本文描述了用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的方法以及相关的组合物和试剂盒。本公开的方法使用重组水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，vsv)颗粒，其中vsv糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代。在一个具体实施例中，所述s糖蛋白衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratorysyndrome coronavirus，sars-cov-2)，并且所述方法用于确定sars-cov-2中和抗体的存在。
背景技术：
1、已知三种冠状病毒在人类中引起严重肺炎：严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov或sars-cov-1)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。sars-cov-1感染了8，000多人，导致了774例死亡。mers-cov感染了几乎2，500人，并且导致了858例死亡。有一种新的冠状病毒出现，引起急性呼吸道疾病，现在称为冠状病毒疾病2019(covid-19)(zhou et al.,nature,2020年2月3日在线公开；可从doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7获得；zhu et al.,new engl j med,2020,382:727-733)。covid-19症状包括发烧、咳嗽、呼吸短促、肺炎、急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺综合征、嗅觉丧失、味觉丧失、咽喉痛、鼻分泌物、胃肠症状(例如腹泻)、器官衰竭(例如肾衰竭和肾功能障碍)、败血性休克和严重情况下的死亡。导致covid-19的病毒被鉴定为与sars-cov-1相关，因此命名为sars-cov-2(有时也称为ncov-2019或sars ncov19)。虽然一些个体无症状或仅经历轻度疾病，但许多个体经历严重症状且需要住院。sars-cov-2在全球快速传播，并且由世界卫生组织在2020年3月11日宣布为全球流行病。到2020年5月20日为止，该病毒已经感染了几乎5百万人，导致超过328,000死亡。发展了covid-19的许多患者具有轻度上呼吸道症状，但有些患者(尤其是老年人和患有潜在医学病症的人，诸如慢性肺病、哮喘、心脏病、糖尿病、免疫受损患者等)出现非典型肺炎及其相关并发症(etal.,nature,2020年4月1日在先公开，可从doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x获得)。sars-cov-2是高度传染性的，并且可以被无症状载体扩散。
2、检测活性sars-cov-2感染的pcr测定在跟踪疾病传播中起重要作用，而检测针对sars-cov-2的抗体的血清学测试被用于检测和测量先前的感染，识别可能对sars-cov-2免疫的个体并评估疫苗和疗法的功效。可用的血清学测试准确地反映抗体介导的免疫性的程度仍然理解不够。
3、病毒中和抗体的产生对于阻断随后的病毒感染是必要的，并且中和抗体的存在与接种后的保护性免疫相关(koff 2013)。然而，通常只有病毒特异性抗体的一小部分是中和性的。目前还没有理解总抗体水平如何与sars-cov-2的中和抗体水平相关，并且迫切需要sars-cov-2中和抗体响应的改进测试。来自康复血浆治疗试验的早期数据已经显示出有希望的结果(casadevall 2020)，但是如果接受标准是基于总抗sars2-cov-2抗体水平而不是特别地基于中和抗体水平，则血浆供体的筛选是不合适的。同样，新sars-cov-2疫苗的功效研究必须不仅考虑总抗体反应，还应该考虑中和抗体反应。
4、因此，本领域非常需要用于sars-cov-2和其它冠状病毒的强力和高效的血清阳性测定，特别是用于评估病毒中和抗体的测定。
技术实现思路
1、如上述背景技术部分所述，非常需要开发用于sars-cov-2和其它冠状病毒的有效血清阳性测定法，特别是用于评估病毒中和抗体的测定法。本公开解决了这些和其他需要。本公开提供了用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的测定法以及相关的组合物和试剂盒。本公开的血清阳性测定法使用重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒，其中vsv糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代。在一个具体实施方案中，所述s糖蛋白衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus2，sars-cov-2)，并且所述方法用于确定sars-cov-2中和抗体的存在。
2、在一个方面，本文提供了一种用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的方法，所述方法包括：
3、a)使所述样品与重组弹状病毒颗粒接触，其中所述弹状病毒糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导第一靶细胞和第二靶细胞的感染；
4、b)在步骤(a)之后，使所述重组弹状病毒颗粒与表达报告蛋白的第一部分的第一靶细胞和表达报告蛋白的第二部分的第二靶细胞接触，以形成包含所述报告蛋白的第一和第二部分的合胞体，并产生可检测的报告信号，并且其中当与所述重组弹状病毒颗粒接触时，所述第一靶细胞和所述第二靶细胞能够彼此融合；
5、c)在步骤(b)后测量细胞中的报告信号，和
6、d)将步骤(c)中测量的报告信号与对照进行比较。
7、在一个实施方案中，第一靶细胞和/或第二靶细胞均包含血管紧张素转化酶2(ace2)。
8、在一个实施方案中，第一靶细胞是vero-dsp1(vero-dsp-1-puro；clr-73)，第二靶细胞是vero-dsp2(vero-dsp-2-puro；clr-74)。
9、在一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸1-229，并且所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸230-311。在另一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸1-155，并且所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸156-311。在一个具体的实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶突变体rluc8的氨基酸1-155，所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶突变体rluc8的氨基酸156-311。
10、在一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含绿色荧光蛋白(gfp)或其突变体的氨基酸1-156，并且所述报告蛋白的第二部分包含gfp或其突变体的氨基酸157-231。在另一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含超折叠gfp的氨基酸1-213，并且所述报告蛋白的第二部分包含超折叠gfp的氨基酸214-230。在又一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含超折叠黄色荧光蛋白(yfp)的氨基酸1-154，并且所述报告蛋白的第二部分包含超折叠yfp的氨基酸155-262。
11、在另一个方面，本文提供了一种用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的方法，所述方法包括：
12、a)使所述样品与重组弹状病毒颗粒接触，其中(i)所述弹状病毒糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导靶细胞的感染，并且其中(ii)所述弹状病毒颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子；
13、b)在步骤(a)之后，使所述重组弹状病毒颗粒与靶细胞接触；
14、c)在步骤(b)后测量细胞中的报告信号，和
15、d)将步骤(c)中测量的报告信号与对照进行比较。
16、在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含编码所述报告蛋白的核酸分子。在一个具体实施方案中，将编码所述报告蛋白的核酸序列插入编码冠状病毒s糖蛋白或其片段或衍生物的核酸序列和编码弹状病毒大(l)蛋白的核酸序列之间。在一个实施方案中，靶细胞是vero细胞(包括vero-αhis细胞)、vero-ace-2细胞、vero-trmpss2细胞或vero-e6细胞。在一个实施方案中，靶细胞包含血管紧张素转化酶2(ace2)。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒的基因组缺乏功能性弹状病毒g基因并编码冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒的基因组缺乏弹状病毒g基因并编码冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物。
17、在任何上述方法的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是重组水泡性病毒颗粒。在任何上述方法的一个实施方案中，所述重组水泡性病毒颗粒是重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒。
18、在任何上述方法的一个实施方案中，所述报告蛋白包含荧光素酶。有用的荧光素酶的非限制性示例包括例如海肾荧光素酶、rluc8突变海肾荧光素酶、(dcpg)荧光素酶、nanoluc报告蛋白、萤火虫荧光素酶、gaussia荧光素酶(gluc)、metluc、费氏弧菌(vibriofischeri)lumazine蛋白、哈维氏弧菌(vibrio harveyi)luminaze蛋白、inoflagelate荧光素酶、萤火虫荧光素酶yy5突变体、萤火虫荧光素酶lgr突变体、萤火虫荧光素酶突变体e及其片段或衍生物。
