激发波长(例如，在激发波谱中出现最大吸收处的峰值波长)，这使用单色仪测量，因此，表1中的亲脂性荧光染料适用于常见的定尺寸技术，包括但不限于流式细胞分析仪，流式细胞分析仪包含光学系统，例如灯和激光器，其在最大激发波长下产生光信号，因此可激发染料。另外，表1显示出每种染料展现出不同的最大发射波长(其使用单色仪来测量)，这对应于响应于激发可观察到的颜色。因此，当每种荧光染料与具有对应平均直径的纳米颗粒相关时，多种荧光染料的使用能够实现增加的灵敏度和分辨率。
[0045]
在各个实施方式中，染料共价结合到聚合物，所述聚合物包括尼龙-6。在实施方式中，如下文更详细所述，染料先结合到聚合物再形成纳米颗粒，以使得染料在各个纳米颗粒中均匀地分布。尼龙-6具有以下结构：
[0046][0047]
尼龙-6结构的羰基能够实现与染料的共价结合，这除了能够示踪尼龙-6纳米颗粒外，还可减少或消除染料泄漏或者染料从颗粒解离。例如，将聚合物颗粒与染料一起包封或孵育的常规标准品可能在染料与颗粒之间不形成直接的化学键。因此，染料从颗粒泄漏可能将误差引入到使用常规标准品进行的测量中。相较之下，在各个实施方式中，本文所述的荧光染料共价结合到尼龙-6上并且并入到纳米颗粒中，聚合物将需要降解来释放荧光染料，由此降低了染料从纳米颗粒解离的可能性。
[0048]
在各个实施方式中，纳米颗粒具有大于或等于1.15g/ml且小于或等于1.19g/ml的密度，如根据astm d792所测量的。例如，纳米颗粒具有下述密度：大于或等于1.15g/ml且小于或等于1.19g/ml，大于或等于1.15g/ml且小于或等于1.18g/ml，大于或等于1.15g/ml且小于或等于1.17g/ml，大于或等于1.15g/ml且小于或等于1.16g/ml，大于或等于1.16g/ml且小于或等于1.19g/ml，大于或等于1.16g/ml且小于或等于1.18g/ml，大于或等于1.16g/ml且小于或等于1.17g/ml，大于或等于1.17g/ml且小于或等于1.19g/ml，大于或等于1.17g/ml且小于或等于1.18g/ml，或者大于或等于1.18g/ml且小于或等于1.19g/ml。因此，纳米颗粒具有与ev的密度(即，1.15-1.19g/ml)相似的密度，并且适当地高于哺乳动物细胞
的密度(即，1.04-1.05g/ml)，由此消除了介于ev与标准纳米颗粒之间的不同材料密度的问题。
[0049]
每组纳米颗粒具有根据iso 22412来测量的平均水力直径(在本文中称为“平均直径”)，其一般称作dn。每组纳米颗粒的平均水力直径通过光散射测量技术以及通过显微镜法视觉确认来确定，光散射测量技术例如动态光散射(dls)或纳米颗粒跟踪分析(nat)，显微镜法例如扫描电子显微镜法(sem)或透射电子显微镜法(tem)。在图1中，da是第一组纳米颗粒102a的平均直径，db是第二组纳米颗粒102b的平均直径，dc是第三组纳米颗粒102c的平均直径，dd是第四组纳米颗粒102d的平均直径，de是第五组纳米颗粒102e的平均直径，并且df是第六组纳米颗粒102f的平均直径。
[0050]
