治疗癌症的方法与流程

治疗癌症的方法
1.对相关申请的交叉引用本技术要求2020年2月28日提交的美国临时申请号62/983,300的益处。
2.背景癌细胞表明显著的适应细胞毒性应激物和改变细胞死亡途径以便存活的能力。癌细胞耐受癌症靶向疗法的初始能力与从糖酵解到增加的线粒体代谢的代谢的转变相关联。向增加的线粒体代谢的转变与几种癌症模型中的药物抗性有关。此外，该药物抗性状态显示对名为伊利司莫的铜离子载体的增加脆弱性。伊利司莫结合铜并促进细胞死亡，并且由伊利司莫诱导的细胞死亡取决于细胞内和细胞外铜的可用性。当细胞从糖酵解转变为增加的线粒体代谢时，伊利司莫对细胞死亡的诱导被高度增强。最近，多次全基因组和代谢基因聚焦的基于crispr/cas9的基因缺失筛选已经揭示，硫辛酸途径的基因的缺失和编码线粒体蛋白铁氧还蛋白1(fdx1)的基因的缺失拯救细胞免于伊利司莫诱导的细胞死亡。遗传和生化分析进一步揭示，fdx1是硫辛酸途径的关键上游调节剂和通过铜离子载体诸如伊利司莫诱导细胞死亡的关键调节剂。这些发现阐明了铜和硫辛酸途径在促进转变至增加的线粒体代谢中的作用。这种对线粒体代谢的理解在治疗癌症、尤其是对于其中存在对抗预先存在的、固有的药物抗性和在药物暴露后获得的药物抗性的未满足的需求的癌症中非常重要。
3.概述在某些方面，本文提供了涉及抑制肿瘤和/或免疫细胞的生长或增殖的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定是否所述肿瘤和/或免疫细胞的特征在于蛋白硫辛酰化水平高于阈值水平。在一些实施方案中，所述方法包括如果蛋白硫辛酰化水平高于阈值水平，则使所述肿瘤和/或免疫细胞与铜离子载体接触。
4.在某些方面，本文提供了涉及治疗受试者的对于用抗癌剂治疗难治的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定癌症是否包含高于阈值水平的蛋白硫辛酰化水平。在一些实施方案中，所述方法包括如果所述癌症的特征在于蛋白硫辛酰化水平高于阈值水平，则将铜离子载体和所述抗癌剂联合施用于所述受试者。
5.在某些方面，本文提供了涉及鉴定候选抗癌剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞样品与测试剂接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括测量所述细胞样品的细胞蛋白硫辛酰化水平的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：如果与未与测试剂接触的细胞样品的细胞蛋白硫辛酰化水平相比，细胞蛋白硫辛酰化水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
6.在某些方面，本文提供了涉及确定肿瘤和/或免疫细胞中增加的线粒体代谢的方法。在一些实施方案中，所述方法包括对所述肿瘤和/或免疫细胞中的硫辛酸染色。
7.在某些方面，本文提供了涉及鉴定候选抗癌剂的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将细胞样品用铜-补充培养基孵育的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞样品与测试剂接触的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括测量所述细胞样品的细胞活力的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：如果与用铜-补充培养基孵育且不
与测试剂接触的细胞样品的细胞活力水平相比，细胞活力水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
8.在某些方面，本文提供了涉及鉴定候选抗癌剂的方法。此类方法可以包括：将细胞样品用铜螯合剂孵育的步骤，使细胞样品与测试剂接触的步骤，和/或测量所述细胞样品的细胞死亡的步骤。在此类方法中，如果与用铜螯合剂孵育且不与测试剂接触的细胞样品的细胞死亡水平相比，细胞死亡水平降低，则可以将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
9.在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含测试剂和用于测量细胞蛋白硫辛酰化的测定试剂(assay)。
10.在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含铜-补充培养基、测试剂和用于测量细胞活力的测定试剂。
11.在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含铜螯合剂、测试剂和用于测量细胞死亡的测定试剂。
12.附图简述图1显示表明铜在伊利司莫杀伤中的作用的示例性结果。
13.图2显示来自tsvetkov等人, nat chem bio, 2019的全基因组crispr拯救筛选的示例性结果。
14.图3显示来自tsvetkov等人, nat chem bio, 2019的伊利司莫灵敏度的prism生物标志物分析。
15.图4显示来自tsvetkov等人, nat chem bio, 2019的fdx1的带状结构，其中伊利司莫结合残基着色。
16.图5显示来自tsvetkov等人, nat chem bio, 2019的在伊利司莫不存在的情况下(对照)或在5x伊利司莫或10x伊利司莫存在的情况下fe-s组装随着时间的变化。
17.图6显示来自tsvetkov等人, nat chem bio, 2019的举例说明伊利司莫-cu(ii)是fdx1的新底物的示例性结果。
18.图7显示表明线粒体代谢的升高水平预测伊利司莫灵敏度的示例性结果。
19.图8显示表明fdx1调节细胞中的硫辛酸途径、硫辛酸结合铜和伊利司莫减少细胞硫辛酸的示例性结果。
20.图9显示示例性化合物促进癌细胞中的铜依赖性细胞死亡。
21.图10显示对伊利司莫敏感的肿瘤中的升高水平的线粒体代谢的硫辛酸染色。
22.图11显示表明线粒体铜毒性导致非凋亡性细胞死亡的示例性结果。
23.图12显示prism再利用二级筛选的示例性结果。使用每个化合物对的所有剂量之间的最大pearson相关性来着色热图。
24.图13显示在10
µ
m fecl2、fecl3、zncl2、nicl、cucl2或cocl2存在的情况下用递增剂量的所示药物处理后的mon细胞的活力。
25.图14显示在10
µ
m fecl2、fecl3、zncl2、nicl、cucl2或cocl2存在的情况下用递增剂量的所示药物处理后ncih2030细胞的活力。
26.图15显示血清中的铜丰度决定bcpap细胞和psn1细胞中的伊利司莫毒性。
27.图16显示血清中的铜丰度决定a549细胞中的伊利司莫毒性。
28.图17显示在a549细胞中使用靶向3000种代谢相关基因的文库(~10grna/基因)的
crispr-cas9阳性选择筛选的实验设置。
29.图18显示a549细胞中fdx1的缺失赋予对伊利司莫-cu(ii)和双硫仑-cu(ii)的相对抗性和ovise细胞中lias或fdx1的缺失赋予对伊利司莫-cu(ii)的抗性。
30.图19显示fdx1缺失与两个不同途径的组分的缺失相关。
31.图20显示表明fdx1的缺失消除ovise细胞和k562细胞两者中的细胞硫辛酰化蛋白的示例性western印迹。
32.图21显示表明fdx1的缺失消除ovise细胞和k562细胞两者中的细胞硫辛酰化蛋白的示例性显微图像。
33.图22显示提出的硫辛酸途径中的fdx1功能的模型。
34.图23显示通过检查724种细胞系的活力的分布。
35.图24显示fdx1表达水平的实验验证。
36.图25显示在抗性和敏感细胞中硫辛酰化蛋白的western印迹分析。
37.图26显示用1μm伊利司莫(+cucl2)处理a549细胞后的硫辛酰化水平降低。
38.图27显示与1μm cucl2或1μm cucl2孵育的细胞的对照处理或用100nm伊利司莫处理24小时的示例性显微照片。
39.图28显示用伊利司莫或伊利司莫-cu(1:1比率)处理后的五种卵巢癌细胞系的活力。
40.图29显示凋亡途径的图；实验抑制的靶标以红色标记。
41.图30显示在72小时之后在含有葡萄糖或半乳糖的培养基中生长的143b和143b rho0细胞的示例性活力结果。
42.图31显示在72小时之后用指示浓度的伊利司莫-cu(1:1比率)处理的143b和143b rho0细胞的示例性活力结果。
43.图32a-f显示在用指示浓度的不同化合物(吡啶硫酮-cu (pyrithione-cu)是吡啶硫酮-cucl
2 (1:1)；tmt-cu是tmt-cucl
2 (1:1)；8hq-cu是8-hq-cucl
2 (1:1)；双硫仑-cu是双硫仑-cucl
2 (1:1)；nsc319726-cu是nsc319726-cu cl
2 1(1:1)；antia是抗霉素a)处理之后的hcm18对照细胞或bax和bax缺失细胞的示例性活力结果。
44.图32g-l显示在72小时后在培养基中在10mm葡萄糖或10mm半乳糖存在的情况下生长的nchih2030细胞的示例性活力结果(吡啶硫酮-cu是吡啶硫酮-cucl
2 (1:1)；tmt-cu是tmt-cucl
2 (1:1)；8hq-cu是8-hq-cucl
2 (1:1)；双硫仑-cu是双硫仑-cucl
2 (1:1)；nsc319726-cu是nsc319726-cu cl
2 1(1:1)；antia是抗霉素a)。
45.图32m-u显示在用指定浓度的指示化合物(吡啶硫酮-cu是吡啶硫酮-cucl
2 (1:1)；tmt-cu是tmt-cucl
2 (1:1)；8hq-cu是8-hq-cucl
2 (1:1)；双硫仑-cu是双硫仑-cucl
2 (1:1)；nsc319726-cu是nsc319726-cu cl
2 1(1:1)；antia是抗霉素a)处理72小时之后的143b和143b rho0细胞的示例性活力结果。
46.图33a-d显示crispr-cas9基因敲除筛选的示例性结果。
47.图34显示硫辛酸途径的示意图。fe-s簇酶lias调节酶(包括dlat)的赖氨酸硫辛酰化。
48.图35显示通过功能标记分开的fdx1 ko k562细胞和aavs1 k562对照细胞之间的代谢物的平均log2倍数变化。以橙色标记的代谢物与硫辛酸途径相关。
49.图36显示用指示浓度的伊利司莫处理8小时并针对硫辛酰化蛋白含量进行分析的mon细胞的示例性western印迹。
50.图37显示在用40nm伊利司莫处理细胞6小时之后硫辛酰化dlat和dlst水平的示例性定量。
51.图38显示fdx1基因拷贝改变分析的示例性结果。
52.图39显示用1,583种化合物的第一次药物筛选的结果(左小图)，以及用851种化合物(中间小图)和示例性铜离子载体(右小图)的第二次药物筛选的结果。与对照相比，在蛋白酶体抑制剂抗性细胞的模型中，用4-5个剂量的1,583种化合物进行第一次药物筛选。与糖分解细胞代谢相比，在高oxphos的模型中，用5个剂量的851种化合物进行第二次药物筛选。铜离子载体是在高oxphos和pi抗性状态中优先杀死细胞的唯一一类化合物。
53.图40显示典型细胞死亡途径(凋亡、坏死性死亡和铁死亡)和铜死亡(cupropotosis)细胞死亡途径的示意图。铜死亡是一种新形式的调节的细胞死亡，其中不同的下游调节剂不与其他调节的细胞死亡程序(诸如凋亡，铁死亡和坏死性死亡)共用。
54.图41显示用两种铜离子载体的全基因组crispr/cas9缺失筛选的示例性结果(左小图)和显示拯救免于铜死亡的所有基因缺失与fdx1调节的蛋白硫辛酰化相关的维恩图(右小图)。用两种不同的铜结合离子载体(伊利司莫-cu和cu-ddc)的阳性选择的全基因组靶向crispr/cas9缺失筛选揭示当被缺失时促进对两种化合物的抗性的一种常见类型的基因。这些基因包括fdx1、蛋白硫辛酰化酶(lias、lipt1和dld)和硫辛酰化蛋白复合物丙酮酸脱氢酶的亚基(dlat、pdha1和pdhb)。
55.图42显示蛋白硫辛酰化途径的示意图。
56.图43显示确立fdx1是蛋白硫辛酰化的上游调节剂的蛋白硫辛酰化途径的示意图(左小图)和跨数百种癌细胞系的基因缺失依赖性的depmap分析(右小图)。跨数百种癌细胞系的基因依赖性的分析揭示，fdx1基因依赖性与参与硫辛酰化的蛋白的依赖性高度相关。
57.图44显示表明在伊利司莫敏感和抗性细胞系中的fdx1和硫辛酰化蛋白的蛋白水平的示例性图。
58.图45显示基于跨来自不同来源的数百种肿瘤的硫辛酰化蛋白的免疫组织化学(ihc)染色测定的示例性图，其确立蛋白硫辛酰化作为用于患者分层的蛋白生物标志物。
59.图46显示胃肠道基质肿瘤(gist)的示例性ihc显微照片(左小图)和sdh (琥珀酸脱氢酶)缺陷的gist的圆图。几乎所有sdhb缺陷的gist肿瘤表现出高水平的蛋白硫辛酰化。染色结果揭示，具有线粒体复合物ii蛋白sdhb的耗竭(主要由于sdha和sdhb基因中的突变)的特定gist肿瘤显示特别高水平的la染色。
60.图47显示确立生物标志物阳性小鼠异种移植模型的示例性图。
61.图48显示基于伊利司莫支架的示例性新铜离子载体。设计基于易处理的结构-活性-关系和结构-特性-关系。用早期易处理的sar合成6种伊利司莫类似物。
62.图49显示细胞中伊利司莫-cu(ii)类似物的细胞毒性取决于它们的氧化还原电位。当与铜结合时不同伊利司莫类似物的氧化还原电位在-50mv和-400mv之间，以使化合物具有有效的细胞杀伤(在md-mba455中，ic50＜300nm)。
63.图50显示prism再利用二次筛选的结果，其包括1,448种药物针对489种细胞系的生长抑制估计值。铜离子载体在药物空间中聚类。
64.图51显示药物发现管线的示意图。
65.图52a-c显示用la和fdx ihc染色的人乳腺癌(n＝67)、卵巢癌(n＝84)和人非小细胞肺癌(nsclc)切除部分(n＝57，每种情况2次重复)的组织微阵列(tma)分析的示例性图，并且由两个病理学家(s.c.，s.s.)对表达进行半定量评分，显示la和fdx表达之间的强直接相关性(平均值
±
s.d.；p＜0.0001)。
66.图52d-f显示示例性ihc染色显微照片。具有相关的la和fdx1的低(顶行)和高(底-行)表达(通过ihc)的乳腺癌(d)、卵巢癌(e)和nsclc (f)的代表性情况(比例尺条20μm)。
67.图53a-d显示表明fdx1的缺失消除psn1 (a-b)、bcpap (c)和abc1细胞(d)中的细胞硫辛酰化蛋白(dlat和dlst)的示例性western印迹。
68.图53e-h显示表明abc1 (e-f)和psn1细胞(g-h)中fdx1的缺失消除呼吸的示例性图。速率限制硫辛酰化酶lias用作参考对照。
69.图54a-e显示对于两种浓度的伊利司莫-cu (40nm和100nm)来自a549细胞系中的两次全基因组crispr/cas9缺失筛选的相比于计算的fdx1 (a)、dlat (b)、dld (c)和lias (d)基因的p-值的对数倍数变化的示例性图。(e)对于不同浓度的伊利司莫，fdx1 mrna表达与先前确定(4)的724种癌细胞系的活力的相关性评分。
70.图55a-c显示具有对照aavs1或fdx1基因缺失的abc1细胞的单细胞克隆的示例性western印迹和图。小图a显示fdx1、硫辛酰化dlat和dlst和粘着斑蛋白(作为上样对照)。从小图b中的小图a的底部测量每个单细胞克隆对伊利司莫的相对敏感性(在1μm cucl2存在的情况下)。小图c显示伊利司莫ec50和相对fdx1蛋白水平的相关性。超出特定阈值的fdx1的减少增加了对伊利司莫的细胞抗性。
71.图56a-f显示检查在模仿先前在小鼠模型中描述的药代动力学(pk)特性的条件下伊利司莫的效力的示例性图。小图a表明生物标志物阳性(高fdx1基因表达)细胞比生物标志物阴性细胞对伊利司莫更敏感。小图b和c显示在培养基中存在1μm cucl2的情况下，在100nm伊利司莫的2小时脉冲后在指示时间点测量的生物标志物阳性细胞-abc1(小图b)和生物标志物阴性-a549(小图c)细胞的活力。小图d和小图e显示在用100nm伊利司莫2小时脉冲处理后在abc1(d)和a549(e)中测量的代谢物的相对变化。小图f显示在用100nm伊利司莫脉冲处理后abc1细胞中景天庚酮糖-7-磷酸的变化。图g显示在用1nm伊利司莫处理24小时的对照aavs1和fdx1 ko abc1细胞中景天庚酮糖-7-磷酸的变化。