19、在任何上述方法的一个实施方案中，所述报告蛋白包含荧光蛋白。有用的荧光蛋白的非限制性实例包括例如绿色荧光蛋白(gfp)、gfp样荧光蛋白、(gfp样)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强的蓝色荧光蛋白(ebfp)、青色荧光蛋白(cfp)、增强的青色荧光蛋白(ecfp)；红色荧光蛋白、超折叠gfp、超折叠yfp、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白、小的超红色荧光蛋白、fma结合荧光蛋白、dsred、qfp611、dronpa、tagrfp、kfp、eosfp、irisfp、dendra、kaede、kikgr1、祖母绿荧光蛋白(emerald fluorescent protein)、azami green、mwasabi、taggfp、turbogfp、acgfp、zsgreen、t-sapphire及其片段或衍生物。
20、在任何上述方法的一个实施方案中，所述方法包括添加报告蛋白底物以获得报告信号。荧光素酶的有用的报告蛋白底物的非限制性实例包括例如荧光素(例如，d-荧光素)、enduren和腔肠素荧光素酶底物。
21、在任何上述方法的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是能够复制的弹状病毒颗粒。
22、在上述任一方法的一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。在一个实施方案中，冠状病毒s糖蛋白是全长sars-cov-2s糖蛋白。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白包含seq idno:1的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白由seq id no：1的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段是缺少19个c末端氨基酸的sars-cov-2s糖蛋白片段。在一个具体实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段包含seq idno:3的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白片段由seq id no:3的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列具有至少77％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的s1亚基具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸14-684具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的rbd结构域具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸319-541具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，与包含表达插入到弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致产生更具融合性的重组弹状病毒颗粒。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段可包含sars-cov-2s糖蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个残基的插入、缺失和/或取代或者由其组成。用于潜在缺失的氨基酸的非限制性实例包括例如位置(145)处的酪氨酸、位置(679)处的天冬酰胺、位置(680)处的丝氨酸、位置(681)处的脯氨酸、位置(682)处的精氨酸、位置(683)处的精氨酸、位置(684)处的丙氨酸和/或位置(685)处的精氨酸，如seq idno：1中所示的位置，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等效氨基酸残基。潜在取代的氨基酸的非限制性实例包括例如：位置(5)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(28)处酪氨酸变成天冬酰胺，位置(29)处苏氨酸变成异亮氨酸，位置(49)处组氨酸变成酪氨酸，位置(54)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(74)处天冬酰胺变成赖氨酸，位置(96)处谷氨酸变成天冬氨酸，位置(111)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(157)处苯丙氨酸变成亮氨酸，位置(181)处甘氨酸变成缬氨酸，位置(221)处丝氨酸变成色氨酸，位置(247)处丝氨酸变成精氨酸，位置(348)处丙氨酸变成苏氨酸，位置(408)处精氨酸变成异亮氨酸，位置(476)处甘氨酸变成丝氨酸，位置(483)处缬氨酸变成丙氨酸，位置(519)处组氨酸变成给谷氨酰胺，位置(520)处丙氨酸变成丝氨酸，位置(614)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(614)处天冬氨酸变成甘氨酸，位置(679)处天冬酰胺变成异亮氨酸，位置(680)处丝氨酸变成亮氨酸，位置(682)处精氨酸变成甘氨酸，位置(683)处精氨酸变成丝氨酸，位置(685)处精氨酸变成谷氨酰胺，位置(685)处精氨酸变成丝氨酸，位置(797)处苯丙氨酸变成半胱氨酸，位置(930)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(936)处天冬氨酸变成酪氨酸，位置(1078)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(1168)处天冬氨酸变成组氨酸，和/或位置(1259)处天冬氨酸变成组氨酸，各位置是按照seq id no:1中编号的，或者突变sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。参见becerra-flores andcardozo,“sars-cov-2viral spike g614 mutation exhibits higher case fatalityrate,”the international journal of clinical practice,published online may 6,2020；eaaswarkhanth et al.,“could the d614g substitution in the sars-cov-2spike(s)protein be associated with higher covid-19mortality？”internationaljournal of infectious diseases,96:2020年7月,第459-460页；tang et al.,“thesars-cov-2spike protein d614g mutation shows increasing dominance and mayconfer a structural advantage to the furin cleavage domain,”preprints 2020,2020050407(doi:10.20944/preprints202005.0407.v1)；hansen et.al.,“studies inhumanized mice and convalescent humans yield a sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日线上公开；lokman et al.,“exploring the genomic andproteomic variations of sars-cov-2spike glycoprotein:a computational biologyapproach”,infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiologyand evolutionary genetics in infectious diseases,2020jun；84:104389.doi:10.1016/j.meegid.2020.104389，其中每一篇出于所有预期目的通过引用全部并入本文。用于插入、缺失和/或取代的氨基酸残基位置的其他非限制性实例包括表8和9中所列的那些(氨基酸残基的位置使用seq id no:1作为参考序列表示，其可以用作识别任何sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基(同上)的参考；出于所有预期目的将表8中的参考文献通过引用全部并入本文)。表8中列出的每个残基修饰可以单独使用或与其他残基组合使用，以产生重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒的变体。在某些实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov 2刺突蛋白)不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸，将位置(614)处天冬氨酸改变成天冬酰胺，和/或将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺，各位置如seq id no:1所示，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(685)处将精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(247)处将丝氨酸改变为精氨酸，在位置(614)处将天冬氨酸改变为天冬酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺以及将位置(685)处精氨酸改变成谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致更溶解的表型。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:42的氨基酸序列，或与seq id no：42的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由密码子优化的核苷酸序列编码。在各种实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由seq id no:43的多核苷酸序列或与seq id no：43具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％多核苷酸序列同一性的序列编码。