在各个实施方式中，每组纳米颗粒具有小于或等于15％的尺寸标准偏差(例如，组中的每个颗粒的最大直径的标准偏差)，这通过软件计算在统计学上确定。例如，每组纳米颗粒的标准偏差可以小于或等于15％，小于或等于12.5％，小于或等于10％，小于或等于8％，小于或等于6％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％，或者小于或等于0.5％。在实施方式中，每组纳米颗粒的平均直径的标准偏差可以大于或等于0且小于或等于15％，大于或等于0且小于或等于12.5％，大于或等于0且小于或等于10％，大于或等于0且小于或等于8％，大于或等于0且小于或等于6％，大于或等于0且小于或等于5％，大于或等于0且小于或等于4％，大于或等于0且小于或等于3％，大于或等于0且小于或等于2％，大于或等于0且小于或等于1％，大于或等于0且小于或等于0.5％，大于或等于0.5％且小于或等于15％，大于或等于0.5％且小于或等于12.5％，大于或等于0.5％且小于或等于10％，大于或等于0.5％且小于或等于8％，大于或等于0.5％且小于或等于6％，大于或等于0.5％且小于或等于5％，大于或等于0.5％且小于或等于4％，大于或等于0.5％且小于或等于3％，大于或等于0.5％且小于或等于2％，大于或等于0.5％且小于或等于1％，大于或等于0且小于或等于0.5％，大于或等于1％且小于或等于15％，大于或等于1％且小于或等于12.5％，大于或等于1％且小于或等于10％，大于或等于1％且小于或等于8％，大于或等于1％且小于或等于6％，大于或等于1％且小于或等于5％，大于或等于1％且小于或等于4％，大于或等于1％且小于或等于3％，或者大于或等于1％且小于或等于2％，包括这些范围内的任何和所有的范围和子范围。可设想的是，在实施方式中，每个标准偏差可以是该范围内的数，并且可以与一个或多个其他组纳米颗粒的标准偏差相同或不同。
[0051]
在各个实施方式中，每组纳米颗粒可以进一步通过大于或等于1.15且小于或等于1.19的多分散指数来表征。多分散指数(有时称为“pdi”或“d)是由纳米颗粒组的累积量分析计算的尺寸分布的宽度的量度，并且使用符合iso 22412和iso 13321的动态光散射(dls)来确定。在实施方式中，每组纳米颗粒的pdi可以大于或等于1.15且小于或等于1.18，大于或等于1.15且小于或等于1.17，大于或等于1.15且小于或等于1.16，大于或等于1.16且小于或等于1.19，大于或等于1.16且小于或等于1.18，大于或等于1.16且小于或等于1.17，大于或等于1.17且小于或等于1.19，大于或等于1.17且小于或等于1.17，或者大于或等于1.18且小于或等于1.19，包括这些范围内的任何和所有范围和子范围。可设想的是，在实施方式中，每个pdi可以是该范围内的数，并且可以与一个或多个其他组纳米颗粒的pdi相同或不同。
[0052]
每组的平均直径dn与其他纳米颗粒组中的每一组的平均直径不相同。因此，在图1中，da与db、dc、dd、de和df不相同，db与dc、dd、de和df不相同，dc与dd、de和df不相同，dd与de和df不相同，并且de与df不相同。在各个实施方式中，每个平均直径是下一最大平均直径的至少两倍。例如，在图1中，db(100nm)是da(50nm)的两倍，dc(250nm)是db(100nm)的至少两倍，dd(500nm)是dc(250nm)的两倍，de(1000nm)是dd(500nm)的两倍，并且df(2000nm)是de(1000nm)的两倍。
[0053]
在各个实施方式中，每个平均直径dn独立地大于或等于30nm且小于或等于3000nm。