72.详述一般在某些方面，本文提供的方法和组合物部分地基于以下发现：表达某些生物标志物的肿瘤细胞可以用铜离子载体有效地治疗。示例性铜离子载体包括伊利司莫(elesclomol)和双硫仑(disulfiram)，其先前在美国专利申请 2018/0353445中公开。本文提供了测量肿瘤细胞中的某些生物标志物(诸如硫辛酰化蛋白(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt)和硫辛酸生物合成蛋白(例如，lias、lipt1、lipt2、dld))的水平的方法。本文还提供了测量生物标志物连同结合铜离子载体的某些线粒体蛋白(例如，fdx1、 aldha1、aldh2)的方法。在某些方面，本文提供的方法和组合物可以有利地用于抑制肿瘤的生长或增殖、治疗难治性癌症和/或鉴定候选抗癌剂。例如，在某些实施方案中，本文提供的方法和组合物对于治疗对靶向药物疗法抗性的癌症特
别有用。
73.定义为了方便起见，在此收集在说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
74.在本文中使用冠词“一个/种(a)”和“一个/种(an)”来指代该冠词的语法对象中的一个/种或多于一个/种(即，至少一个/种语法对象)。作为实例，“一个/种要素”意指一个/种要素或多于一个/种要素。
75.如本文所用，术语"施用"意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医疗专业人员施用和自我施用。
76.术语"试剂"指任何物质、化合物(例如，分子)、超分子复合物、材料或其组合或混合物。
77.术语"抗体"可以指完整抗体及其抗原结合片段。完整抗体是包括通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。每条重链包括重链可变区(在本文中缩写为vh)和重链恒定区。每条轻链包括轻链可变区(在本文中缩写为vl)和轻链恒定区。vh和vl区域可以进一步细分为超可变性区域，称为互补决定区域(cdr)，其散布有更保守的区域，称为框架区域(fr)。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq))的结合。术语"抗体"包括例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、单链抗体和抗原结合抗体片段。
78.术语"生物样品"、"组织样品"、或仅仅"样品"各自是指从受试者的组织获得的细胞的集合。组织样品的来源可以是实体组织，如来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官、组织样品、活检样品或抽吸物；血液或任何血液成分、血清、血液；体液诸如脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液、尿液、唾液、粪便、泪液；或来自受试者的妊娠或发育的任何时间的细胞。
79.术语"结合"或"相互作用"是指由于例如在生理条件下的静电、疏水、离子和/或氢键相互作用而在两个分子之间的缔合，其可能是稳定缔合。
80.术语"测量"是指确定样品中的物质的存在、不存在、数量或有效量，包括此类物质的浓度水平。
81.术语"难治的"是指对治疗不应答的癌症。应答的缺乏可以通过例如如下来评价：缺乏肿瘤生长的抑制或增加肿瘤生长；缺乏肿瘤细胞数量的减少或肿瘤细胞数量的增加；增加的肿瘤细胞浸润至邻近的外围器官和/或组织中；增加的癌转移；在治疗后存活长度的减少；和/或死亡率。癌症可以在治疗开始时是抗性的，或者它在治疗期间可能变得抗性。
82.如本文所用，术语"受试者"意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
83.术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并且包括向宿主施用一种或多种主题组合物。如果其在临床表现不希望的病况(例如宿主动物的疾病或其他不需要的状态)之前施用，则治疗是预防性的(即，其保护宿主免于产生不想要的病况)，而如果其在表现出不希望的病况之后施用，则治疗是治疗性的(即意图减轻、改善或稳定现有的不想要的病况或其副作用)。
84.如本文所用，“预防”病症和病况的治疗剂是指在统计学样品中相对于未治疗的对照样品减少治疗的样品中的病症和病况的发生，或相对于未治疗的对照样品延迟发作或减
少病症和病况的一种或多种症状的严重程度的化合物。
85.在某些实施方案中，治疗性化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂(例如，本文公开的免疫-肿瘤剂或化学治疗剂)联合施用。如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗化合物的任何形式的施用，使得施用第二化合物，同时先前施用的治疗化合物在体内仍然有效(例如，两种化合物同时在患者中有效，其可能包括两种化合物的协同作用)。例如，不同的治疗性化合物可以相同的制剂或以分开的制剂同时或依次施用。在某些实施方案中，不同的治疗性化合物可以在彼此的1小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时或一周内施用。因此，接受这种治疗的个体可受益于不同治疗性化合物的联合作用。
86.在某些实施方案中，治疗性化合物与一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种另外的化学治疗剂)的联合施用提供相对于化合物(例如，铜离子载体)或所述一种或多种另外的治疗剂的每次单独施用的改进的效力。在某些此类实施方案中，联合施用提供累加效应，其中累加效应是指治疗性化合物和所述一种或多种另外的治疗剂的单独施用的每种效果的总和。
87.药物组合物和施用在某些实施方案中，本文提供了药物组合物和使用药物组合物的方法。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含铜离子载体(例如，伊利司莫、双硫仑)。在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含抗癌剂(例如化学治疗剂、免疫检查点抑制剂、egfr抑制剂或蛋白酶体抑制剂)。
88.本发明还提供了可用于治疗有此需要的受试者的组合物和方法。在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如人或非人哺乳动物。在一些实施方案中，所述受试者具有癌症，任选地药物抗性癌症，例如，具有硫辛酰化的生物标志物的药物抗性癌症。当施用到受试者例如人时，组合物或化合物优选作为药物组合物施用，所述药物组合物包含例如治疗性化合物和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体在本领域中是众所周知的，并且包括例如水溶液如水或生理缓冲盐水或其他溶剂或媒介物诸如二醇、甘油、油诸如橄榄油或可注射的有机酯。在某些实施方案中，当这样的药物组合物用于人施用时，特别是用于侵入性施用途径(即途径诸如注射或植入，其避免通过上皮屏障的运输或扩散)时，水溶液是无热原的，或基本上无热原。例如，可以选择赋形剂以实现试剂的延迟释放或选择性靶向一种或多种细胞、组织或器官。药物组合物可以是剂量单位形式，诸如片剂、胶囊(包括粉末胶囊(sprinkle capsule)和明胶胶囊)、颗粒、重构冻干剂、粉末、溶液、糖浆、栓剂、注射剂等。该组合物还可以存在于透皮递送系统(例如皮肤贴剂)中。该组合物也可以存在于适合于局部施用的溶液(诸如滴眼剂)中。
89.在某些实施方案中，本文提供的药物组合物包含药学上可接受的载体。如本文所用的短语"药学上可接受的载体"意指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，诸如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。药学上可接受的载体可以含有生理学上可接受的试剂，其例如用于稳定、增加溶解度或增加化合物的吸收。此类生理学上可接受的试剂包括例如碳水化合物诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖、抗氧化剂诸如抗坏血酸或谷胱甘肽、螯合剂、低分子量蛋白或其他稳定剂或赋形剂。药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的试剂)的选择取决于例如组合物的施用途径。制剂或药物组合物可以是自乳化药物递送系统
着色剂。在胶囊(包括粉末胶囊和明胶胶囊)、片剂和丸剂的情况下，药物组合物也可包含缓冲剂。也可使用类似类型的固体组合物作为在使用赋形剂诸如乳糖(lactose)或乳糖(milk sugars)以及高分子量聚乙二醇等的软和硬-填充的明胶胶囊中的填充剂。
96.片剂可以通过压制或模制，任选地用一种或多种辅助成分制得。压制片剂可以使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联的羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片剂可以通过在合适的机器中将经惰性液体稀释剂湿润的粉末化化合物的混合物模压成形而制得。
97.药物组合物的片剂和其他固体剂型，诸如糖锭剂、胶囊(包括粉末胶囊和明胶胶囊)、丸剂和颗粒剂，可任选划痕(scored)或用包衣和壳(诸如肠溶包衣和制药领域众所周知的其他包衣)制备。它们也可使用例如羟丙基甲基纤维素(以各种比例以提供期望的释放曲线)、其他聚合物基质、脂质体和/或微球体来配制，以提供缓慢释放或控制释放其中的活性成分。它们可以例如，通过细菌截留滤器而过滤，或通过并入可溶于无菌水的无菌固体组合物形式的灭菌剂，或通过在临用前并入一些其他无菌可注射的介质来灭菌。这些组合物也可任选地含有遮光剂并且可以具有这样的组成，即它们仅释放活性成分，或优先地在胃肠道的某些部分中任选地以延迟方式释放。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性成分也可以微囊形式存在，如果合适的话，与上述赋形剂中的一种或多种一起。
98.可用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、用于重构的冻干制剂、微乳剂、溶液剂、悬浮液、糖浆剂和酏剂。除了活性成分，液体剂型还可含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如例如，水或其他溶剂、环糊精及其衍生物、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，及其混合物。
99.除了惰性稀释剂，口服组合物还可包括辅助剂诸如湿润剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、香料和防腐剂。
100.除了活性化合物以外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶及其混合物。
101.用于直肠、阴道或尿道施用的药物组合物的制剂可以栓剂形式呈现，其可以通过将一种或多种活性化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述非刺激性赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯，且在室温下为固体，但在体温下为液体，因此将在直肠或阴道腔中熔融并释放活性化合物。
102.用于口腔施用的药物组合物的制剂可以作为漱口剂、口腔喷雾剂或口腔软膏剂提供。
103.可替换地或另外地，可以配制组合物以经由导管、支架、线或其他腔内装置递送。通过此类装置递送可能对递送到膀胱、尿道、输尿管、直肠或肠特别有用。
104.适合于阴道施用的制剂还包括含有本领域中已知适合的载体的阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
105.用于局部或经皮施用的剂型包括粉末、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、溶液、贴剂和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体和与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
106.除了活性化合物以外，软膏剂、糊剂、乳膏剂和凝胶还可含有赋形剂诸如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石和氧化锌或其混合物。
107.除了活性化合物以外，粉末和喷雾剂还可含有赋形剂诸如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末或这些物质的混合物。喷雾剂还可含有常规推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未被取代的烃，诸如丁烷和丙烷。
108.如本文所用的短语“胃肠外施用(parenteral administration)”和“胃肠外地施用(administered parenterally)”是指除肠内和局部施用以外的施用模式，通常通过注射，且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。适合于胃肠外施用的药物组合物包含与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液或无菌粉末组合的一种或多种活性化合物，所述粉末可以在临用前重构成无菌可注射的溶液或分散液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与计划的接受者的血液等渗的溶质，或助悬剂或增稠剂。
109.可用于药物组合物中的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，通过使用包衣材料诸如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的粒度，并且通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
110.这些组合物还可以含有佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。防止微生物起作用可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来确保。将等渗剂诸如糖、氯化钠等包括在组合物中也是期望的。另外，可通过包含延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。
111.在一些情况下，为了延长药物的作用，期望减缓从皮下或肌内注射的药物的吸收。这可以通过使用具有差的水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来完成。药物的吸收速率则取决于其溶解速率，所述溶解速率进而取决于晶体大小和结晶形式。或者，胃肠外施用的药物形式的延迟吸收通过将药物溶解或悬浮于油性媒介物中来完成。
112.通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题化合物的微胶囊化基质来制备可注射储库形式。根据药物与聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放的速率。其他生物可降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳液中制备储库可注射制剂。
113.在某些实施方案中，可以给予活性化合物本身或作为含有例如0.1至99.5%(更优选0.5至90%)的活性成分与药学上可接受的载体组合的药物组合物。
114.引入方法也可以通过可再注入或可生物降解装置来提供。近年来已经开发和在体内测试各种缓释聚合物装置，用于药物的受控递送，包括蛋白生物制药。可以使用各种生物相容性聚合物(包括水凝胶)，包括可生物降解的和不可降解的聚合物，以形成用于在特定目标位置持续释放化合物的植入物。
115.可以改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以获得有效实现特定受试者、组合物和施用模式的期望治疗反应、而对受试者没有毒性的活性成分的量。