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq idno:44的氨基酸序列，或与seq id no：44的氨基酸顺序至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和/或将位置484处谷氨酸改变为赖氨酸和/或位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸，和/或缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同，各位置是如seq id no:1所示的，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过灭活刺突蛋白内的弗林蛋白酶切割位点而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将seq id no:1中指定d q677tnsprrarsv687(seq id no:65)或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列内的等同氨基酸残基改变成qtilrsv(seq id no:66)或qtnspgsassv(seq id no:67)而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致s1/s2界面中的一元弗林蛋白酶裂解位点(qtilrsv(seq id no:66))或弗林蛋白酶裂解位点的缺失(qtnspgsassv(seq id no:67))表型。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶裂解位点的改变可导致刺突稳定化的假颗粒。参见hansen et.al.,“studies in humanized mice andconvalescent humans yield a sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日在线公开，出于所有预期目的通过引用全文并入本文。
23、在任何上述方法的某些实施方案中，步骤(a)包括使样品(例如，同时或顺序地)与两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒接触，其中所述两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒包含不同的冠状病毒刺突(s)糖蛋白、其片段或衍生物。在某些实施方案中，所述两种或更多种不同的冠状病毒刺突(s)糖蛋白、其片段或衍生物中的至少一种包含选自seq idno:1、seq id no:3和seq id no:44的氨基酸序列，或包含表8和表9中列出的一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代，其中所述插入、缺失和/或取代的位置是相对于seq id no:1指定的。在所述方法的某些实施方案中，其中所述弹状病毒颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子，所述两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒包含不同的报告蛋白和/或编码所述不同报告蛋白的不同核酸分子。在所述方法的某些实施方案中，其中所述弹状病毒颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子，所述两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒包含相同的报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的相同核酸分子。
24、在一个实施方案中，本文提供了一种用于确定样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)中和抗体的存在的方法，所述方法包括：
25、a)使所述样品与有复制能力的重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒接触，其中所述重组vsv颗粒的基因组缺乏功能性vsv糖蛋白(g)基因并编码全长sars-cov-2刺突(s)糖蛋白或其缺乏19个c末端氨基酸的片段；
26、b)在步骤(a)之后，使重组vsv颗粒与vero-dsp1细胞和vero-dsp2细胞的混合物接触；
27、c)在步骤(b)之后测量细胞中的荧光素酶信号和/或gfp信号，和
28、d)将步骤(c)中测量的信号与对照进行比较。
29、在另一个实施方案中，本文提供了一种用于确定样品中严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)中和抗体的存在的方法，所述方法包括：
30、a)使所述样品与有复制能力的重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒接触，其中(i)所述重组vsv颗粒的基因组缺乏功能性vsv糖蛋白(g)基因并编码全长sars-cov-2刺突(s)糖蛋白或其缺乏19个c末端氨基酸的片段，并且其中(ii)重组vsv颗粒的基因组进一步编码荧光素酶蛋白；
31、b)在步骤(a)之后，使重组vsv颗粒与选自vero细胞、vero-ace-2细胞和vero-e6细胞的细胞接触；
32、c)在步骤(b)之后测量细胞中的荧光素酶信号，和
33、d)将步骤(c)中测量的信号与对照进行比较。
34、在上述两种方法的一个实施方案中，全长sars-cov-2s糖蛋白由seq id no：1的氨基酸序列组成。在上述两种方法的一个实施方案中，所述缺少19个c末端氨基酸的sars-cov-2s糖蛋白片段由seq id no：3的氨基酸序列组成。
35、在上述两种方法的某些实施方案中，步骤(a)包括使所述样品(例如，同时或相继)与两种或更多种不同的重组vsv颗粒接触，其中所述两种或更多种不同的重组vsv颗粒包含不同的全长sars-cov-2s糖蛋白或其缺乏19个c末端氨基酸的片段。在某些实施方案中，所述两种或更多种不同全长sars-cov-2s糖蛋白或其缺少19个c末端氨基酸的片段中的至少一种包含选自seq id no:1、seq id no:3和seq id no:44的氨基酸序列，或包含表8和9中列出的一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代，其中所述插入、缺失和/或取代的位置相对于seq id no:1指定的。在所述方法的某些实施方案中，其中所述vsv颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子，所述两种或更多种不同的重组vsv颗粒包含不同的报告蛋白和/或编码所述不同的报告蛋白的不同核酸分子。在所述方法的某些实施方案中，其中所述vsv颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子，所述两种或更多种不同的重组vsv颗粒包含相同的报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的相同核酸分子。
36、在任何上述方法的一个实施方案中，在步骤(b)之后和步骤(c)之前，将细胞暴露于胰蛋白酶。
37、在任何上述方法的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含突变的弹状病毒基质(m)蛋白。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒的基因组编码突变的弹状病毒m蛋白。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒是包含突变的vsv m蛋白的重组vsv颗粒，所述突变的vsv m蛋白包含甲硫氨酸51处的突变。在一个特定实施方案中，甲硫氨酸51处的突变是从甲硫氨酸(m)突变为精氨酸(r)。在一个具体的实施方案中，突变的vsv m蛋白包含seq idno:7的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，突变的vsv m蛋白由seq id no:7的氨基酸序列组成。
38、在任何上述方法的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含野生型弹状病毒基质(m)蛋白。在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒的基因组编码野生型弹状病毒m蛋白。在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是包含野生型vsv m蛋白的重组vsv颗粒，该野生型vsv m蛋白包含seq id no:9的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，野生型vsvm蛋白由seq id no:9的氨基酸序列组成。
39、在任何上述方法的一个实施方案中，所述样品是血清或血浆。在任何上述方法的一个实施方案中，样品是唾液。在任何上述方法的一个实施方案中，样品是干燥的血斑点。在一个实施方案中，该方法还包括以约1:10至约1:320的因子稀释样品。例如，样品可以约1:10、约1:16、约1:20、约1:32、约1:64、约1:80、约1:100、约1:128或约1:160的因子稀释。在一个实施方案中，该方法还包括将样品稀释约1:100倍。在一个实施方案中，该方法还包括将样品稀释约1:20倍。在一些实施方案中，该方法还包括将重组弹状病毒颗粒稀释至约200-800pfu/孔。例如，可以将重组弹状病毒颗粒稀释至约200、约300、约400、约500、约600、约700、约720或约800pfu/孔。在一个实施方案中，样品是热失活的。在另一个实施方案中，样品是未热灭活的。在一个实施方案中，该方法还包括用抗生素处理样品和/或过滤样品以防止细菌污染。
40、在任何上述方法的一个实施方案中，对照是用不包含冠状病毒中和抗体的对照样品获得的报告信号，并且该方法包括当在步骤(c)中获得的报告信号与对照相比减少时，断定所述测试样品包含冠状病毒中和抗体。在一个实施方案中，该方法包括当在步骤(c)中获得的报告信号与对照相比降低超过50％时，断定所述测试样品包含冠状病毒中和抗体。在一个实施方案中，该方法还包括将步骤(c)中获得的报告信号与用对照样品获得的报告信号进行比较，所述对照样品包含冠状病毒中和抗体，或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上相互作用的蛋白质相互作用的分子，或阻断靶细胞融合的分子，或其任何组合。在一个实施方案中，该方法包括通过将报告信号与校准曲线进行比较来确定测试样品中的冠状病毒中和抗体的浓度，该校准曲线由包含冠状病毒中和抗体的对照样品的连续稀释、或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上相互作用的蛋白质相互作用的分子、或其任何组合确定。在一个具体实施方案中，对照样品包含mab10914。在一个具体的实施方案中，对照样品的连续稀释包括约0.01μg/ml至约3μg/ml mab10914。在一个具体实施方案中，对照样品包含mab10922。在一个具体的实施方案中，对照样品的连续稀释包括约0.01μg/ml至约3μg/mlmab10922。