例如，每个平均直径dn可以大于或等于30nm且小于或等于3000nm，大于或等于30nm且小于或等于2500nm，大于或等于30nm且小于或等于2000nm，大于或等于30nm且小于或等于1500nm，大于或等于30nm且小于或等于1000nm，大于或等于30nm且小于或等于750nm，大于或等于30nm且小于或等于500nm，大于或等于30nm且小于或等于300nm，大于或等于30nm且小于或等于250nm，大于或等于30nm且小于或等于100nm，大于或等于50nm且小于或等于3000nm，大于或等于50nm且小于或等于2500nm，大于或等于50nm且小于或等于2000nm，大于或等于50nm且小于或等于1500nm，大于或等于50nm且小于或等于1000nm，大于或等于50nm且小于或等于750nm，大于或等于50nm且小于或等于500nm，大于或等于50nm且小于或等于300nm，或者大于或等于50nm且小于或等于250nm，包括这些范围内的任何和所有范围和子范围。在实施方式中，至少一组纳米颗粒的平均直径小于或等于300nm，小于或等于250nm，小于或等于200nm，小于或等于150nm，小于或等于100nm，小于或等于75nm，或者小于或等于50nm。
[0054]
应理解，虽然图1所示的组102a-102f具有特定的平均直径，但是校准装置100中的平均直径可根据具体的实施方式而变化。例如，可以对一组或多组纳米颗粒进行选择，以使得平均直径在范围上(在50nm内，在100nm内，在250nm内)相对靠近感兴趣的ev类型。除了示出了校准装置100之外，图1还示意性例示了ev 104的各种类型及它们的大致平均直径。具体地，图1包括外泌体106，该外泌体106具有小于或等于约100nm的平均直径；平均直径大于或等于约100nm且小于或等于约1000nm的第一集合的微泡108；平均直径大于或等于约1000nm且小于或等于约2000nm的第二集合的微腔体110；以及平均直径大于约2000nm的癌小体(oncosome)112。因此，如图1所示，本文所述的纳米颗粒可用于近似各种不同ev的尺寸。
[0055]
在一些实施方式中，一组或多组纳米颗粒可以包括rna。在这样的实施方式中，如下文将更详细所述，在形成纳米颗粒之前，rna先通过聚合物的酰胺基团结合到聚合物。因此，rna均匀地分布于每个纳米颗粒。如本文所用的短语“rna分子”或“rna”是指核糖核酸，即，由核苷酸组成的聚合物。核苷酸通常是腺苷-单磷酸酯、尿苷-单磷酸酯、鸟苷-单磷酸酯和胞苷-单磷酸酯单体，它们沿着由第一单体的糖(即，核糖)与相邻的第二单体的磷酸酯之间的磷酸二酯键形成的所谓主链彼此连接。在纳米颗粒包括rna的实施方式中，rna可以拥有任何预定的rna序列。rna序列例如可以是普通rna序列，或者感兴趣的特定序列。因此，可通过将包含rna的纳米颗粒添加到生物样品中并且观察整个实验方案中技术步骤的影响来验证分析结果，如下文将更详细地描述。
[0056]
制造纳米颗粒的方法
[0057]
可根据多种纳米沉淀方法中的任一种来制造各个实施方式的纳米颗粒，纳米沉淀
方法包括但不限于移液管液滴纳米沉淀、流量控制的t形混合器纳米沉淀、以及流量控制的微流体纳米沉淀。一般来说，为了配制纳米颗粒，将尼龙-6团溶解在极性质子溶剂(例如，乙酸、甲酸、乙醇等)或极性非质子溶剂(例如，四氢呋喃、丙酮、乙腈等)中直到均质化(例如，尼龙-6均匀地分布在整个溶剂中)。使染料溶解到尼龙-6和溶剂的混合物中或者通过混溶溶剂经由乳液引入。制备水和表面活性剂(例如，聚乙烯基醇、普朗尼克或另一种聚集保护剂)的水性混合物以用于混合和收集溶液。
[0058]
在各个实施方式中，纳米颗粒的尺寸通过下述来控制：控制有机相中的聚合物浓度，有机溶剂的选择，水相中的表面活性剂浓度，表面活性剂选择，混合中的有机相与水相的比值，混合期间有机相和水相的流速，以及用于纳米沉淀的设备。例如，增加有机相中的聚合物浓度或者使混合中的有机相与水相的比值增加导致颗粒直径增大。又例如，水相中的表面活性剂浓度增加或者水相与有机相之比增加导致颗粒直径减小。有机溶剂和表面活性剂的选择可对颗粒尺寸有各种影响，这些影响可根据溶剂或表面活性剂自身的化学密度、电荷、混溶性和其他化学性质，凭经验来确定。在混合期间增大流速也可影响颗粒直径(一般来说，更高的流速导致颗粒直径减小)。然而，有机相和水相的流速可独立地变化，这可能具有不同的影响，类似于所描述的与混合物中的比值相关的改变的影响。