116.如果期望，活性化合物的有效日剂量可作为1、2、3、4、5、6或更多个亚剂量施用，其
在整天以适当间隔、任选地以单位剂型分开施用。在某些实施方案中，活性化合物可以每天2或3次施用。在优选的实施方案中，活性化合物将每天1次施用。
117.在某些实施方案中，化合物可以单独使用或与另一种类型的治疗剂(例如，本文公开的免疫-肿瘤剂或化学治疗剂)联合施用。如本文所用，短语“联合施用”是指两种或更多种不同治疗化合物的任何形式的施用，使得施用第二化合物，同时先前施用的治疗化合物在体内仍然有效(例如，两种化合物同时在患者中有效，其可能包括两种化合物的协同作用)。例如，不同的治疗化合物可以相同的制剂或以分开的制剂同时或依次施用。在某些实施方案中，不同的治疗性化合物可以在彼此的1小时，12小时，24小时，36小时，48小时，72小时或一周内施用。因此，接受这种治疗的个体可受益于不同治疗化合物的联合作用。
118.在某些实施方案中，治疗性化合物与一种或多种另外的治疗剂(例如一种或多种另外的化学治疗剂)的联合施用提供相对于化合物(例如，铜离子载体)或所述一种或多种另外的治疗剂的每个单独施用的改进的效力。在某些此类实施方案中，联合施用提供累加效应，其中累加效应是指治疗化合物和所述一种或多种另外的治疗剂的单独施用的每种效果的总和。
119.在某些实施方案中，本文提供的方法中可以使用化合物的药学上可接受的盐。合适的盐包括，但不限于hcl、三氟乙酸(tfa)、马来酸盐、烷基、二烷基、三烷基或四烷基铵盐。在某些实施方案中，考虑的盐包括，但不限于l-精氨酸、苯乙苄胺(benenthamine)、苄星(benzathine)、甜菜碱、氢氧化钙、胆碱、地阿诺、二乙醇胺、二乙胺、2-(二乙基氨基)乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-甲基葡糖胺、海巴明(hydrabamine)、1h-咪唑、锂、l-赖氨酸、镁、4-(2-羟乙基)吗啉、哌嗪、钾、1-(2-羟乙基)吡咯烷、钠、三乙醇胺、氨丁三醇和锌盐。在某些实施方案中，考虑的盐包括，但不限于na、ca、k、mg、zn、铜、钴、镉、锰或其他金属盐。
120.润湿剂、乳化剂和润滑剂，诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
121.药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；(2) 油溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(bha)、丁羟甲苯(bht)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和 (3) 金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
122.在一些实施方案中，在本文的方法中使用的治疗化合物是铜离子载体。示例性铜离子载体提供于表1中。
123.表1. 示例性铜离子载体化合物名称结构吡啶硫酮锌(pyrithionezinc)
四甲基秋兰姆-单硫化物羟基喹啉(8hq)伊利司莫双硫仑thiramcu(gtsm)
nsc-319726fr-122047cu(isapn)
124.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是基于paullone的络合物，其两个代表性结构显示如下。
125.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是基于casiope
í
na的络合物，其两个代表性结构显示如下。
126.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是双(硫代半卡巴腙) cu络合物，其代表性结构显示如下。
127.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是基于isatin-schiff的络合物，其两个代表性结构显示如下。表性结构显示如下。
128.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是(d-吡喃葡萄糖)-4-苯基氨基硫脲cu络合物，其代表性结构显示如下。
129.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是bcana2，其代表性结构显示如下。
130.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是bcsna2，其代表性结构显示如下。
131.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是bcsana2，其通式结构显示如下。
132.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是pta，其结构显示如下。
133.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是dapta，其结构显示如下。
134.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是可溶性硫代半卡巴腙络合物，其代表性结构显示如下。
135.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是schiff碱络合物，其代表性结构显示如下。
136.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是二硫代氨基甲酸盐(dithiocarbamate)。在一些实施方案中，所述二硫代氨基甲酸盐是四乙基秋兰姆二硫化物(双硫仑；cas登记号 97-77-8)，其结构显示如下。
137.在一些实施方案中，所述治疗性化合物是被称为化合物339的双硫仑类似物(sharma, v.,等人 mol carcinog. 2015 nov 24. doi: 10.1002/mc.22433. [在印刷之前电子出版])。在一些实施方案中，所述化合物是双硫仑代谢物。在一些实施方案中，二硫代氨基甲酸盐是吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pdtc)。
[0138]
在一些实施方案中，所述治疗性化合物是双(硫代酰肼酰胺)(bis(thio-hydrazide amide))。示例性双(硫代酰肼酰胺)描述于美国专利号6,762,204、6,800,660、6,924,312、7,001,923、7,037,940、美国专利申请公开号20030045518、20030119914、20030195258和20080119440中。例如，在一些实施方案中，双(硫代酰肼酰胺)(bis(thio-hydrazamide amide))由美国专利号6,800,660中公开的结构式(i)-(vi)中的任一种代表，其中各种变量和化学术语如其中所述定义。在一些实施方案中，双(硫代酰肼酰胺)由美国专利：申请公开号20080119440 (us20080119440)中公开的结构式i、ii、iiia、iiib、iva、ivb或v中的任一种代表，其中各种变量和化学术语在其中定义并描述。为了方便起见，某些此类术语的定义如下所述。在一些实施方案中，例如，所述化合物具有以下结构式(如us20080119440中所述的式1)：其中y是共价键或任选地取代的直链烃基，或y，连同其与之键合的两个》c=z基团一起，是任选地取代的芳族基团；r
1-r4独立地是-h、任选地取代的脂族基团、任选地取代的芳基，或r1和r3连同它们与之键合的碳和氮原子一起，和/或r2和r4连同与它们与之键合的
和r4均为对cf
3-苯基；r1和r2均为甲基，且r3和r4均为o
‑‑
ch
3-苯基；r1和r2均为
‑‑
(ch2)3cooh；且r3和r4均为苯基；r1和r2均由以下结构式代表：且r3和r4均为苯基；r1和r2均为正丁基，且r3和r4均为苯基；r1和r2均为正戊基；r3和r4均为苯基；r1和r2均为甲基，且r3和r4均为2-吡啶基；r1和r2均为环己基，且r3和r4均为苯基；r1和r4均为甲基，且r3和r4均为2-乙基苯基，r1和r2均为甲基，且r3和r4均为2,6-二氯苯基；r
1-r4全部为甲基；r1和r2均为甲基，且r3和r4均为叔丁基；r1和r2均为乙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为叔丁基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为环丙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为环丙基，且r3和r4均为乙基；r1和r2均为1-甲基环丙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为2-甲基环丙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为1-苯基环丙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为2-苯基环丙基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为环丁基，且r3和r4均为甲基；r1和r2均为环戊基，且r3和r4均为甲基；r1为环丙基，r2为苯基，且r3和r4均为甲基。在一些实施方案中，例如，r1和r2是取代或未取代的苯基，且r3和r4是低级烷基(例如，甲基)，其中在一些实施方案中，(i) r1和r2是相同的；(ii) r3和r4是相同的；或(iii) r1和r2是相同的且r3和r4是相同的。
[0141]
在一些实施方案中，双(硫代酰肼酰胺)具有下式(如us20080119440中所述的式iiia)：其中z、r1、r2、r3、r4、r7和r8如上文对于式a所定义，且其中r5和r6独立地是-h或低级烷基，例如甲基、乙基、丙基。在一些实施方案中，z是o。在一些实施方案中，r1、r2、r3和r4如对于式b1或b2所定义，且r5和r6独立地是-h或低级烷基，例如甲基、乙基、丙基。
[0142]
如本文所用，除非另有指明，否则与us20080119440一致，"烷基"是饱和直链或支链直链或环状烃基。通常，直链或支链烷基具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子，且环状烷基具有3至约10个、优选3至约8个碳原子。烷基优选是直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基或辛基，或具有3至约8个碳原子的环烷基。c1-c8直链或支链烷基或c3-c8环状烷基也被称为"低级烷基"基团，如上所示。
[0143]
"直链烃基"是亚烷基，即
‑‑
(ch2)y‑‑
，其中一个或多个(优选一个)内部亚甲基(
‑‑
(ch2)
‑‑
)任选地被连接基团替代。y是正整数(例如，在1和10之间)，优选在1和6之间，且更优选为1或2。"连接基团"在本文中是指替代直链烃基中的亚甲基的官能团。合适的连接基团的实例包括酮(
‑‑
c(o)
‑‑
)、烯烃、炔烃、亚苯基、醚(
‑‑o‑‑
)、硫醚(
‑‑s‑‑
)或胺(
‑‑
n(r3)
‑‑
)，其中r如下定义。
[0144]
"脂族基团"是直链、支链或环状非芳香烃，其完全饱和或含有一个或多个不饱和单元。通常，直链或支链脂族基团具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子，并且环状脂族基团具有3至约10个碳原子，优选3至约8个碳原子。脂族基团优选为直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基或辛基，或具有3至约8个碳原子的环烷基。
[0145]
术语"芳香基团"可以与"芳基"、"芳基环"、"芳香环"、"芳基基团"和"芳香基团"可互换使用。芳香基团包括碳环芳香基团诸如苯基、萘基和蒽基(anthracvl)，以及杂芳基诸如咪唑基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、吡唑基、吡咯基、吡嗪基、噻唑、噁唑基和四唑。术语"杂芳基"可以与"杂芳基"、"杂芳基环"、"杂芳香环"和"杂芳香基团"可互换使用。杂芳基是在环结构中包含一个或多个杂原子(诸如硫、氧和氮)的芳香基团。优选地，杂芳基包含1至4个杂原子。芳香基团还包括稠合的多环芳香环体系，其中碳环芳香环或杂芳基环与一个或多个其他杂芳基环稠合。实例包括苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、苯并噻唑、苯并噁唑、苯并咪唑、喹啉基、异喹啉基和异吲哚基。非芳香杂环是在环中包括一个或多个杂原子诸如氮、氧或硫的非芳香环。所述环可以是五元、六元、七元或八元的。优选地，杂环基团包含1至约4个杂原子。实例包括四氢呋喃基、四氢噻吩基、吗啉代、硫代吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基和噻唑烷基。
[0146]
用于芳基或脂族基团的合适取代基的实例描述于美国专利申请公开号20080119440中。例如，在一些实施方案中，取代基是选自以下的基团：ra、
‑‑
oh、
‑‑
br、
‑‑
cl、
‑‑
f、
‑‑o‑‑
cora、
‑‑
cn、
‑‑
ncs、
‑‑
no2、
‑‑
cooh、
‑‑
nh2、
‑‑
n(rarb)、
‑‑
coora、
‑‑
cho、
‑‑
conh2、
‑‑
conhra、
‑‑
con(rarb)、
‑‑
nhcora、
‑‑
nrccora、
‑‑
nhconh2、
‑‑
nhconrah、
‑‑
nhcon(rarb)、
‑‑
nrcconh2、
‑‑
nrcconah、
‑‑
nrccon(rarb)、
‑‑
c(=nh)
‑‑
nh2、
‑‑
c(=nh)
‑‑
nhw、
‑‑
c(=nh)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
c(nrc)
‑‑
nh2、
‑‑
c(=nrc)
‑‑
nhra、
‑‑
c(=nrc)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
nh
‑‑
c(=nh)
‑‑
nh2、
‑‑
nh
‑‑
c(=nh)
‑‑
nhra、
‑‑
nh
‑‑
c(=nh)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
nh
‑‑
c(=nrc)
‑‑
nh2、
‑‑
nh
‑‑
c(=nrc)
‑‑
nha、
‑‑
nh
‑‑
c(=nrc)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
nrd‑‑
c(=nh)
‑‑
nh2、
‑‑
nrd‑‑
c(=nh)
‑‑
nhra、
‑‑
nrd‑‑
c(=nh)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
nrd‑‑
c(=nrc)
‑‑
nh2、
‑‑
nrd‑‑
c(=nrc)
‑‑
nhra、
‑‑
nrd‑‑
c(=nrc)
‑‑
n(rarb)、
‑‑
nhnh2、
‑‑
nhnhra、
‑‑
nhnrarb、
‑‑
so2nh2、
‑‑
so2nhra、
‑‑
so2nrarb、
‑‑
ch=chra、
‑‑
ch=crarb、
‑‑
crccrarb、
‑‑
crc=chra、
‑‑
crc=crarb、
‑‑
ccra、
‑‑
sh、
‑‑
sra、
‑‑
s(o)ra、
‑‑
s(o)2ra，其中r
a-rd各自独立地是烷基、芳香基团、非芳香杂环基；或
‑‑
n(rarb)，一起形成任选地取代的非芳香杂环基，其中由r
a-rd代表的烷基、芳香和非芳香杂环基团和由
‑‑
n(rarb)代表的非芳香杂环基团各自任选地和独立地被一个或多个由r
#
代表的基团取代，其中r是r
+
、
‑‑
o(卤代烷基)、
‑‑
sr
+
、
‑‑
no2、
‑‑
cn、
‑‑
ncs、
‑‑
n(r
+
)2、
‑‑
nhco2r
+
、
‑‑
nhc(o)r
+
、
‑‑
nhnhc(o)r
+
、
‑‑
nhc(o)n(r
+
)2、
‑‑
nhnhc(o)n(r
+
)2、
‑‑