41、在任何上述方法的一个实施方案中，报告信号已被校正以去除从未与重组弹状病毒颗粒接触的对照样品测量的背景信号。
42、在任何上述方法的一个实施方案中，在步骤(b)之后约18至30小时测量报告信号。在任何上述方法的一个实施方案中，在步骤(b)之后约24至30小时测量报告信号。
43、在任何上述方法的一个实施方案中，在步骤(a)中，使样品与重组弹状病毒颗粒在室温下接触约30分钟。
44、在任何上述方法的一个实施方案中，所述方法以高通量格式进行。在一个具体实施方案中，该方法在96孔板中进行。在一个具体实施方案中，当该方法在96孔板中进行时，第一靶细胞和第二靶细胞的密度为约6x104个细胞/孔。
45、在另一方面，本文提供了重组弹状病毒颗粒，其中弹状病毒糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导靶细胞的感染。
46、在一个实施方案中，弹状病毒颗粒还包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子。在一个实施方案中，弹状病毒颗粒包含编码所述报告蛋白的核酸分子。在一个具体实施方案中，将编码报告蛋白的核酸序列插入编码冠状病毒s糖蛋白或其片段或衍生物的核酸序列和编码弹状病毒大(l)蛋白的核酸序列之间。
47、在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是有复制能力的弹状病毒颗粒。
48、在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒是重组水泡性病毒颗粒。在一个实施方案中，所述重组水泡性病毒颗粒是重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒。
49、在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。在一个实施方案中，冠状病毒s糖蛋白是全长sars-cov-2s糖蛋白。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白包含seq id no:1的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白由seq id no：1的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段是缺少19个c末端氨基酸的sars-cov-2s糖蛋白片段。在一个具体实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段包含seq id no:3的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白片段由seq id no:3的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列具有至少77％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的s1亚基具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸14-684具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的rbd结构域具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸319-541具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，与包含表达插入到弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致产生更具融合性的重组弹状病毒颗粒。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段可包含sars-cov-2s糖蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个残基的插入、缺失和/或取代或者由其组成。用于潜在缺失的氨基酸的非限制性实例包括例如位置(145)处的酪氨酸、位置(679)处的天冬酰胺、位置(680)处的丝氨酸、位置(681)处的脯氨酸、位置(682)处的精氨酸、位置(683)处的精氨酸、位置(684)处的丙氨酸和/或位置(685)处的精氨酸，如seq id no：1中所示的位置，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等效氨基酸残基。潜在取代的氨基酸的非限制性实例包括例如：位置(5)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(28)处酪氨酸变成天冬酰胺，位置(29)处苏氨酸变成异亮氨酸，位置(49)处组氨酸变成酪氨酸，位置(54)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(74)处天冬酰胺变成赖氨酸，位置(96)处谷氨酸变成天冬氨酸，位置(111)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(157)处苯丙氨酸变成亮氨酸，位置(181)处甘氨酸变成缬氨酸，位置(221)处丝氨酸变成色氨酸，位置(247)处丝氨酸变成精氨酸，位置(348)处丙氨酸变成苏氨酸，位置(408)处精氨酸变成异亮氨酸，位置(476)处甘氨酸变成丝氨酸，位置(483)处缬氨酸变成丙氨酸，位置(519)处组氨酸变成给谷氨酰胺，位置(520)处丙氨酸变成丝氨酸，位置(614)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(614)处天冬氨酸变成甘氨酸，位置(679)处天冬酰胺变成异亮氨酸，位置(680)处丝氨酸变成亮氨酸，位置(682)处精氨酸变成甘氨酸，位置(683)处精氨酸变成丝氨酸，位置(685)处精氨酸变成谷氨酰胺，位置(685)处精氨酸变成丝氨酸，位置(797)处苯丙氨酸变成半胱氨酸，位置(930)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(936)处天冬氨酸变成酪氨酸，位置(1078)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(1168)处天冬氨酸变成组氨酸，和/或位置(1259)处天冬氨酸变成组氨酸，各位置是按照seq id no:1中编号的，或者突变sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。参见becerra-flores and cardozo,“sars-cov-2viral spike g614 mutation exhibits higher case fatality rate,”theinternational journal of clinical practice,published online may 6,2020；eaaswarkhanth et al.,“could the d614g substitution in the sars-cov-2spike(s)protein be associated with higher covid-19mortality？”international journal ofinfectious diseases,96:2020年7月,第459-460页；tang et al.,“the sars-cov-2spikeprotein d614g mutation shows increasing dominance and may confer a structuraladvantage to the furin cleavage domain,”preprints 2020,2020050407(doi:10.20944/preprints202005.0407.v1)；hansen et.al.,“studies in humanized miceand convalescent humans yield a sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日线上公开；lokman et al.,“exploring the genomic and proteomic variations ofsars-cov-2spike glycoprotein:a computational biology approach”,infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiology and evolutionarygenetics in infectious diseases,2020jun；84:104389.doi:10.1016/j.meegid.2020.104389，其中每一篇出于所有预期目的通过引用全部并入本文。用于插入、缺失和/或取代的氨基酸残基位置的其他非限制性实例包括表8和9中所列的那些(氨基酸残基的位置使用seq id no:1作为参考序列表示，其可以用作识别任何sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基(同上)的参考；出于所有预期目的将表8中的参考文献通过引用全部并入本文)。表8中列出的每个残基修饰可以单独使用或与其他残基组合使用，以产生重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒的变体。在某些实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov 2刺突蛋白)不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸，将位置(614)处天冬氨酸改变成天冬酰胺，和/或将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺，各位置如seq id no:1所示，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(685)处将精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(247)处将丝氨酸改变为精氨酸，在位置(614)处将天冬氨酸改变为天冬酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺以及将位置(685)处精氨酸改变成谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致更溶解的表型。