[0059]
另外，用于形成纳米颗粒的具体方法可影响颗粒尺寸的变化性。对设备的控制越多，目标颗粒尺寸可实现得越精确和准确。例如，流量控制的微流体方法相比于t形混合器将能够生产pdi更小的颗粒，而t形混合器相比于液滴法将能够生产pdf更小的颗粒。
[0060]
在使用移液管液滴法生产纳米颗粒的实施方式中，将少量聚合物[例如，大于或等于0.5％且小于或等于2.0％的尼龙-6(以重量/体积(w/v)计)连同亲脂性荧光染料溶解到有机溶剂中。在实施方式中，以大于或等于0.25％(重量/重量，w/w)且小于或等于1.5％的染料/聚合物的量加入荧光剂，并且聚合物与染料的比值大于或等于50:1且小于或等于250:1。在具体的实施方式中，聚合物与染料的比值为约100:1。在染料不可溶于有机溶剂的实施方式中，通过将染料溶解在混溶溶剂(例如，二甲基亚砜(dmso))来制备乳液并加入到有机相中，同时涡旋或声波处理直到实现均质化溶液。接着，将包含聚合物和染料的有机相滴加到水相中并同时搅拌。在实施方式中，水相是在水中的大于或等于0.5％且小于或等于5.0％(重量/体积，w/v)的表面活性剂。接着通过蒸发去除有机溶剂。在实施方式中，蒸发可通过搅拌(例如，持续至少3小时)或者通过使用旋转蒸发仪(例如，持续约15分钟)进行。
[0061]
通过离心从水性介质中回收纳米颗粒。在实施方式中，可在室温下以约6,000x g对水性介质离心约15分钟。倾倒水性上清液，并且通过将纳米颗粒重悬于10ml水中以及在室温下以约16,000x g离心约15分钟来洗涤纳米团。在实施方式中，洗涤程序可进行两次或更多次。最后，将经过洗涤的分散体冻干至少48小时以得到冻干的纳米颗粒。可在-20℃的温度下储存纳米颗粒直至需要用纳米颗粒。
[0062]
在使用流量控制的t形混合器方法或者流量控制的微流体方法制备纳米颗粒的实施方式中，以约50mg/ml的尼龙-6以及0.5％(重量/重量，w/w)的染料/聚合物的浓度将尼龙和亲脂性荧光染料溶解到有机溶剂中。还通过在水中加入大于或等于0.5％且小于或等于5.0％(重量/体积，w/v)的表面活性剂来制备水相。将每相放置到储器中，在各个实施方式中，储器是注射器。在使用t形混合器方法的实施方式中，将每个注射器安装在注射器泵上，并且使注射器的输出线路通向t形混合器的一个入口端口。将收集容器定位在t形混合器的
出口端口。采用凭经验确定的流速，注射器按程序将适当流量和体积的每个相同时输送给t形混合器。在使用流量控制的微流体方法的实施方式中，以凭经验确定的速率向微流体芯片提供有机相和水相。如上所述回收和洗涤纳米颗粒。
[0063]
可设想可以对本文所述的制备纳米颗粒的方法进行调整和改变，例如，包括成分的量，离心次数等，这取决于具体的实施方式，并且例如基于要形成的纳米颗粒的期望尺寸。
[0064]
在纳米颗粒中加入rna的实施方式中，可将rna分子加入到上述混合物的水相中。在这样的实施方式中，水相包括微酸性缓冲液(例如，乙酸钠或三-edta)，以促进尼龙-6中的酰胺基团与rna的相互作用。在实施方式中，水相的ph大于或等于4.5且小于或等于7。
[0065]
在各个实施方式中，可使用尺寸排阻离心过滤器(size exclusion centrifuge filter)或其他尺寸选择方法来过滤纳米颗粒组，以达到期望的尺寸分布。