nhnhco2r
+
、
‑‑
c(o)c(o)r
+
、
‑‑
c(o)ch2c(o)r
+
、
‑‑
co2r
+
、
‑‑
c(o)r
+
、c(o)n(r
+
)2、
‑‑
oc(o)r
+
、
‑‑
oc(o)n(r
+
)2、
‑‑
s(o)2r-、
‑‑
so2n(r
+
)2、
‑‑
s(o)r
+
、
‑‑
nhso2n(r
+
)2、
‑‑
nhso2r
+
、
‑‑
c(=s)n(r
+
)2或
‑‑
c(=nh)
‑‑
n(r
+
)2；其中r
+
是
‑‑
h、c1-c4烷基、单环杂芳基、非芳香杂环基或苯基，其任选地被烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、卤素、
‑‑
cn、
‑‑
no2、胺、烷基胺或二烷基胺取代；或
‑‑
n(r
+
)2是非芳香杂环基，条件是由r
+
和
‑‑
n(r
+
)
2 (其包含仲环胺)代表的非芳香杂环基团任选地被酰化或烷基化。
[0147]
在某些实施方案中，苯基、诸如可存在于由r
1-r4代表的位置处的苯基的取代基包括c1-c4烷基、c1-c4烷氧基、c1-c4卤代烷基、c1-c4卤代烷氧基、苯基、苄基、吡啶基、
‑‑
oh、
‑‑
nh
2、
‑‑
f、
‑‑
cl、
‑‑
br、
‑‑
i、
‑‑
no2或
‑‑
cn。在某些实施方案中，环烷基、诸如可存在于由r1和r2代表的位置处的环烷基的取代基是烷基，诸如甲基或乙基。在某些实施方案中，r1和r2均为任选地被至少一个烷基取代的c3-c8环烷基。
[0148]
在一些实施方案中，双(硫代酰肼酰胺)是如美国专利申请公开号20080119440中所述的化合物(1)-(18)中的任一种。
[0149]
在一些实施方案中，双(硫代酰肼酰胺)是伊利司莫，其结构如下：。
[0150]
在一些实施方案中，双(硫-酰肼酰胺)是伊利司莫或其类似物。合适类似物的一些实例如下：实例如下：实例如下：实例如下：。
[0151]
在一些方面，本文所述的任何双(硫代酰肼酰胺)化合物(例如，伊利司莫或其类似物)与任何蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、opmzomib、ixazoinib、delanzomib或这些中任一种的类似物)联合使用，以治疗需要治疗癌症的受试者。癌症可以对蛋白酶体抑制剂有抗性。在一些实施方案中，本文所述的双(硫代酰肼酰胺)化合物(例如，伊利司莫或其类似物和蛋白酶体抑制剂在同一组合物中施用。在一些实施方案中，它们分开施用。在
一些实施方案中，一种方法包括向已经接受或预期接受一个或多个剂量的蛋白酶体抑制剂的受试者施用双(硫代酰肼酰胺)。预期接受蛋白酶体抑制剂的受试者可以是已经对其开出蛋白酶体抑制剂处方或者对其开出蛋白酶体抑制剂处方或施用蛋白酶体抑制剂的计划已经由受试者的健康护理提供者(例如，受试者的肿瘤学家)提交给有形介质的受试者。在一些实施方案中，预期受试者在施用双(硫代酰肼酰胺)的4周内接受蛋白酶体抑制剂。在一些实施方案中，一种方法包括向已经接受或预期接受一个或多个剂量的双(硫代酰肼酰胺)的受试者施用蛋白酶体抑制剂。预期接受双(硫代酰肼酰胺)的受试者可以是已经对其开出双(硫代酰肼酰胺)处方或者对其开出双(硫代酰肼酰胺)处方或施用双(硫代酰肼酰胺)的计划已经由受试者的健康护理提供者(例如，受试者的肿瘤学家)提交给有形介质的受试者。在一些实施方案中，预期受试者在施用蛋白酶体抑制剂的4周内接受双(硫代酰肼酰胺)。
[0152]
在一些实施方案中，本文所述的任何双(硫代酰肼酰胺)化合物(例如，伊利司莫或其类似物)可以与任何一种或多种egfr抑制剂(例如吉非替尼、奥西替尼、酪氨酸激酶抑制剂或这些中的任一种的类似物)联合使用以治疗需要治疗癌症的受试者。癌症可以对egfr抑制剂有抗性。在一些实施方案中，本文所述的双(硫代酰肼酰胺)化合物(例如，伊利司莫或其类似物)和egfr抑制剂在同一组合物中施用。在其他实施方案中，它们分开施用。在一些实施方案中，一种方法包括向已经接受或预期接受一个或多个剂量的egfr抑制剂的受试者、例如已经对其开出egfr抑制剂处方或者对其开出egfr抑制剂处方或施用egfr抑制剂的计划已经由受试者的健康护理提供者(例如，受试者的肿瘤学家)提交给有形介质的受试者施用双(硫代酰肼酰胺)。在一些此类实施方案中，可以预期受试者在施用双(硫代酰肼酰胺)的4周内接受egfr抑制剂。
[0153]
在一些实施方案中，所述方法包括向已经接受或预期接受一个或多个剂量的双(硫代酰肼酰胺)的受试者、例如已经对其开出双(硫代酰肼酰胺)处方或者对其开出双(硫代酰肼酰胺)处方或施用双(硫代酰肼酰胺)的计划已经由受试者的健康护理提供者(例如，受试者的肿瘤学家)提交给有形介质的受试者施用egfr抑制剂。在一些此类实施方案中，预期受试者在施用egfr抑制剂的4周内接受双(硫代酰肼酰胺)。
[0154]
在一些方面，考虑使用含有单个c＝s部分的伊利司莫类似物用于本文对于伊利司莫所述的任何目的。例如，上述式a或b的伊利司莫或其他双(硫代酰肼酰胺)中的c＝s部分之一可以被c＝o部分替代。例如，在一些实施方案中，所述化合物如下：在一些实施方案中，考虑使用如美国专利申请公开号20120065206 (us20120065206)中所呈现的式(i)的化合物，以用于可以如本文所述使用伊利司莫(或其他双(硫代酰肼酰胺))的任何目的。出于本公开的目的，此类化合物被认为是伊利司莫类似物。可被称为磺酰基酰肼化合物的此类化合物被描绘如下：
其中每个z独立地是s、o或se，条件是z不能均为o；r1和r2各自独立地选自任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基；任选地取代的环烷基、任选地取代的环烯基、任选地取代的杂环基，其中杂环基经由碳-碳键与硫代羰基碳键合、任选地取代的苯基、任选地取代的双环芳基、任选地取代的五至七元单环杂芳基、任选地取代的九至十四元双环杂芳基，其中杂芳基经由碳-碳键与硫代羰基碳键合、
‑‑
nr
12r13
、or
14
、
‑‑
sr
14
和
‑‑
s(o)
pr15
；r3和r4各自独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔基、任选地取代的环烷基、任选地取代的环烯基、任选地取代的杂环基和任选地取代的五至六元芳基或杂芳基；或r1和r3和/或r2和r4，与它们与之连接的原子一起，形成任选地取代的杂环基或任选地取代的杂芳基；r5是
‑‑
cr6r7‑‑
、
‑‑
c(=chr8)
‑‑
或
‑‑
c(=nr8)
‑‑
；r6和r7均为
‑‑
h或任选地取代的低级烷基；r8选自
‑‑
oh、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、任选地取代的苯基、任选地取代的双环芳基、任选地取代的五至六元单环杂芳基、任选地取代的九至十四元双环杂芳基、任选地取代的环烷基或任选地取代的杂环基；
‑‑
nr
10r11
和
‑‑
cor9；r9是任选地取代的苯基、任选地取代的双环芳基、任选地取代的五或六元单环杂芳基、任选地取代的九至十四元双环杂芳基、任选地取代的烷基、任选地取代的环烷基或任选地取代的杂环基；r
10
和r
11
各自独立地选自
‑‑
h、
‑‑
oh、氨基、(二)烷基氨基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烯氧基、炔氧基、羟基烷基、羟基烯基、羟基炔基、卤代烷基、卤代烯基、卤代炔基、任选地取代的苯基、任选地取代的双环芳基、任选地取代的五至六元单环杂芳基、任选地取代的九至十四元双环杂芳基、任选地取代的环烷基或任选地取代的杂环基和
‑‑
cor9，或r
10
和r
11
，与它们与之连接的氮原子一起，形成五至六元杂芳基；且r
12
、r
13
和r
14
各自独立地是
‑‑
h、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的苄基，或r
12
和r
13
，与它们与之连接的原子一起，形成任选地取代的杂环基或任选地取代的杂芳基；r
15
是任选地取代的烷基、任选地取代的芳基或任选地取代的杂芳基，且p是1或2；条件是当z均为s且r3和r4均为甲基时，则r1和r2并非均为未取代的苯基。在一些实施方案中，r
10
和r
11
并非均为
‑‑
h。在某些实施方案中考虑使用上式d的化合物，其中两个z均为s且r3和r4均为甲基，且r1和r2均为未取代的苯基。在式d的某些实施方案中，至少一个z是s。在式d的某些实施方案中，两个z均为s。在一些实施方案中，考虑使用式d的化合物，其中两个z均为s且r3和r4为甲基，且r1和r2均为低级烷基，例如，环丙基或甲基环丙基。
[0155]
在某些实施方案中，所述化合物可以是us 20120065206中描绘的化合物1-91中的任一种。
[0156]
在一些实施方案中，考虑使用式d的化合物，其中z、r1、r2、r3、r4、r7和r8如对于上面式a所定义，用于可以如本文所述使用伊利司莫(或其他双(硫代酰肼酰胺))的任何目的。
[0157]
在某些实施方案中，所述化合物具有下式：
其中r1、r2、r3和r4如上文对于式a或d所定义。在某些实施方案中，r1、r2或两者是苯基或低级烷基，例如，甲基、丙基、环丙基或甲基环丙基。在某些实施方案中，r3、r4或两者是低级烷基，例如，甲基。在一些实施方案中，r1和r2是相同的。在某些实施方案中，r3和r4是相同的。在一些实施方案中，所述化合物具有以下结构：在一些实施方案中，考虑使用如美国专利申请公开号20150025042中所呈现的式(i)、(iii)、(iv)、(vii)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)或(xiv)的化合物，用于可以如本文所述使用伊利司莫(或其他双(硫代酰肼酰胺))的任何目的。在一些实施方案中，所述化合物包含至少一个c=s部分。在一些实施方案中，所述化合物包含两个c=s部分。在某些实施方案中，所述化合物具有下式：其中r1、r2、r3、r4、r7、r8和r
12
如美国专利申请公开号20150025042中所定义。
[0158]
应当理解，在本公开涉及在特定出版物(例如，专利、专利申请、杂志文章等)中公开的化合物的情况下，此类化合物包括在这种参考文献中公开的各种属、子属和种类中的每一种。
[0159]
在一些实施方案中，选择性抑制癌细胞生长的化合物是能够与铜cu(ii)形成络合物的化合物。不希望受任何理论的束缚，铜剂络合物可以生成铜介导的氧化应激。在一些实施方案中，能够与铜形成络合物的化合物是双(硫代酰肼)酰胺或二硫代氨基甲酸盐。在一些实施方案中，所述化合物另外或可替代地能够与锌形成络合物。
[0160]
在一些实施方案中，选择性抑制癌细胞生长的化合物是引起与其接触的细胞中的一种或多种反应性氧物质(ros)的水平增加的试剂。ros是含氧的化学反应分子。示例性ros是过氧化物(例如，过氧化氢)、超氧化物、羟基自由基和单线态氧。引起一种或多种ros的水
平升高的化合物可以被称为"ros诱导剂"，ros诱导剂可以例如抑制通常负责降低ros(例如，将ros转化为较低反应性物质)的酶或生物途径或过程，或者可以活化增加细胞中ros的酶或生物途径或过程。升高的ros水平此外经常导致脂质过氧化，其可以生成对细胞有毒的许多醛类物质。在一些实施方案中，选择性抑制癌细胞生长的化合物是作为氧化应激促进剂的试剂。术语"氧化应激促进剂"是指损害细胞或生物体代谢、抑制或除去由于ros生成的有害物质的能力的ros诱导剂和试剂。例如，氧化应激促进剂可以抑制酶诸如醛脱氢酶(aldh)，其通常负责将通过ros的氧化生成的反应性蛋白或脂质物质转化为较低反应性形式。
[0161]
在一些实施方案中，ros诱导剂是二硫代氨基甲酸盐(例如，双硫仑或其类似物或活性代谢物)或双(硫代酰肼酰胺)(例如，伊利司莫或其类似物或活性代谢物)。在一些实施方案中，ros诱导剂是能够进行氧化还原循环的金属、诸如铁、铜、铬、钒和钴，其中单个电子可以由金属接受或捐赠。该作用催化反应性自由基和反应性氧物质的产生。在一些实施方案中，ros诱导剂是与这种金属形成络合物的化合物。
[0162]
在一些实施方案中，选择性抑制癌细胞生长的化合物是醛脱氢酶(aldh)抑制剂。醛脱氢酶催化醛向其相应羧酸的不可逆氧化，由此保护细胞免于醛诱导的细胞毒性。人aldh超家族包括19种aldh多肽：aldh1a1、aldh1a2、aldh1a3、aldh1b1、aldh1l1、aldh1l2、aldh2、aldh3a1、aldh3a2、aldh3b1、aldh3b2、aldh4a1、aldh5a1、aldh6a1、aldh7a1、aldh8a1、aldh9a1、aldh16a1和aldh18a1。这些酶在nad
+-依赖性或nadp
+-依赖性反应中催化醛(例如，内源产生的醛，诸如在代谢期间生成的醛或外源醛)氧化为其相应羧酸。aldh多肽(例如，人序列)的示例性氨基酸序列和编码它们的核酸是本领域中已知的并且在公共数据库诸如ncbi refseq数据库中可以得到。
[0163]
"aldh抑制剂"是指抑制aldh超家族的至少一个成员的表达或活性的试剂。在本文所述的涉及aldh抑制剂的任何方法或组合物的一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh1a1、aldh1a2、aldh1a3、aldh1b1、aldh1l1、aldh1l2、aldh2、aldh3a1、aldh3a2、aldh3b1、aldh3b2、aldh4a1、aldh5a1、aldh6a1 aldh7a1、aldh8a1、aldh9a1、aldh16a1和aldh18a1中的一种或多种的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh1家族(aldh1a1、aldh 1a2、aldh1a3、aldh1b1、aldh1l1和aldh1l2)的一个或多个成员的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制至少aldh1a1的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制至少aldh1 a2的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh2的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh3家族(aldh3a1、aldh3a2、aldh3b1和aldh3b2)的一个或多个成员的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh4a1、aldh5a1、aldh6a1、aldh7a1、aldh8a1、aldh9a1、aldh16a1和/或aldh18a1的表达和/或活性。在一些实施方案中，aldh抑制剂抑制aldh1家族和aldh2的一个或多个成员的表达和/或活性。
[0164]
aldh抑制剂可以包含小分子、核酸(例如，sirna、适体)或蛋白(例如，抗体或非抗体多肽)。在一些实施方案中，aldh抑制剂结合aldh多肽并抑制其活性。在一些实施方案中，结合是可逆的。在一些实施方案中，在aldh抑制剂和aldh之间形成稳定共价键。例如，可以形成与酶的活性位点中的氨基酸(例如，cys302)的共价键。在一些实施方案中，aldh抑制剂被代谢为至少部分介导其抑制活性的一种或多种活性代谢物。各种各样的aldh抑制剂中的
任一种是本领域中已知的，并且可以用于本文所述的组合物和方法中。关于aldh和某些aldh抑制剂的进一步信息在koppaka, v., 等人, pharmacological reviews, (2012) 64: 520-539中找到。
[0165]
在某些实施方案中，aldh抑制剂是二硫代氨基甲酸盐，例如，双硫仑或二硫代氨基甲酸盐的类似物或代谢物，例如双硫仑代谢物。双硫仑抑制aldh1a1和aldh2。作为aldh抑制剂的双硫仑代谢物包括例如nn-二乙基二硫代氨基甲酸盐、nn-二乙基二硫代氨基甲酸s-甲酯， n,n-二乙基二硫代氨基甲酸s-甲酯亚砜、nn-二乙基硫代氨基甲酸s-甲酯亚砜、nn-二乙基二硫代氨基甲酸s-甲酯砜和nn-二乙基硫代氨基甲酸s-甲酯砜。在临床上在酒精中毒的治疗中使用双硫仑和某些其他aldh抑制剂。用双硫仑治疗的患者的酒精消耗导致乙醛累积，导致阻止患者消耗酒精的多种令人不愉快的症状。双硫仑也是多巴胺-β-羟化酶的抑制剂，并可用于治疗可卡因成瘾。
[0166]