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:42的氨基酸序列，或与seq id no：42的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由密码子优化的核苷酸序列编码。在各种实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由seq id no:43的多核苷酸序列或与seq id no：43具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％多核苷酸序列同一性的序列编码。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:44的氨基酸序列，或与seq id no：44的氨基酸顺序至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和/或将位置484处谷氨酸改变为赖氨酸和/或位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸，和/或缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同，各位置是如seq id no:1所示的，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过灭活刺突蛋白内的弗林蛋白酶切割位点而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将seq id no:1中指定d q677tnsprrarsv687(seq id no:65)或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列内的等同氨基酸残基改变成qtilrsv(seq id no:66)或qtnspgsassv(seq idno:67)而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致s1/s2界面中的一元弗林蛋白酶裂解位点(qtilrsv(seq id no:66))或弗林蛋白酶裂解位点的缺失(qtnspgsassv(seq id no:67))表型。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶裂解位点的改变可导致刺突稳定化的假颗粒。参见hansen et.al.,“studies in humanized mice and convalescent humans yielda sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日在线公开，出于所有预期目的通过引用全文并入本文。
50、在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒包含突变的弹状病毒基质(m)蛋白。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒的基因组编码突变的vsv m蛋白。在一个特定实施例中，重组弹状病毒颗粒是包含突变的vsv m蛋白的重组vsv颗粒，所述突变的vsv m蛋白包含甲硫氨酸51处的突变。在一个特定实施方案中，甲硫氨酸51处的突变是从甲硫氨酸(m)突变为精氨酸(r)。在一个具体的实施方案中，突变的vsv m蛋白包含seq id no:7的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，突变的vsv m蛋白由seq id no:7的氨基酸序列组成。
51、在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒包含野生型弹状病毒基质(m)蛋白。在一个实施方案中，重组弹状病毒颗粒的基因组编码野生型弹状病毒m蛋白。在一个具体的实施方案中，重组弹状病毒颗粒是包含野生型vsv m蛋白的重组vsv颗粒，所述野生型vsv m蛋白包含seq id no:9的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，野生型vsv m蛋白由seq id no:9的氨基酸序列组成。
52、在另一方面，本文提供了编码弹状病毒核蛋白(n)、弹状病毒磷蛋白(p)和弹状病毒大蛋白(l)或其功能片段或衍生物并进一步编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物的多核苷酸用于在重组弹状病毒颗粒的病毒包膜上表达。
53、在一个实施方案中，所述多核苷酸进一步编码报告蛋白。在一个具体实施方案中，将编码所述报告蛋白的核酸序列插入编码冠状病毒s糖蛋白或其片段或衍生物的核酸序列和编码弹状病毒大(l)蛋白的核酸序列之间。
54、在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是有复制能力的弹状病毒颗粒。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白是全长sars-cov-2s糖蛋白。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白包含seq id no:1的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白由seq id no：1的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，编码sars-cov-2s糖蛋白的核苷酸序列包含seq id no:2的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段是缺少19个c末端氨基酸的sars-cov-2s糖蛋白片段。在一个具体实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段包含seq id no:3的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白片段由seq id no:3的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，编码sars-cov-2s糖蛋白的核苷酸序列包含seq id no:4的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列具有至少77％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seqid no:1的氨基酸序列的s1亚基具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸14-684具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seqid no:1的氨基酸序列的rbd结构域具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸319-541具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，与包含表达插入到弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致产生更具融合性的重组弹状病毒颗粒。在一个实施方案中，与包含表达插入在弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒颗粒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致更融合的重组弹状病毒颗粒。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白、片段或衍生物包含表8和9中所列的一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代，其中所述插入、缺失和/或取代的位置是相对于seq id no：1确定的。在一个实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白包含seq id no：44的氨基酸序列。在上述任何方法的一个实施方案中，步骤(a)包括使所述样品与两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒接触，其中所述两种或更多种不同的重组弹状病毒颗粒，其包含不同的冠状病毒刺突(s)糖蛋白、其片段或衍生物，其中所述两种或过更多种不同的冠状病毒刺突(s)糖蛋白、其片段或衍生物中的至少一种包含选自seqid no：1、seq id no：3和seq id no：44的氨基酸序列，或者包含表8和9中列出的一个或多个氨基酸插入、缺失和/或取代，其中所述插入、缺失和/或取代的位置是相对于seq id no：1确定的。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段可包含sars-cov-2s糖蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个残基的插入、缺失和/或取代或者由其组成。用于潜在缺失的氨基酸的非限制性实例包括例如位置(145)处的酪氨酸、位置(679)处的天冬酰胺、位置(680)处的丝氨酸、位置(681)处的脯氨酸、位置(682)处的精氨酸、位置(683)处的精氨酸、位置(684)处的丙氨酸和/或位置(685)处的精氨酸，如seq id no：1中所示的位置，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等效氨基酸残基。潜在取代的氨基酸的非限制性实例包括例如：位置(5)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(28)处酪氨酸变成天冬酰胺，位置(29)处苏氨酸变成异亮氨酸，位置(49)处组氨酸变成酪氨酸，位置(54)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(74)处天冬酰胺变成赖氨酸，位置(96)处谷氨酸变成天冬氨酸，位置(111)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(157)处苯丙氨酸变成亮氨酸，位置(181)处甘氨酸变成缬氨酸，位置(221)处丝氨酸变成色氨酸，位置(247)处丝氨酸变成精氨酸，位置(348)处丙氨酸变成苏氨酸，位置(408)处精氨酸变成异亮氨酸，位置(476)处甘氨酸变成丝氨酸，位置(483)处缬氨酸变成丙氨酸，位置(519)处组氨酸变成给谷氨酰胺，位置(520)处丙氨酸变成丝氨酸，位置(614)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(614)处天冬氨酸变成甘氨酸，位置(679)处天冬酰胺变成异亮氨酸，位置(680)处丝氨酸变成亮氨酸，位置(682)处精氨酸变成甘氨酸，位置(683)处精氨酸变成丝氨酸，位置(685)处精氨酸变成谷氨酰胺，位置(685)处精氨酸变成丝氨酸，位置(797)处苯丙氨酸变成半胱氨酸，位置(930)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(936)处天冬氨酸变成酪氨酸，位置(1078)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(1168)处天冬氨酸变成组氨酸，和/或位置(1259)处天冬氨酸变成组氨酸，各位置是按照seq id no:1中编号的，或者突变sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。