[0066]
虽然已经描述了用于形成包含尼龙-6和染料的纳米颗粒的各种方法，但应理解，本领域技术人员已知的其他方法也可用于制造纳米颗粒，包括但不限于乳化技术、电喷雾和等离子体沉积。
[0067]
在各个实施方式中，将两组或更多组纳米颗粒以相等的体积加入到单个容器(例如小瓶)中，以形成标准集。在实施方式中，通过在使用前添加水或另一种溶剂，可以使纳米颗粒重悬。据信，通过以浓缩状态储存纳米颗粒可以通过限制聚合物的水解降解来延长纳米颗粒的保存期，而当纳米颗粒悬浮在水中时可能发生该水解降解。
[0068]
纳米颗粒的使用方法
[0069]
可以各种方式来使用各个实施方式的纳米颗粒，例如，可将其用于表征小的生物囊泡，例如，各种ev。例如，在一些实施方式中，纳米颗粒被用作标准品，其被掺入到生物样品中以评估分离效率并提供技术标准化。在一些实施方式中，负载有特定rna序列的纳米颗粒能够独立验证结果，例如，通过证明特定的分离方法保留了所分离的ev的功能(例如，rna转运能力)。作为另一实例，纳米颗粒被用作ev定量和定尺寸技术——包括但不限于流式细胞分析技术——的校准标准品。
[0070]
在实施方式中，校准装置可用于校准定尺寸仪器，例如，流式细胞分析仪。因此，一种用于校准定尺寸仪器的方法包括：使第一纳米颗粒和第二纳米颗粒均匀分散在校准悬浮液中。第一纳米颗粒包括第一染料，并且第二纳米颗粒包括与第一染料不同的第二染料。接着，将一定体积的包含均匀分散的第一纳米颗粒和第二纳米颗粒的校准悬浮液加入到样品缓冲液中以生成样品，所述样品包含在样品缓冲液中的预定浓度的第一纳米颗粒和第二纳米颗粒。
[0071]
用定尺寸仪器(例如，购自路明克斯公司(luminex)的easycyte
tm
流式细胞分析仪或者购自赛默飞世尔(thermo fisher)公司的attune
tm nxt流式细胞分析仪)分析样品，以获得关于第一染料的荧光输出和第二染料的荧光输出的至少一个数据输出。接着，基于该至少一个数据输出来调整定尺寸仪器的一个或多个设置。在实施方式中，调整所述一个或多个设置可包括：使信号最大化，使变异系数最小化，或者其组合。在一些实施方式中，被调整的设置可以是关于粒度测量的分辨极限、粒度测量的范围、散射光电倍增管的灵敏度、基线仪器噪声、激光对准、光学对准、流式细胞分析仪的液流系统的稳定性、细胞分选仪液滴延迟、细胞分选仪效率、或者其组合。取决于具体的实施方式，设想了其他调整，并且
这将至少部分基于被校准的具体定尺寸仪器。
[0072]
在纳米颗粒包括rna的实施方式中，纳米颗粒可用作人工ev掺入物标准品来从生物流体中标准化回收ev和相关的rna，并且促进结果的独立验证。在这样的实施方式中，人工ev标准品可用于确保rna不被实验方案损坏。如本领域技术人员应理解的，实验方案例如可包括ribogreen测定或其他定量测定，或者功能分析。
[0073]
在本文所述的各个实施方式中，校准装置包括成组的尼龙-6和对应染料的纳米颗粒，每组纳米颗粒具有对应的平均直径。因此，纳米颗粒展现出可与ev相当的密度、光散射效应和尺寸范围，使得它们特别适于用作ev研究的标准品。另外，各个实施方式的纳米颗粒可以包括rna分子，以使得纳米颗粒能够在实验方案中用作人工ev掺入物，以促进结果的独立验证以及ev和相关rna的标准化回收。
[0074]
本领域的技术人员显而易见的是，可以在不偏离要求专利权的主题的精神和范围的情况下，对本文所述的实施方式进行各种修改和变动。因此，本说明书旨在覆盖本文所述的各个实施方式的修改和变动，只要这些修改和变动在所附权利要求书及其等同内容的范围之内。