在一些实施方案中，aldh抑制剂是美国专利申请公开号20080249116中描述的下式的喹唑啉酮衍生物，其中r1、r2、r3、w和v如其中所述：在一些实施方案中，aldh抑制剂是在美国专利公开号20040068003中描述的下式的化合物，其中r1、r2、r3、r4、r5、r6和r7如其中所述：在一些实施方案中，aldh抑制剂是下式的化合物：其中r1、r2和r3独立地代表取代或取代的直链或支链c
1-c6烷基或其盐。
[0167]
在一些实施方案中，aldh抑制剂是题为aldehyde dehydrogenase inhibitors and methods of use thereof)的pctus2014/067943 (wo/2015/084731)中描述的化合物。
在一些实施方案中，所述化合物具有下式i：其中x是o或-c＝o；r1是h、烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基、取代的炔基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基；r5是h、烷基、取代的烷基、卤素、烷氧基或取代的烷氧基；且r7是h或卤素。
[0168]
在一些实施方案中，所述化合物具有下式ii：其中x是o或
‑‑
c＝o；y是烷基、取代的烷基、烯基、取代的烯基、炔基或取代的炔基；r5是烷基、取代的烷基、卤素、烷氧基或取代的烷氧基；r7是h或卤素；且r8是环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
[0169]
在一些实施方案中，所述化合物具有下式iii：其中n是1或2；x是o或
‑‑
c＝o；w是n或o，且当w是o时，则r9不存在；r5是h、烷基、取代的烷基、卤素、烷氧基或取代的烷氧基；r7是et或卤素；r9是h或
‑‑
(ch2)
mr10
，其中m是1至6的整数；且r
10
是h、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基或取代的杂芳基。
[0170]
其他aldh抑制剂包括coprine、氰胺、1-氨基环丙醇(acp)、黄豆苷(即，4',7-二羟基异黄酮的7-葡萄糖苷)、cvt-10216 (3-[[[3-4-[(甲基磺酰基)氨基]苯基]-4-氧代-4h-1-苯并吡喃-7-基]氧基]甲基]苯甲酸；cas登记号1005334-57-5)、头孢菌素、抗糖尿病的磺酰脲、甲硝哒唑、二乙基二硫代氨基甲酸酯、苯乙基异硫氰酸酯(peitc)、樱黄素(4%5-二羟基-7-甲氧基异黄酮)、5-羟基黄豆苷元(染料木黄酮)、三氯乙醛一水合物(或氯醛)、4-氨基-4-甲基-2-戊炔硫代酸(s)-甲酯。在一些实施方案中， aldh抑制剂包含4-氨基-4-甲基-2-戊炔-1-醛(ampal)或2-甲基-5-(甲基硫基)-5-氧戊烷-2-铵，它们是aldh1和aldh3酶的不可逆抑制剂。在一些实施方案中，aldh抑制剂包括苯来特(甲基-[1-[(丁基氨基)羰基]-1h-苯并咪唑-2-基]氨基甲酸酯)。在一些实施方案中，aldh抑制剂是口服降血糖剂，诸如氯
磺丙脲或甲糖宁。在一些实施方案中，aldh抑制剂是棉子酚或其类似物。在一些实施方案中，aldh抑制剂是2,2'-双-(甲酰基-1,6,7-三羟基-5-异丙基-3-甲基萘)。在一些实施方案中，aldh抑制剂是具有以下cas登记号中的任一种的化合物：1069117-57-2、1069117-56
‑ꢀ
1、10691 17-55-0、1055417-23-6、1055417-22-5、1055417-21-4、1055417-20-3、1055417-19-0、1055417-18-9、1055417-17-8、1055417-16-7、1055417-15-6和1055417-13-4。
[0171]
在一些实施方案中，aldh抑制剂是buchman, cd, 等人, chemico-biological interactions (2015) 234:38-44中描述的芳香内酯。
[0172]
在一些实施方案中，aldh抑制剂包含抑制aldh基因表达或活性的核酸。在一些实施方案中，所述核酸是抑制aldh基因表达的rna(试剂(例如，sirna))。示例性核酸aldh抑制剂和包含它们的制剂描述于美国专利公开号20140248338中。
[0173]
在一些实施方案中，与一种或多种其他aldh酶相比，aldh抑制剂对于一种或多种aldh酶是选择性的。如本文所用，如果第一种酶的试剂的ic50比第二种酶的试剂的ic50低至少5倍，则抑制剂被认为对于第一种酶相比于第二种酶是选择性的。在一些实施方案中，ic50值的差异为至少10倍、至少100倍或至少1000倍。在一些实施方案中，与aldh2相比，aldh抑制剂对于一个或多个aldh1家族成员(例如aldh1a1)是选择性的。在一些实施方案中，与其他aldh超家族成员中的至少一些(例如，aldh3a1)相比，aldh抑制剂对一个或多个aldh1家族成员(例如aldh1a1)和aldh2是选择性的。在一些实施方案中，与其他脱氢酶(诸如，15-羟基前列腺素脱氢酶(hpgd)和4型羟基类固醇脱氢酶(hsd17β4) hpgd和hsd17β4)相比，aldh抑制剂对于一种或多种aldh酶是选择性的。
[0174]
在本文所述的涉及aldh抑制剂的任何组合物或方法的一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤100 nm (例如，50 nm-100 nm)的kd结合至少一个aldh超家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤50 nm (例如，10 nm-50 nm)的kd结合至少一种aldh多肽。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤10 nm (例如，1 nm-10 nm)的kd结合至少一个aldh超家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以《1 nm (例如，0.1 nm至1 nm或0.01 nm至0.1 nm)的kd结合至少一个aldh超家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤100 nm (例如，50 nm-100 nm)的kd结合至少一个aldh1家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤50 nm (例如，10 nm-50 nm)的kd结合至少一个aldh1家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤10 nm (例如，1 nm-10 nm)的kd结合至少一个aldh1家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤ 1 nm (例如，0.1 nm至1 nm或0.01 nm至0.1 nm)的kd结合至少一个aldh1家族成员。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤100 nm (例如，50 nm-100 nm)的kd结合aldh2。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤50 nm (例如，10 nm-50 nm)的kd结合aldh2。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤10 nm (例如，1 nm-10 nm)的kd结合aldh2。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以≤ 1 nm (例如，0.1 nm至1 nm或0.01 nm至0.1 nm)的kd结合aldh2。
[0175]
在本文所述的涉及aldh抑制剂的任何组合物或方法的一些实施方案中，所述aldh抑制剂以1 nm-5 μm (例如，1 nm-5 nm、5nm-10 nm、10 nm-20 nm、20 nm-30 nm、30 nm-50 nm、50 nm-100 nm、100 nm-500 nm、500 nm-1 μ或1-5 μm)的ic50抑制一种或多种aldh多肽。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以1 nm-5 μm (例如，1 nm-5 nm、5 nm-10 nm、10 nm-20 nm、20 nm-30 nm、30 nm-50 nm、50 nm-100 nm、100 nm-500 nm、500 nm-1 μm或1 μ
m-5 μm)的ic50抑制一种或多种aldh1多肽。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以1 nm-5 μm (例如，1 nm-5 nm、5 nm-10 nm、10 nm-20 nm、20 nm-30 nm、30 nm-50 nm、50 nm-100 nm、100 nm-500 nm、500 nm-1 μm或1 μm-5 μm)的ic50抑制aldh1a1。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以1 nm-5 μm (例如，1 nm-5 nm、5 nm-10 nm、10 nm-20 nm、20 nm-30 nm、30 nm-50 nm、50 nm-100 nm、100 nm-500 nm、500 nm-1 μm或1 μm-5 μm)的ic50抑制aldh1a2。在一些实施方案中，所述aldh抑制剂以1 nm-5 μm (例如，1 nm-5 nm、5 nm-10 nm、10 nm-20 nm、20 nm-30 nm、30 nm-50 nm、50 nm-100 nm、100 nm-500 nm、500 nm-1 μm或1 μm-5 μm)的ic50抑制aldh2。
[0176]
抑制肿瘤生长和增殖的方法在某些方面，本文提供了涉及抑制肿瘤生长和/或增殖的方法，其包括：确定包含肿瘤细胞的肿瘤样品中的生物标志物的水平；和如果所述样品的至少阈值部分具有所述生物标志物的水平，则将所述肿瘤与治疗性化合物接触。在某些实施方案中，用于接触所述肿瘤的治疗性化合物是铜离子载体。在某些实施方案中，所述生物标志物是硫辛酰化蛋白。示例性硫辛酰化蛋白生物标志物列于表2中。在某些实施方案中，所述生物标志物是线粒体蛋白。在某些实施方案中，所述线粒体蛋白参与硫辛酸生物合成。在某些实施方案中，所述线粒体蛋白是铁-硫簇蛋白。在某些实施方案中，所述线粒体蛋白是线粒体复合物i蛋白。编码相关线粒体蛋白生物标志物的示例性线粒体基因列于表3中。
[0177]
表2. 示例性硫辛酰化蛋白生物标志物硫辛酰化蛋白功能硫辛酰基-dlat丙酮酸脱氢酶复合物硫辛酰基-dlstα-酮戊二酸脱氢酶复合物硫辛酰基-gcsh甘氨酸裂解系统硫辛酰基-dbt支链α-酮酸脱氢酶复合物
[0178]
表3. 相关线粒体蛋白生物标志物的示例性线粒体基因基因名称功能fdx1fe-s簇途径aldha1醛类的氧化aldh2醛类的氧化lias硫辛酸途径lipt1硫辛酸途径lipt2硫辛酸途径dld硫辛酸途径ndufb6复合物indufc2复合物indufa6复合物indufs1复合物iisca2fe-s簇途径pdhb丙酮酸脱氢酶ndufs8复合物i
ndufa2复合物indufs3复合物indufa9复合物indufv1复合物indufs2复合物indufb8复合物indufv2复合物indufb11复合物indufc1复合物icnga2环状核苷酸-门控的离子通道plod1赖氨酸的羟基化st6gal2唾液酸转移酶abca13atp结合盒glrx5fe-s簇途径
[0179]
在某些实施方案中，所述方法包括：测定肿瘤样品中的蛋白硫辛酰化(例如，硫辛酰基-dlat (硫辛酰基-二氢硫辛酰胺乙酰转移酶)、硫辛酰基-dlst (硫辛酰基-二氢硫辛酰基琥珀酰转移酶)、硫辛酰基-gcsh (硫辛酰基-甘氨酸切割系统蛋白 h)、硫辛酰基-dbt (硫辛酰基-二氢硫辛酰胺支链转酰基酶e2)或其任何组合)的水平，和如果样品中的蛋白硫辛酰化水平高于阈值水平，则使所述肿瘤与治疗性化合物接触。在某些实施方案中，所述方法包括确定蛋白硫辛酰化(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt或其任何组合)的水平和确定所述肿瘤样品中的线粒体蛋白表达(例如，fdx1(铁氧还蛋白1)、aldha1(醛脱氢酶a1)、aldh2(醛脱氢酶2)、lias(硫辛酸合成酶)、lipt1(硫辛酰基转移酶1)、 lipt2(硫辛酰基转移酶2)、dld(二氢硫辛酰胺脱氢酶)(或其任何组合)的水平，并且如果样品中蛋白硫辛酰化水平高于阈值水平且如果样品中线粒体蛋白表达水平高于阈值水平，则使所述肿瘤与治疗性化合物接触。
[0180]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达硫辛酰基-dlat，则满足在样品中表达硫辛酰基-dlat的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0181]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达硫辛酰基-dlst，则满足在样品中表达硫辛酰基-dlst的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0182]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达硫辛酰基-gcsh，则满足在样品中表达硫辛酰基-gcsh的总肿瘤细胞的阈值
水平。
[0183]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达硫辛酰基-dbt，则满足在样品中表达硫辛酰基-dbt的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0184]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达fdx1，则满足在样品中表达fdx1的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0185]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达aldha1，则满足在样品中表达aldha1的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0186]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达aldh2，则满足在样品中表达aldh2的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0187]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达lias，则满足在样品中表达lias的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0188]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达lipt1，则满足在样品中表达lipt1的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0189]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达lipt2，则满足在样品中表达lipt2的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0190]
在某些实施方案中，如果至少0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、 83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的样品表达dld，则满足在样品中表达dld的总肿瘤细胞的阈值水平。
[0191]