参见becerra-flores and cardozo,“sars-cov-2viral spike g614 mutation exhibits higher case fatality rate,”theinternational journal of clinical practice,published online may 6,2020；eaaswarkhanth et al.,“could the d614g substitution in the sars-cov-2spike(s)protein be associated with higher covid-19mortality？”international journal ofinfectious diseases,96:2020年7月,第459-460页；tang et al.,“the sars-cov-2spikeprotein d614g mutation shows increasing dominance and may confer a structuraladvantage to the furin cleavage domain,”preprints 2020,2020050407(doi:10.20944/preprints202005.0407.v1)；hansen et.al.,“studies in humanized miceand convalescent humans yield a sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日线上公开；lokman et al.,“exploring the genomic and proteomic variations ofsars-cov-2spike glycoprotein:a computational biology approach”,infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiology and evolutionarygenetics in infectious diseases,2020jun；84:104389.doi:10.1016/j.meegid.2020.104389，其中每一篇出于所有预期目的通过引用全部并入本文。用于插入、缺失和/或取代的氨基酸残基位置的其他非限制性实例包括表8和9中所列的那些(氨基酸残基的位置使用seq id no:1作为参考序列表示，其可以用作识别任何sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基(同上)的参考；出于所有预期目的将表8中的参考文献通过引用全部并入本文)。表8中列出的每个残基修饰可以单独使用或与其他残基组合使用，以产生重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒的变体。在某些实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov 2刺突蛋白)不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸，将位置(614)处天冬氨酸改变成天冬酰胺，和/或将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺，各位置如seq id no:1所示，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(685)处将精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(247)处将丝氨酸改变为精氨酸，在位置(614)处将天冬氨酸改变为天冬酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺以及将位置(685)处精氨酸改变成谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致更溶解的表型。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:42的氨基酸序列，或与seq id no：42的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由密码子优化的核苷酸序列编码。在各种实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由seq id no:43的多核苷酸序列或与seq id no：43具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％多核苷酸序列同一性的序列编码。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:44的氨基酸序列，或与seq id no：44的氨基酸顺序至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和/或将位置484处谷氨酸改变为赖氨酸和/或位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸，和/或缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同，各位置是如seq id no:1所示的，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过灭活刺突蛋白内的弗林蛋白酶切割位点而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将seq id no:1中指定d q677tnsprrarsv687(seq id no:65)或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列内的等同氨基酸残基改变成qtilrsv(seq id no:66)或qtnspgsassv(seq idno:67)而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致s1/s2界面中的一元弗林蛋白酶裂解位点(qtilrsv(seq id no:66))或弗林蛋白酶裂解位点的缺失(qtnspgsassv(seq id no:67))表型。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶裂解位点的改变可导致刺突稳定化的假颗粒。参见hansen et.al.,“studies in humanized mice and convalescent humans yielda sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日在线公开，出于所有预期目的通过引用全文并入本文。
55、在一个实施方案中，所述多核苷酸在编码sars-cov-2s糖蛋白或其片段或衍生物的序列的3’进一步包含kozak序列。在一个实施方案中，所述kozak序列是野生型kozak序列。在一个具体的实施方案中，所述野生型kozak序列包含seq id no:11或其衍生物。在一个实施方案中，所述kozak序列是优化的kozak序列。在一个具体实施方案中，所述优化的kozak序列包含seq id no:12或其衍生物。
56、在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是重组水泡性病毒颗粒。在一个实施方案中，所述重组水泡病毒颗粒是重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒。
57、在另一个方面，本文提供了一种用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的试剂盒，其包含：
58、a)重组弹状病毒颗粒，其中所述弹状病毒糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导第一靶细胞和第二靶细胞的感染；
59、b)(i)表达报告蛋白的第一部分的第一靶细胞和(ii)表达报告蛋白的第二部分的第二细胞，其中所述第一靶细胞和所述第二靶细胞在与所述重组弹状病毒颗粒接触时能够彼此融合，所述融合导致产生可检测的报告信号；
60、c)任选地，不包含所述冠状病毒中和抗体的对照样品；
61、d)任选地，对照样品，其包含冠状病毒中和抗体，或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上与其相互作用的蛋白质相互作用的分子，或阻断靶细胞融合的分子，或其任何组合；
62、e)任选地，所述报告蛋白的底物，和
63、f)任选地，使用说明书。
64、在又一个方面，本文提供了一种用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的试剂盒，其包括：
65、a)多核苷酸，其编码弹状病毒核蛋白(n)、弹状病毒磷蛋白(p)和弹状病毒大蛋白(l)或其功能片段或衍生物，并进一步编码严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物，用于在重组弹状病毒颗粒的病毒包膜上表达，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导第一靶细胞和第二靶细胞的感染；
66、b)(i)表达报告蛋白的第一部分的第一靶细胞和(ii)表达报告蛋白的第二部分的第二细胞，其中所述第一靶细胞和所述第二靶细胞如果与所述重组弹状病毒颗粒接触则能够彼此融合，所述融合导致产生可检测的报告信号；
67、c)任选地，不包含所述冠状病毒中和抗体的对照样品；
68、d)任选地，对照样品，其包含冠状病毒中和抗体，或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上与其相互作用的蛋白质相互作用的分子，或阻断靶细胞融合的分子，或其任何组合；
69、e)任选地，所述报告蛋白的底物，和
70、f)任选地，使用说明书。