在一些实施方案中，能够检测相关生物标志物的表达的任何测定法可用于本文提供的方法中。在一些实施方案中，通过用结合生物标志物表位的标记抗体进行免疫染色来检测生物标志物。在一些实施方案中，通过免疫组织化学检测生物标志物。在一些实施方案中，通过western印迹检测生物标志物。在一些实施方案中，使用qpcr检测生物标志物的mrna。在一些实施方案中，使用荧光激活的细胞分选(facs)来检测生物标志物。在一些实施
方案中，使用显微术(例如，荧光显微术)检测生物标志物。在一些实施方案中，使用elisa检测生物标志物。
[0192]
可以在检测方法中使用多种抗体中的任一种。此类抗体包括例如多克隆、单克隆(mab)、重组、人源化或部分人源化、单链、fab和其片段。抗体可以是任何同种型，例如igm、各种igg同种型诸如igg1、igg2a等，并且它们可以来自产生抗体的任何动物物种，包括山羊、兔、小鼠、鸡等。术语“对蛋白特异性的抗体”意指抗体识别蛋白中的限定的氨基酸序列或表位，并且选择性结合蛋白，而通常不结合旨在不与抗体结合的蛋白。实现特异性结合所需的参数可以使用本领域常规方法常规地确定。
[0193]
在一些实施方案中，对生物标志物(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt、fdx1、aldha1、aldh2、lias、lipt1、lipt2、dld)特异性的抗体被固定在表面(例如，为阵列诸如微阵列上的反应性元件，或在另一个表面上，诸如用于基于表面等离子共振(spr)技术，诸如biacore)上，并且通过其特异性结合抗体的能力来检测样品中的蛋白。或者，可以将样品中的蛋白固定在表面上，并通过其特异性结合抗体的能力进行检测。制备表面和进行分析(包括对特异性结合有效的条件)的方法是本领域中常规和众所周知的。
[0194]
许多类型的合适的免疫测定类型是免疫组织化学染色、elisa、western印迹(免疫印迹)、免疫沉淀、放射免疫测定(ria)、荧光激活细胞筛选(facs)等。在一些实施方案中，在本文提供的方法中使用的测定法可以基于比色读数、荧光读数、质谱、视觉检查等。
[0195]
如上所提及，可以通过测量核酸量(例如 mrna量和/或基因组dna)来测量生物标志物的表达水平。核酸量的测定可以通过本领域技术人员已知的各种技术来进行。例如，可以通过微阵列分析(参见例如美国专利号6,913,879、7,364,848、7,378,245、6,893,837和6,004,755)和定量pcr来确定核酸的表达水平、可变剪接变体、染色体重排和基因拷贝数。拷贝数变化可以被检测到，例如，用illumina infinium ii全基因组基因分型测定或agilent人基因组cgh微阵列(steemers等人, 2006)。测量mrna量的方法的实例包括逆转录酶-聚合酶链式反应(rt-pcr)，包括实时pcr、微阵列分析、纳米带、northern印迹分析、差异杂交和核糖核酸酶保护测定法。此类方法是本领域中众所周知的，并且描述于例如sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual，目前版本，cold spring harbor laboratory，cold spring harbor，ny.和ausubel等，current protocols in molecular biology，john wiley＆sons，new york，n.y.。
[0196]
治疗癌症的方法在某些实施方案中，本文提供的是通过根据本文提供的方法向受试者施用治疗化合物来治疗受试者中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述治疗性化合物是铜离子载体。在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗任何癌性、癌前肿瘤和/或免疫细胞。在一些实施方案中，使肿瘤和/或免疫细胞与铜离子载体接触抑制丙酮酸脱氢酶复合物、2-酮戊二酸脱氢酶复合物、支链α-酮酸脱氢酶复合物和/或甘氨酸裂解。在一些实施方案中，所述铜离子载体用铜(ii)预加载(例如，预络合)。
[0197]
在一些实施方案中，所述癌症包括实体瘤。可通过本文提供的方法和组合物治疗的癌症包括(但不限于)来自膀胱、血液、骨骼、骨髓、脑部、乳腺、结肠、食道、胃肠道、齿龈、头部、肾脏、肝脏、肺、鼻咽、颈部、卵巢、前列腺、皮肤、胃、睾丸、舌部或子宫的癌细胞。此外，
癌症可具体地具有(但其不限于这些)以下组织学类型：恶性赘瘤；癌瘤；未分化癌瘤；巨细胞和梭状细胞癌瘤；小细胞癌瘤；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌瘤；基底细胞癌；毛母质癌瘤；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌瘤；肝细胞癌瘤；组合型肝细胞癌瘤和胆管癌瘤；小梁腺癌；腺样囊性癌症；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性多发性结肠息肉腺癌；实体癌瘤；恶性类癌肿瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；难染细胞癌瘤；嗜酸性癌瘤；嗜氧性腺癌；嗜碱性球癌瘤；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌瘤；滤泡腺癌；乳头状和滤泡腺癌；无包膜硬化性癌瘤；肾上腺皮层癌瘤；子宫内膜样癌瘤；皮肤附件癌瘤；顶浆腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌瘤；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液性腺癌；戒环细胞癌；浸润性导管癌；髓性癌；小叶癌；炎症性癌瘤；乳腺佩吉特氏病(mammarypaget's disease)；腺泡细胞癌瘤；腺鳞癌瘤；伴有鳞状化生的腺癌；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞肿瘤；和恶性神经母细胞瘤；塞特利氏细胞癌瘤(sertoli cell carcinoma)；恶性雷迪格细胞肿瘤(malignant leydig cell tumor)；恶性脂质细胞肿瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管球肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨型有色斑痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝色斑痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；腺泡状横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合肿瘤；苗勒管混合肿瘤(mullerian mixed tumor)；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；恶性间叶瘤；恶性布伦纳氏瘤(malignant brenner tumor)；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢间质瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间叶细胞软骨肉瘤；骨骼巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；原纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；神经胶母细胞瘤；少突神经胶质瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层肿瘤；小脑肉瘤；神经节细胞母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞肿瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏淋巴瘤；类肉芽肿；小型淋巴细胞性恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样霉菌病；其他指定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增多病；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增殖性小肠疾病；白血病；淋巴样白血病；血浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性白血病；单核白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；骨髓性肉瘤；和毛细胞白血病。
[0198]
可以改变治疗性化合物的实际剂量水平，以获得有效实现特定患者、组合物和施用模式的所需治疗反应、而对患者没有毒性的量。
[0199]
所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所采用的具体试剂的活性，施用途径，施用时间，所采用的具体化合物的排泄或代谢速率，治疗的持续时间，与所采用的具体化合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料，所治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康和以前的病史以及医学领域中众所周知的类似因素。
[0200]
在某些实施方案中，本文公开的治疗性化合物可以与抗癌剂、例如化学治疗剂、免
疫检查点抑制剂和/或蛋白酶体抑制剂联合施用。所述治疗方法可以与其他形式的常规疗法(例如，对于技术人员众所周知的癌症的护理标准治疗)联合施用，与常规疗法连续，在常规疗法之前或之后施用。例如，这些调节剂可以与治疗有效剂量的化学治疗剂一起施用。在另一个实施方案中，这些调节剂与化学疗法联合施用以增强化学治疗剂的活性和效力。在本文公开的某些方面，治疗性化合物可以与免疫检查点抑制剂联合施用。检查点抑制剂疗法靶向免疫系统的关键调节剂，其刺激或抑制免疫应答。此类免疫检查点可用于癌症疾病状态(例如，通过肿瘤)中以逃避免疫系统的攻击。在本文公开的某些方面，所述治疗性化合物可以与蛋白酶体抑制剂联合施用。
[0201]
在一些实施方案中，治疗或预防癌症(例如，乳腺癌，肺癌，诸如非小细胞肺癌，前列腺癌，结肠癌，膀胱癌，胃癌，卵巢癌，黑色素瘤和肾癌)的方法可以包括与一种或多种其他化学治疗剂联合施用化合物。可与治疗性化合物联合施用的化学治疗剂包括：abt-263、马来酸阿法替尼(afatinib dimaleate)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿昔替尼(axitinib)、b-raf抑制剂(例如，维莫非尼(vemurafenib)、达拉菲尼(dabrafenib))、卡介苗(bcg) (bacillus calmette
–
gu
é
rin vaccine (bcg))、贝伐单抗(bevacizumab)、bez235、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、布塞瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、卡博替尼(cabozantinib)、喜树碱(campothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫司汀(carmustine)、色瑞替尼(ceritinib)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹(chloroquine)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸盐(clodronate)、考比替尼(cobimetinib)、秋水仙碱(colchicine)、克唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达拉菲尼(dabrafenib)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、脱甲绿胶酶素(demethoxyviridin)、地塞米松(dexamethasone)、二氯乙酸酯(dichloroacetate)、双烯雌酚(dienestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、egfr抑制剂(例如，酪氨酸激酶抑制剂、吉非替尼(gefitinib)、奥西替尼(osimertinib))、表柔比星(epirubicin)、埃利布林(eribulin)、厄洛替尼(erlotinib)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟尿嘧啶(fluorouracil)和5-氟尿嘧啶、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、染料木黄酮(genistein)、戈舍瑞林(goserelin)、gsk1120212、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素(interfer on)、伊立替康(irinotecan)、伊沙匹隆(ixabepilone)、来那度胺(lenalidomaide)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、二甲双胍(metformin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米替福新(miltefosine)、mk2206、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦
(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、突变霉素(mutamycin)、尼鲁米特(nilutamide)、诺考达唑(nocodazole)、奥曲肽(octreotide)、奥拉帕尼(olaparib)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸盐(pamidronate)、帕唑帕尼(pazopanib)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、哌立福辛(perifosine)、pf-04691502、普卡霉素(plicamycin)、泊马度胺(pomalidomide)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗米地新(romidepsin)、rucaparib、司美替尼(selumetinib)、西罗莫司(sirolimus)、索拉非尼(sorafenib)、链佐星(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、苏拉明(suramin)、talazoparib、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、坦罗莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、二氯环戊二烯钛(titanocene dichloride)、拓扑替康(topotecan)、曲美替尼(trametinib)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、维罗非尼(vemurafenib)、艾伯维(veliparib)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)和伏立诺他(vorinostat)(saha)。例如，可以与治疗性化合物联合施用的化学治疗剂包括：氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、天冬酰胺酶(asparaginase)、卡介苗(bcg)、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、布塞瑞林(buserelin)、白消安(busulfan)、喜树碱(campothecin)、卡培他滨(capecitabine)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯喹(chloroquine)、顺铂(cisplatin)、克拉屈滨(cladribine)、氯膦酸盐(clodronate)、秋水仙碱(colchicine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、脱甲绿胶酶素(demethoxyviridin)、二氯乙酸酯(dichloroacetate)、双烯雌酚(dienestrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、多西他赛(docetaxel)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、雌二醇(estradiol)、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷(etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟他胺(flutamide)、吉西他滨(gemcitabine)、染料木黄酮(genistein)、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、干扰素(interferon)、伊立替康(irinotecan)、ironotecan、来那度胺(lenalidomaide)、来曲唑(letrozole)、亚叶酸(leucovorin)、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑(levamisole)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、氮芥(mechlorethamine)、甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、二甲双胍(metformin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、尼鲁米特(nilutamide)、诺考达唑(nocodazole)、奥曲肽(octreotide)、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、帕米膦酸盐(pamidronate)、喷司他丁(pentostatin)、哌立福辛(perifosine)、普卡霉素
(plicamycin)、泊马度胺(pomalidomide)、卟吩姆(porfimer)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗(rituximab)、索拉非尼(sorafenib)、链佐星(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、苏拉明(suramin)、他莫昔芬(tamoxifen)、替莫唑胺(temozolomide)、坦罗莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睾酮(testosterone)、沙利度胺(thalidomide)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、塞替派(thiotepa)、二氯环戊二烯钛(titanocene dichloride)、拓扑替康(topotecan)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维甲酸(tretinoin)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)。在其他实施方案中，可与治疗性化合物联合施用的化学治疗剂包括：abt-263、地塞米松(dexamethasone)、5-氟尿嘧啶、pf-04691502、罗米地新(romidepsin)和伏立诺他(vorinostat)(saha)。在本文所述的某些实施方案中，与治疗性化合物联合施用的化学治疗剂是紫杉烷化学治疗剂，诸如紫杉醇(paclitaxel)或多西他赛(docetaxel)。在本文所述的某些实施方案中，与治疗性化合物联合施用的化学治疗剂是阿霉素(doxorubicin)。在本文所述的某些实施方案中，治疗性化合物与紫杉烷化学治疗剂(例如紫杉醇(paclitaxel))和阿霉素(doxorubicin)联合施用。
[0202]
在一些方面，本文提供了包含通过本文描述的方法鉴定的抗癌剂的抗癌组合物。在一些实施方案中，所述抗癌组合物进一步包含如本文所述的蛋白酶体抑制剂。在一些实施方案中，所述蛋白酶体抑制剂是硼替佐米、卡非佐米、oprozomib 、伊沙佐米、delanzomib或这些中任一种的类似物。
[0203]
在一些实施方案中，所述方法包括施用免疫检查点抑制剂，例如结合pd-1、pd-l1、ctla-4或另一种免疫检查点蛋白的抗体。
[0204]
在一些实施方案中，所述铜离子载体相对于单独的抗癌剂增强抗癌剂的肿瘤细胞死亡和/或免疫细胞死亡。
[0205]
筛选抗癌剂的方法本公开的一些方面涉及筛选一种或多种测试剂以鉴定候选抗癌剂的方法，其包括：使细胞样品(例如，癌细胞)与测试剂接触，测量硫辛酰化蛋白(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt)，和如果与未与测试剂接触的相应细胞样品的硫辛酰化蛋白水平相比，硫辛酰化蛋白水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。不与测试剂接触的相应细胞样品的硫辛酰化蛋白水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。在一些实施方案中，未与测试剂接触的细胞样品不表达硫辛酰化蛋白，或包含降低水平的硫辛酰化蛋白。
[0206]
在本发明的一些实施方案中，如果硫辛酰化蛋白(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt)的水平降低至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、90%、99%或更多，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。在本发明的一些实施方案中，如果硫辛酰化蛋白(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt)的水平降低至少1倍、2倍、3倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
[0207]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：测量接触的细胞样品的线粒体蛋白(例如，fdx1、aldha1、aldh2、lias、lipt1、lipt2、dld)的水平或活性，和确定接触的细胞的线粒
体蛋白的水平或活性与未与所述测试剂接触的相应细胞样品的线粒体蛋白的水平或活性相比是否降低。
[0208]
在本发明的一些实施方案中，如果线粒体蛋白(例如，fdx1、aldha1、aldh2、lias、lipt1、lipt2、dld、dlat、dlst、dbt、gsh、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶复合物、支链α-酮酸脱氢酶复合物、甘氨酸裂解复合物)的水平或活性降低至少约5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、75%、90%、99%或更多，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。在本发明的一些实施方案中，如果线粒体蛋白(例如，fdx1、aldha1、aldh2、lias、lipt1、lipt2、dld、dlat、dlst、dbt、gsh、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶复合物、支链α-酮酸脱氢酶复合物、甘氨酸裂解复合物)的水平或活性降低至少1倍、2倍、3倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
[0209]
在一些实施方案中，能够检测相关蛋白(例如，硫辛酰基-dlat、硫辛酰基-dlst、硫辛酰基-gcsh、硫辛酰基-dbt、fdx1、aldha1、aldh2、lias、lipt1、lipt2、dld、dlat、dlst、dbt、gsh、丙酮酸脱氢酶、2-酮戊二酸脱氢酶复合物、支链α-酮酸脱氢酶复合物、甘氨酸裂解复合物)的表达的任何测定都可用于本文提供的方法中。在一些实施方案中，通过用结合蛋白表位的标记抗体进行免疫染色来检测蛋白。在一些实施方案中，通过免疫组织化学检测蛋白。在一些实施方案中，通过western印迹检测蛋白。在一些实施方案中，使用qpcr检测蛋白的mrna。在一些实施方案中，使用荧光激活的细胞分选(facs)来检测蛋白。在一些实施方案中，使用显微术(例如，荧光显微术)检测蛋白。在一些实施方案中，使用elisa检测蛋白。
[0210]
在一些实施方案中，所述方法进一步包括：测量接触的细胞样品的细胞死亡，和确定接触的细胞的细胞死亡与未与所述测试剂接触的相应细胞样品的细胞死亡相比是否增加。不与测试剂接触的相应细胞样品的细胞死亡水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。
[0211]
例如，通过fdx1使与伊利司莫结合的cu(ii)还原为毒性cu(i)形式促进增加的线粒体代谢状态下的细胞死亡(如下所示)。
[0212]
在一些实施方案中，能够在用测试剂处理之后检测细胞死亡的任何测定法都可用于本文提供的方法中。细胞死亡通常特征在于膜起泡、细胞质凝聚和内源性内切核酸酶的活化。这些对癌细胞的影响中的任一种的确定表明抗体-药物缀合物(adc)可用于治疗癌症。
[0213]
可以通过在细胞中测定染料诸如中性红、台盼蓝或alamar
™
蓝的摄取来测量细胞活力(参见，例如，page等人, 1993, intl. j. oncology 3:473-476)。在这种测定中，将细胞在含有染料的培养基中孵育，洗涤细胞，并用分光光度法测量反映染料的细胞摄取的剩余染料。蛋白-结合染料磺酰罗丹明b (srb)也可用于测量细胞毒性(skehan等人, 1990, j. natl. cancer inst. 82:1107-12)。
[0214]
或者，四唑鎓盐(诸如mtt)用于通过检测活的但不是死细胞的哺乳动物细胞存活和增殖的定量比色测定中(参见，例如，mosmann, 1983, j. immunol. methods 65:55-63)。
[0215]
细胞死亡可以通过测量例如dna片段化来定量。可获得用于dna片段化的定量体外测定的商业光度测量方法。此类测定法(包括tunel(其检测片段化dna中标记的核苷酸的掺入)和基于elisa的测定法)的实例描述于biochemica, 1999, no. 2, pp. 34-37 (roche molecular biochemicals)中。
[0216]
细胞死亡也可以通过测量细胞中的形态变化来确定。例如，与坏死性死亡一样，可以通过测量某些染料(例如，荧光染料，诸如例如吖啶橙或溴化乙锭)的摄取来确定质膜完整性的损失。duke和cohen, current protocols in immunology (coligan等人. 编, 1992, pp. 3.17.1-3.17.16)已经描述了一种用于测量细胞死亡数的方法。细胞也可以用dna染料(例如吖啶橙、溴化乙锭或碘化丙啶)标记，并观察细胞的沿内核膜的染色质凝聚和边集(margination)。可以测量以确定细胞死亡的其他形态变化包括例如细胞质凝聚、增加的膜起泡和细胞收缩。
[0217]
细胞死亡的存在可以在培养物的附着和"漂浮"隔室中测量。例如，两个隔室可以通过除去上清液、胰蛋白酶处理贴壁细胞、在离心洗涤步骤后(例如，在2000 rpm下10分钟)合并制备物并检测细胞死亡(例如，通过测量dna片段化)来收集。(参见，例如，piazza等人, 1995, cancer research 55:3110-16)。
[0218]
在某些方面，本文提供了确定肿瘤和/或免疫细胞中增加的线粒体代谢的方法，其包括对所述肿瘤和/或免疫细胞中的硫辛酸染色。
[0219]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)将细胞样品用铜-补充培养基孵育；(b)使细胞样品与测试剂接触；(c)测量所述细胞样品的细胞活力；和(d)如果与用铜-补充培养基孵育且不与测试剂接触的细胞样品的细胞活力水平相比，细胞活力水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。不与测试剂接触的相应细胞样品的细胞活力水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。
[0220]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)将细胞样品用铜螯合剂孵育；(b)使细胞样品与测试剂接触；(c)测量所述细胞样品的细胞死亡；和(d)如果与用铜螯合剂孵育且不与测试剂接触的细胞样品的细胞死亡水平相比，细胞死亡水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。不与测试剂接触的相应细胞样品的细胞死亡水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。
[0221]
在一些实施方案中，所述铜螯合剂是四硫代钼酸盐(ttm)。下面显示通过ttm对铜进行螯合的实例。
[0222]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)将细胞样品用金属-补充培养基孵育；(b)使细胞样品与测试剂接触；(c)测量所述细胞样品的细胞活力；和(d)如果与用金属-补充培养基孵育或和不与测试剂接触的细胞样品的细胞活力水平相比，细胞活力水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
[0223]
在一个实施方案中，所述金属-补充培养基是锌-补充培养基(zn
ꢀ‑
补充培养基)。在另一个实施方案中，所述金属-补充培养基是锰-补充培养基(mn-补充培养基)。在另一个实施方案中，所述金属-补充培养基是钴-补充培养基(co-补充培养基)。在又另一个实施方案中，所述金属-补充培养基是镍-补充培养基(ni-补充培养基)。在又另一个实施方案中，所述金属-补充培养基是铁-补充培养基(fe-补充培养基)。
[0224]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)将细胞样品用金属螯合剂孵育；(b)使细胞样品与测试剂接触；(c)测量所述细胞样品的细胞死亡；和(d)如果与用金属螯合剂孵育且不与测试剂接触的细胞样品的细胞死亡水平相比，细胞死亡水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。
[0225]
在一个实施方案中，所述金属螯合剂是锌(zn)螯合剂。在另一个实施方案中，所述金属螯合剂是锰(mn)螯合剂。在另一个实施方案中，所述金属螯合剂是钴(co)螯合剂。在又另一个实施方案中，所述金属螯合剂是镍(ni)螯合剂。在又另一个实施方案中，所述金属螯合剂是铁(fe)螯合剂。
[0226]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)将细胞样品与葡萄糖-补充培养基孵育；(b)除去葡萄糖-补充培养基，且然后将细胞样品与半乳糖-补充培养基孵育；(c)使细胞样品与测试剂接触；(d)测量所述细胞样品的细胞活力；和(e)如果与首先与葡萄糖-补充培养基孵育、然后在除去葡萄糖-补充培养基之后与半乳糖-补充培养基孵育且不与测试剂接触的细胞样品的细胞活力水平相比，细胞活力水平降低，则将所述测试剂鉴定为候选抗癌剂。不与测试剂接触的相应细胞样品的细胞死亡水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。