71、在一个实施方案中，所述第一靶细胞和/或所述第二靶细胞均包含血管紧张素转化酶2(ace2)。在一个实施方案中，第一靶细胞是vero-dsp1(vero-dsp-1-puro；clr-73)，第二靶细胞是vero-dsp2(vero-dsp-2-puro；clr-74)。
72、在一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸1-229，并且所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸230-311。在另一个实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸1-155，并且所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶或其突变体的氨基酸156-311。在一个具体的实施方案中，所述报告蛋白的第一部分包含海肾荧光素酶突变体rluc8的氨基酸1-155，所述报告蛋白的第二部分包含海肾荧光素酶突变体rluc8的氨基酸156-311。
73、在一个实施方案中，报告蛋白的第一部分包含绿色荧光蛋白(gfp)的氨基酸1-156或其突变体，并且报告蛋白的第二部分包含gfp的氨基酸157-231或其突变体。在另一个实施方案中，报告蛋白的第一部分包含超折叠gfp的氨基酸1-213，并且报告蛋白的第二部分包含超折叠gfp的氨基酸214-230。在又一个实施方案中，报告蛋白的第一部分包含超折叠黄色荧光蛋白(yfp)的氨基酸1-154，并且报告蛋白的第二部分包含超折叠yfp的氨基酸155-262。
74、在另一个方面，本文提供了一种用于测定样品中冠状病毒中和抗体的存在的试剂盒，其包括：
75、a)重组弹状病毒颗粒，其中(i)所述弹状病毒糖蛋白(g)被冠状病毒刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物取代，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导靶细胞的感染，并且其中(ii)所述重组弹状病毒颗粒包含报告蛋白和/或编码所述报告蛋白的核酸分子；
76、b)靶细胞；
77、c)任选地，不包含所述冠状病毒中和抗体的对照样品；
78、d)任选地，对照样品，其包含冠状病毒中和抗体，或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上与其相互作用的蛋白质相互作用的分子，或其任何组合；
79、e)任选地，所述报告蛋白的底物，和
80、f)任选地，使用说明书。
81、在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含编码所述报告蛋白的核酸分子。
82、在另一个方面，本文提供了一种用于确定样品中冠状病毒中和抗体的存在的试剂盒，其包括：
83、a)多核苷酸，其编码弹状病毒核蛋白(n)、弹状病毒磷蛋白(p)和弹状病毒大蛋白(l)或其功能性片段或衍生物，并进一步编码报告蛋白和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)刺突(s)糖蛋白或其片段或衍生物，用于在重组弹状病毒颗粒的病毒包膜上表达，其中所述s糖蛋白、片段或衍生物能够介导靶细胞的感染；
84、b)靶细胞；
85、c)任选地，不包含冠状病毒中和抗体的对照样品；
86、d)任选地，对照样品，其包含冠状病毒中和抗体，或阻断冠状病毒s糖蛋白与其在靶细胞上与其相互作用的蛋白质相互作用的分子，或其任何组合；
87、e)任选地，所述报告蛋白的底物，和
88、f)任选地，使用说明书。
89、在一个实施方案中，将编码所述报告蛋白的核酸序列插入编码所述冠状病毒s糖蛋白或其片段或衍生物的核酸序列和编码弹状病毒大(l)蛋白的核酸序列之间。
90、在一个实施方案中，靶细胞是vero细胞(包括vero-αhis细胞)、vero-ace-2细胞、vero-trmpss2细胞或vero-e6细胞。在一个实施方案中，靶细胞包含血管紧张素转化酶2(ace2)。
91、在包括重组弹状病毒颗粒的任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是有复制能力的弹状病毒颗粒。
92、在任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白、其片段或衍生物衍生自严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2)。在一个实施方案中，冠状病毒s糖蛋白是全长sars-cov-2s糖蛋白。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白包含seq idno:1的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白由seq id no：1的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，编码sars-cov-2s糖蛋白的核苷酸序列包含seq id no:2的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段是缺少19个c末端氨基酸的sars-cov-2s糖蛋白片段。在一个具体实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段包含seq idno:3的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白片段由seq id no:3的氨基酸序列组成。在一个实施方案中，编码sars-cov-2s糖蛋白的核苷酸序列包含seq idno:4的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列具有至少77％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的s1亚基具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸14-684具有至少64％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的rbd结构域具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物与seq id no:1的氨基酸序列的氨基酸319-541具有至少74％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，与包含表达插入到弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致产生更具融合性的重组弹状病毒颗粒。在一个实施方案中，与包含表达插入在弹状病毒基因组的相同位置处的全长野生型sars-cov-2s糖蛋白的弹状病毒基因组的相当的重组弹状病毒颗粒相比，所述冠状病毒s糖蛋白片段或衍生物导致更融合的重组弹状病毒颗粒。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段可包含sars-cov-2s糖蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个残基的插入、缺失和/或取代或者由其组成。用于潜在缺失的氨基酸的非限制性实例包括例如位置(145)处的酪氨酸、位置(679)处的天冬酰胺、位置(680)处的丝氨酸、位置(681)处的脯氨酸、位置(682)处的精氨酸、位置(683)处的精氨酸、位置(684)处的丙氨酸和/或位置(685)处的精氨酸，如seq id no：1中所示的位置，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等效氨基酸残基。潜在取代的氨基酸的非限制性实例包括例如：位置(5)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(28)处酪氨酸变成天冬酰胺，位置(29)处苏氨酸变成异亮氨酸，位置(49)处组氨酸变成酪氨酸，位置(54)处亮氨酸变成苯丙氨酸，位置(74)处天冬酰胺变成赖氨酸，位置(96)处谷氨酸变成天冬氨酸，位置(111)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(157)处苯丙氨酸变成亮氨酸，位置(181)处甘氨酸变成缬氨酸，位置(221)处丝氨酸变成色氨酸，位置(247)处丝氨酸变成精氨酸，位置(348)处丙氨酸变成苏氨酸，位置(408)处精氨酸变成异亮氨酸，位置(476)处甘氨酸变成丝氨酸，位置(483)处缬氨酸变成丙氨酸，位置(519)处组氨酸变成给谷氨酰胺，位置(520)处丙氨酸变成丝氨酸，位置(614)处天冬氨酸变成天冬酰胺，位置(614)处天冬氨酸变成甘氨酸，位置(679)处天冬酰胺变成异亮氨酸，位置(680)处丝氨酸变成亮氨酸，位置(682)处精氨酸变成甘氨酸，位置(683)处精氨酸变成丝氨酸，位置(685)处精氨酸变成谷氨酰胺，位置(685)处精氨酸变成丝氨酸，位置(797)处苯丙氨酸变成半胱氨酸，位置(930)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(936)处天冬氨酸变成酪氨酸，位置(1078)处丙氨酸变成缬氨酸，位置(1168)处天冬氨酸变成组氨酸，和/或位置(1259)处天冬氨酸变成组氨酸，各位置是按照seq id no:1中编号的，或者突变sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。参见becerra-flores and cardozo,“sars-cov-2viral spikeg614 mutation exhibits higher case fatality rate,”the international journalof clinical practice,published online may 6,2020；eaaswarkhanth et al.,“couldthe d614g substitution in the sars-cov-2spike(s)protein be associated withhigher covid-19mortality？”