[0227]
在某些方面，本文提供了鉴定候选抗癌剂的方法，其包括以下步骤：(a)在培养基中孵育细胞样品，其中所述细胞样品包含编码线粒体蛋白的基因中的缺失；(b)使细胞样品与测试剂接触；(c)测量所述细胞样品的细胞活力；和(d)如果与不包含编码线粒体蛋白的基因中的缺失并与测试剂接触的细胞样品的细胞活力水平相比，细胞活力水平增加，则将
测试剂鉴定为候选抗癌剂。在一些实施方案中，所述线粒体蛋白是铁氧还蛋白1 (fdx1)。包含在编码线粒体蛋白的基因中的缺失且与测试剂接触的相应细胞样品的细胞活力水平可以是任何合适的参考，诸如对照样品或参考样品，其在一些实施方案中可以代表正常线粒体代谢，并且在其他实施方案中可以代表增加的线粒体代谢。
[0228]
在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含测试剂和用于测量细胞蛋白硫辛酰化的测定试剂(assay)。
[0229]
在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含铜-补充培养基、测试剂和用于测量细胞活力的测定试剂。
[0230]
在某些方面，本文提供了用于鉴定候选抗癌剂的试剂盒，其包含铜螯合剂、测试剂和用于测量细胞死亡的测定试剂。
实施例
[0231]
伊利司莫是一种作为抗癌治疗剂开发的化合物。synta pharmaceuticals在ii期试验中生成的结果表明，伊利司莫可以与紫杉醇组合提供癌症无进展存活益处(o’day等人, j clin oncol, 2009，通过引用以其整体并入)。然而，随后的synta pharmaceuticals iii期试验失败。iii期试验结果的事后分析揭示高水平乳酸脱氢酶(ldh)和伊利司莫效力之间的相关性(o’day等人, j clin oncol, 2013，通过引用以其整体并入)。ldh是厌氧呼吸中的关键酶。iii期试验失败的可能原因是：1)伊利司莫的作用机制是未知的，2)没有生物标志物可用于患者选择，3)伊利司莫以次优制剂施用。
[0232]
tsvetkov等人, nat chem bio, 2019中报告的最近发现揭示，伊利司莫杀伤是铜依赖性的(图1)。此外，发现线粒体蛋白铁氧还蛋白1(fdx1)是伊利司莫的直接靶标(图4)。全基因组crispr拯救筛选揭示ffd1的缺失赋予对两种不同的伊利司莫类似物的抗性(图2)。另外，prism生物标志物分析揭示ffd1的高表达与对伊利司莫的敏感性增加相关(图3)。tsvetkov等人, nat chem bio, 2019表明伊利司莫在体外抑制fdx1活性，并且伊利司莫-cu(ii)是fdx1的新底物(图5和图6)。作者表明，存在于许多药物抗性模型中的线粒体代谢的升高水平预测伊利司莫敏感性(图7)。
[0233]
实施例1：fdx1调节硫辛酸途径产生crispr ko fdx1细胞系或crispr ko lias细胞系，并通过western印迹对硫辛酰化蛋白硫辛酰基-dlat和硫辛酰基-dlst的水平进行评价(图8)。western印迹分析揭示，与对照细胞相比，硫辛酰化蛋白水平在crispr ko细胞系中急剧降低。此外，经6小时用1μm伊利司莫处理细胞显示硫辛酰基-dlat和硫辛酰基-dlst蛋白水平随着时间降低。总之，发现fdx1调节硫辛酸途径(图8)。
[0234]
实施例2：硫辛酸染色是对伊利司莫的敏感性的生物标志物通过免疫组织化学测定法在fdx1 ko细胞中对硫辛酸进行染色。显微图像表明，与对照细胞相比，硫辛酸水平在fdx1 ko细胞中急剧降低(图10)。结肠腺癌组织的染色表明，硫辛酸水平在组织中升高。总之，肿瘤中硫辛酸的染色可以充当具有升高水平的线粒体代谢的肿瘤的生物标志物。另外，发现肿瘤中增加的硫辛酸水平对铜-结合的化合物、诸如伊利司莫和双硫仑敏感。
[0235]
实施例3：不同的化合物促进铜依赖性细胞死亡
除了伊利司莫以外，发现其他化合物促进癌细胞中的铜依赖性细胞死亡(图9)。
[0236]
实施例4：化合物活力概况的聚类揭示促进铜依赖性细胞死亡的独特的化合物聚类为了揭示可以促进癌细胞死亡的新的独特途径靶向药物，分析在489种细胞系上测试1448种化合物的化合物活力概况的聚类。该分析揭示独特的金属结合分子聚类(图12)。有趣的是，显示这些化合物中的许多特异性结合铜。显示抗滥用化合物双硫仑和结构上类似的类似物，诸如thiram和四甲基秋兰姆单硫化物(tmt)促进铜依赖性表型。结合不同金属的羟基喹啉(8-hq)可以促进a-β蛋白酶体介导的降解的铜依赖性诱导，且吡啶硫酮促进酵母的铜依赖性细胞死亡。具体而言，将铜结合并穿梭至线粒体并对细胞发挥有益和有害的结果的化合物伊利司莫是感兴趣的。在独特的模块中对这些铜结合分子的聚类表明，某些细胞可能对铜结合分子具有独特的敏感性，这与该群组中的其他探索的化合物不同。
[0237]
金属结合化合物可以通过隔绝(螯合)金属与必需因子或通过将金属穿梭(例如，离子载体)至细胞隔室(它们在那是有毒的)来诱导毒性表型。为了确定在聚类中观察到的化合物是否通过某些金属的螯合或穿梭来促进细胞死亡，检查在铁、钴、铜、镍和锌存在或不存在的情况下由每种化合物诱导的细胞毒性。在所有检查的情况下，铜的添加强烈地增强聚类中所有化合物的细胞死亡诱导(图13)。在较低程度上，锌与双硫仑、nsc319756或吡啶硫酮和铁与8hq也能够促进细胞死亡。因此，铜结合和铜-诱导的细胞死亡是不同的化合物聚类的常见表型。
[0238]
实施例5：铜诱导的细胞死亡是非凋亡的或铁死亡的伊利司莫显示与聚类中的铜的最具选择性结合(图13)。细胞对伊利司莫的敏感性取决于铜的可用性。在培养基中以生理浓度(1μm)或以与化合物1:1比率添加铜，均强烈地增强伊利司莫诱导的细胞死亡(图15)。从具有四硫代钼酸盐(ttm)的培养基螯合铜完全阻断多种细胞系模型中的伊利司莫诱导的细胞死亡(图27)。在培养基(rpmi)中没有补充铜，且因此铜的可用性被限制至血清中铜的丰度，这可能强烈地变化。因此，在缺乏血清的培养基中用伊利司莫处理的细胞显示增加的抗性，这通过向培养基中添加铜而完全逆转(图16)。向培养基中补充铜强烈地降低伊利司莫效力的可变性，如对于卵巢癌细胞系的子集所示(图28)，表明当外源铜水平低时，细胞内铜水平也可以指示对伊利司莫的敏感性。因此，伊利司莫的效力取决于细胞外和细胞内铜的可用性。
[0239]
铁和铜两者均可以经由芬顿反应从细胞中的o2•−
和h2o2生成高度反应性羟基自由基(
•
oh)。在铁的情况下，这可以导致诱导铁死亡(一种非凋亡细胞死亡)的脂质自由基。先前的发现表明伊利司莫诱导ros-依赖性的凋亡细胞死亡。然而，最近显示伊利司莫-诱导的细胞死亡不涉及显著的胱天蛋白酶-3活化。因此，为了确定伊利司莫诱导的细胞死亡是否是凋亡的，使用关键凋亡效应物(bak和bax) 被敲除的hcm18细胞进行遗传方法(图29)。在bak/bax缺失细胞中，凋亡诱导紫杉醇的效力被强烈抑制，如所预期(图11)。然而，伊利司莫-铜诱导细胞死亡的能力不受影响(图11)。在这些细胞系中测试其他铜结合分子，并且在所有情况下，这些化合物的效力不受凋亡途径的遗传扰动的影响(图32)。
[0240]
为了进一步建立哪些细胞死亡途径可能介导伊利司莫诱导的铜-依赖性细胞死亡，使用阻断已知细胞死亡途径的关键生态位的化合物来进行化学方法。用阻断凋亡(泛胱天蛋白酶抑制剂)、铁死亡(铁抑制素-1)、坏死性死亡(坏死抑制素-1)和其他抗氧化剂和细
胞死亡调节途径的化合物对细胞进行预处理，并不阻断伊利司莫-铜诱导的细胞死亡。作为对照，使用铁死亡诱导gpx4抑制剂(ml162)和凋亡诱导蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)。在测试的三种细胞系中，仅通过ttm的铜螯合能够阻断伊利司莫诱导的细胞死亡(图11)。铁死亡或凋亡-改变化合物(如ml162和硼替佐米对照中所示)对伊利司莫-铜诱导的细胞死亡没有影响。与这些发现一致，伊利司莫-铜不诱导在铁死亡-诱导期间通常观察到的脂质过氧化的深刻变化。观察到的轻微变化最可能是由于分子的铜螯合特性。伊利司莫-铜显示增加的毒性和降低水平的脂质过氧化和通过ttm的铜螯合。所有在一起，这些发现表明，伊利司莫-铜和其他铜结合化合物诱导化学和遗传上不同于凋亡和铁死亡两者的细胞死亡。鉴于通过铜的这种细胞死亡路径的绝对依赖性和调节，为了简单起见，该过程被称为"铜死亡(cuproptosis)"。
[0241]
实施例6：fdx1调节的硫辛酰化是对伊利司莫的敏感性的关键调节剂伊利司莫-诱导的铜死亡由线粒体代谢调节。通过在培养基中用半乳糖替换葡萄糖而被迫转换至增加的线粒体代谢的细胞变得对伊利司莫越来越敏感(图7和图30)。这种到线粒体代谢的转换还强烈地增强其他铜-结合分子的效力，一些表现出比其他更强的效果。尽管线粒体代谢对8-hq、吡啶硫酮和tmt的影响相当温和，但双硫仑和nsc-319726的影响类似于对于伊利司莫所示的那些(图32)。为了确立该效果是否由电子转移链(etc)介导，测试143b rho0细胞(缺乏线粒体dna)和它们的亲本对照(143b)。令人惊讶地，在伊利司莫和双硫仑的情况下，143b rho0细胞是稍微更敏感的细胞死亡，或者在tmt、nsc319726、吡啶硫酮和8hq的情况下，通过铜结合化合物，是同样敏感的细胞死亡(图31，图32)。这排除了伊利司莫和其他铜结合化合物需要功能性etc以促进细胞死亡的可能性。
[0242]
先前已经显示，铁氧还蛋白1 (fdx1)是伊利司莫诱导的毒性的重要介质。伊利司莫直接结合fdx1，其可以减少伊利司莫结合的铜以促进铜死亡。为了更好地理解铜死亡的潜在下游介质，使用crispr/cas9缺失策略。靶向的筛选集中在3000种代谢酶上，以鉴定失去赋予的对单独的伊利司莫和当与粘附性肺癌细胞系a549中的铜补充组合时的伊利司莫两者的抗性的基因。在所有条件下，fdx1基因是最高评分命中物，强调该基因在伊利司莫介导的毒性中的重要性(图33)。有趣的是，存在来自两种不同的功能途径的多种命中物：线粒体复合物i和硫辛酸途径。硫辛酸途径介导对其功能至关重要的特定酶(dlat、dlst、dbt、gcsh)的赖氨酸硫辛酰化(图34)。有趣的是，硫辛酰化酶(lias)和下游硫辛酰化靶标酶(pdh复合物)两者均为遗传修饰筛选中的命中物。这强烈地表明，细胞的硫辛酰化状态在介导伊利司莫-诱导的毒性中发挥作用。这种假设是特别有吸引力的，因为线粒体呼吸需要硫辛酰化，并且硫辛酸已显示具有与铜的高亲和力结合。证实了发现并显示，fdx1的缺失的确在多种细胞模型中赋予对伊利司莫-cu(ii)和双硫仑-cu(ii)的抗性(图18)。硫辛酰化酶lias的缺失也足以促进对伊利司莫的抗性(图18)。
[0243]
实施例7：fdx1是硫辛酰化的上游调节剂尽管许多研究集中在fdx1上，但在细胞中的fdx1的自然功能仍然有争议。一方面，显示fdx1参与线粒体fe-s簇路径。而另一方面，存在与这些发现矛盾的表明fdx1具有不同作用的证据。为了确定fdx1在癌细胞中的作用，进行分析以鉴定在数百种癌细胞系上哪些基因在通过crispr/cas9敲除时显示类似的活力作用。该分析揭示fdx1缺失与来自两个功能类别(线粒体复合物i和硫辛酸途径)的蛋白高度相关(图19)。这些结果与使用伊利司莫
的遗传缺失拯救筛选中的功能命中物几乎相同(图33)。这些结果强烈表明fdx1和硫辛酸途径基因两者均在相同的功能途径中。
[0244]
为了建立fdx1是否在蛋白硫辛酰化途径的上游，敲除硫辛酰化途径中的fdx1和其他关键酶(lipt1、lias、lipt2)。通过使用识别硫辛酰化赖氨酸的抗体来评价dlat和dlst的硫辛酰化状态。fdx1缺失，像建立的la途径酶一样，完全消除硫辛酰化dlat和dlst的水平，如通过western印迹分析和ihc所观察到(图20和图21)。
[0245]
从评价来看，与aavs1-靶向对照和k562亲本细胞两者相比，在fdx1 ko细胞中的许多代谢物被改变，这与新发现的fdx1在调节蛋白硫辛酰化中的作用一致(图35)。具体而言，存在丙酮酸和a-kg的累积与琥珀酸的耗竭，这在dlat和dlst的活性被抑制时是预期的(图22)。nad/nadh比率也存在强烈增加，而乳酸盐水平没有显著变化。有趣的是，还存在总体sam水平的累积，表明在这些细胞中通过蛋白硫辛酰化所消耗的sam构成总体细胞sam的重要部分。合在一起，代谢组学数据强烈地支持fdx1是蛋白硫辛酰化的上游调节剂的发现。
[0246]
选择在先前的prism实验中被显示为敏感的或抗性的细胞系，以进一步确定伊利司莫在细胞中的影响(图23)。这些细胞平均具有更高的fdx1 mrna表达(图26)，并且可以再现灵敏度的总体差异(图26)。作为一组的敏感细胞显示总体较高的fdx1蛋白水平和硫辛酰化蛋白表达水平(图27)。硫辛酸是铜的强烈结合剂，使得伊利司莫结合的铜可以直接影响硫辛酰化蛋白是合理的。实际上，以低至10nm的浓度添加伊利司莫降低了硫辛酰化蛋白的水平，而不会急剧影响蛋白水平(图36和图37)。
[0247]
实施例8：递增剂量的铜-结合药物后细胞的活力在10
µ
m fecl2、fecl3、zncl2、nicl、cucl2或cocl2存在的情况下用递增剂量的所示药物处理后测量mon细胞的活力(图13)。在10
µ
m fecl2、fecl3、zncl2、nicl、cucl2或cocl2存在的情况下用递增剂量的所示药物处理后测量ncih2030细胞的活力(图14)。
[0248]
实施例9：a549细胞中的cripsr/cas9阳性选择筛选a549细胞中cripsr/cas9阳性选择筛选的实验设置显示于图17中。该筛选使用靶向3000种代谢相关基因的文库(~10grna/基因)。所述筛选的用40nm 伊利司莫-cu(ii)处理的细胞中最阳性富集的sgrna显示于表4中。
[0249]
表4基因名称功能sgrna数目sgfdx1fe-s簇10sgdlatpdh-硫辛酸7sgndufb6复合物i6sgndufc2复合物i4sgndufa6复合物i4sgndufs1复合物i4sgisca2fe-s簇3sglias硫辛酸3sgpdhbpdh3sgndufs8复合物i3sgndufa2复合物i3
sgndufs3复合物i3sgndufa9复合物i3sgndufv1复合物i3sgndufs2复合物i3sgndufb8复合物i3sgndufv2复合物i3sgndufb11复合物i3sgcnga2其他3sgplod1其他3sgst6gal2其他3sgabca13其他3
[0250]
通过功能分选基因：fe-s簇途径、硫辛酸途径、复合物i和其他。
[0251]
发现a549细胞中fdx1的缺失赋予对伊利司莫-cu(ii)和双硫仑-cu(ii)的相对抗性。发现ovise细胞中lias和fdx1的缺失赋予对伊利司莫-cu(ii)的抗性(图18)。
[0252]
基于筛选的结果，相关分析揭示fdx1缺失与两种不同途径硫辛酸途径和复合物i的组分的缺失相关(图19)。
[0253]
发现fdx1的缺失消除ovise细胞和k562细胞两者中的细胞硫辛酰化蛋白(图20和图21)。
[0254]
总之，硫辛酸途径中的fdx1功能的模型显示于图22中。
[0255]
实施例10：prism测定法通过prism测定法检查724种细胞系的活力的分布。与对照相比，发现fdx1 mrna表达水平在敏感细胞系中增加(图23)。在图24中验证fdx1的表达水平。
[0256]
western印迹分析揭示，与敏感细胞相比，抗性细胞显示增加的fdx1蛋白水平和较低水平的硫辛酰化蛋白水平(图25)。用1μm伊利司莫(+cucl2)处理a549细胞后，硫辛酰化水平降低(图26)。
[0257]
实施例11：基因拷贝改变分析从癌症基因组图谱(tcga)数据集平台对与线粒体代谢升高水平相关的生物标志物进行基因拷贝改变分析。结果表明，fdx1表达与染色体11拷贝数(cn)改变高度相关(图38)。
[0258]
实施例12：建立生物标志物-阳性小鼠异种移植模型生物标志物-阳性细胞对对应于在小鼠药代动力学(pk)研究中测量的测量浓度和动力学的伊利司莫-cu(ii)治疗是敏感的。
[0259]
细胞培养物冲洗：研究模拟短暴露时间，其模拟伊利司莫-cu(ii)的药代动力学(pk)特性。
[0260]
结果：在200nm下暴露2小时、随后冲洗足以实现生物标志物选择性细胞杀伤。结果显示于图48中。数据支持c
max
驱动的活性概况。细胞将用于建立subq异种移植模型，其中可以针对其效力分析不同的铜离子载体。
[0261]
等同方案
本领域技术人员将认识到或能够使用不多于常规实验来确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等同方案。此类等同方案意欲被以下权利要求涵盖。