international journal of infectious diseases,96:2020年7月,第459-460页；tang et al.,“the sars-cov-2spike protein d614g mutationshows increasing dominance and may confer a structural advantage to the furincleavage domain,”preprints 2020,2020050407(doi:10.20944/preprints202005.0407.v1)；hansen et.al.,“studies in humanized mice andconvalescent humans yield a sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日线上公开；lokman et al.,“exploring the genomic and proteomic variations ofsars-cov-2spike glycoprotein:a computational biology approach”,infection,genetics and evolution:journal of molecular epidemiology and evolutionarygenetics in infectious diseases,2020jun；84:104389.doi:10.1016/j.meegid.2020.104389，其中每一篇出于所有预期目的通过引用全部并入本文。用于插入、缺失和/或取代的氨基酸残基位置的其他非限制性实例包括表8和9中所列的那些(氨基酸残基的位置使用seq id no:1作为参考序列表示，其可以用作识别任何sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基(同上)的参考；出于所有预期目的将表8中的参考文献通过引用全部并入本文)。表8中列出的每个残基修饰可以单独使用或与其他残基组合使用，以产生重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒的变体。在某些实施方案中，所述sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov 2刺突蛋白)不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸，将位置(614)处天冬氨酸改变成天冬酰胺，和/或将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺，各位置如seq id no:1所示，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同之处在于将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(685)处将精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过在位置(247)处将丝氨酸改变为精氨酸，在位置(614)处将天冬氨酸改变为天冬酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺、将位置(685)处精氨酸改变为谷氨酰胺在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(247)处丝氨酸改变为精氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为天冬酰胺以及将位置(685)处精氨酸改变成谷氨酰胺而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致更溶解的表型。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:42的氨基酸序列，或与seq id no：42的氨基酸序列至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由密码子优化的核苷酸序列编码。在各种实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可由seq id no:43的多核苷酸序列或与seq id no：43具有至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％多核苷酸序列同一性的序列编码。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白片段或衍生物可包含seq id no:44的氨基酸序列，或与seq id no：44的氨基酸顺序至少50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相同的序列。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和/或将位置484处谷氨酸改变为赖氨酸和/或位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸，和/或缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如，野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同，各位置是如seq id no:1所示的，或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列中的等同氨基酸残基。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将位置(501)处天冬酰胺改变为酪氨酸、将位置(484)处谷氨酸改变为赖氨酸、将位置(614)处天冬氨酸改变为甘氨酸和缺失残基69-70而在氨基酸序列上与参考肽或多肽不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过灭活刺突蛋白内的弗林蛋白酶切割位点而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段通过将seq id no:1中指定d q677tnsprrarsv687(seq id no:65)或突变的sars-cov-2s糖蛋白序列内的等同氨基酸残基改变成qtilrsv(seq id no:66)或qtnspgsassv(seq idno:67)而在氨基酸序列上与参考肽或多肽(例如野生型sars-cov-2刺突蛋白)不同。在某些实施方案中，sars-cov-2s糖蛋白衍生物或其片段导致s1/s2界面中的一元弗林蛋白酶裂解位点(qtilrsv(seq id no:66))或弗林蛋白酶裂解位点的缺失(qtnspgsassv(seq id no:67))表型。在某些实施方案中，所述弗林蛋白酶裂解位点的改变可导致刺突稳定化的假颗粒。参见hansen et.al.,“studies in humanized mice and convalescent humans yielda sars-cov-2antibody cocktail”science,2020年6月15日在线公开，出于所有预期目的通过引用全文并入本文。
93、在任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是重组水泡性病毒颗粒。在一个实施方案中，所述重组水泡性病毒颗粒是重组水泡性口炎病毒(vsv)颗粒。
94、在包含重组弹状病毒颗粒的任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含突变的vsv基质(m)蛋白。在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒的基因组编码突变的vsv m蛋白。在一个特定实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是包含突变的vsvm蛋白的重组vsv颗粒，所述突变的vsv m蛋白包含甲硫氨酸51处的突变。在一个特定实施方案中，所述甲硫氨酸51处的突变是从甲硫氨酸(m)突变为精氨酸(r)。在一个具体的实施方案中，所述突变vsv m蛋白包含seq id no:7的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述突变的vsv m蛋白由seq id no:7的氨基酸序列组成。
95、在包括重组弹状病毒颗粒的任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒包含野生型弹状病毒基质(m)蛋白。在一个实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒的基因组编码野生型弹状病毒m蛋白。在一个具体的实施方案中，所述重组弹状病毒颗粒是包含野生型vsv m蛋白的重组vsv颗粒，所述野生型vsv m蛋白包含seq id no:9的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述野生型vsv m蛋白由seq id no:9的氨基酸序列组成。
96、在任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述报告蛋白包含荧光素酶。有用的荧光素酶的非限制性示例包括例如海肾荧光素酶、rluc8突变海肾荧光素酶、(dcpg)荧光素酶、nanoluc报告蛋白、萤火虫荧光素酶、gaussia荧光素酶(gluc)、metluc、费氏弧菌(vibriofischeri)lumazine蛋白、哈维氏弧菌(vibrio harveyi)luminaze蛋白、inoflagelate荧光素酶、萤火虫荧光素酶yy5突变体、萤火虫荧光素酶lgr突变体、萤火虫荧光素酶突变体e及其衍生物。
97、在任何上述试剂盒的一个实施方案中，所述报告蛋白包含荧光蛋白。有用的荧光蛋白的非限制性实例包括例如绿色荧光蛋白(gfp)、gfp类荧光蛋白、(gfp类)、增强的绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、增强的黄色荧光蛋白(eyfp)、蓝色荧光蛋白(bfp)、增强的蓝色荧光蛋白(ebfp)、青色荧光蛋白(cfp)、增强的青色荧光蛋白(ecfp)；红色荧光蛋白、超折叠gfp、超折叠yfp、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白、小的超红色荧光蛋白、fmn结合荧光蛋白、dsred、qfp611、dronpa、tagrfp、kfp、eosfp、irisfp、dendra、kaede、kikgr1、祖母绿荧光蛋白(emerald fluorescent protein)、azami green、mwasabi、taggfp、turbogfp、acgfp、zsgreen、t-sapphire及其衍生物。
98、在任何上述试剂盒的一个具体实施方案中，所述报告蛋白包含荧光素酶，并且所述报告蛋白的底物包含荧光素(例如，d-荧光素)、腔肠素或enduren荧光素酶底物。
99、在任何上述试剂盒的一个具体实施方案中，包含冠状病毒中和抗体的对照样品是包含mab10914的对照样品。在任何上述试剂盒的一个具体实施方案中，包含冠状病毒中和抗体的对照样品是包含mab10922的对照样品。
100、在以下描述、权利要求和附图中，本文描述的这些和其他方面对于本领域普通技术人员将是显而易见的。