免疫抑制性成纤维细胞群体的生物标志物ANTXR1及其在预测对免疫疗法的反应中的用途

本发明涉及医学领域、特别是肿瘤学领域。它提供了免疫抑制性细胞群体的新标志物及其用途。

背景技术：

1、随着2018年造成960万人死亡，癌症成为全球第二大死因。癌症的患病率也极高，每年新诊断的病例超过1500万，预计未来20年新病例的数量将上升约70％。

2、如今对癌症有许多治疗选择，包括例如手术、化疗、放疗、激素疗法、靶向疗法和姑息护理。对患者最适合的治疗的选择取决于癌症的类型、位置和分级以及患者的健康和偏好。

3、在过去的几十年间，免疫疗法已经成为癌症治疗策略的重要部分。癌症免疫疗法依赖于利用免疫系统来治疗癌症。在一直以来开发的各种免疫疗法治疗当中，免疫检查点抑制剂疗法特别有希望。然而，尽管结果令人鼓舞，但许多晚期癌症患者对免疫检查点抑制剂没有反应，并且对原发性抵抗的机制知之甚少。特别是，一些癌症发展出免疫抑制性微环境，导致了对免疫疗法的抵抗的产生。

4、因此，需要鉴定可以在开始治疗之前可靠地区分有反应和无反应患者的生物标志物，以选择很可能从免疫肿瘤药物中受益的患者。

5、癌相关成纤维细胞(caf)是癌症中丰富的组分，发挥着重要的促肿瘤发生功能。现在认识到caf是异质性的，可以基于特异性标志物的表达来定义不同的caf子集。目前，已在人类乳腺癌和卵巢癌中鉴定出4个caf子集，称为caf-s1至caf-s4(costa a等，cancer cell2018；33(3):463-79 e10)。虽然caf-s2和caf-s3成纤维细胞在健康组织中也能检测到并且可以使人想起正常的成纤维细胞，但caf-s1和caf-s4肌成纤维细胞局限于癌症和转移淋巴结中。caf-s1和caf-s4均通过互补机制促进转移。相比之下，虽然caf-s1促进人类癌症中的免疫抑制，但caf-s4却没有。caf亚群仍然是异质性的，因此需要鉴定在癌症患者中对免疫疗法的原发性抵抗具有特定作用的caf，特别是鉴定用于检测癌症中的免疫抑制性caf的新标志物。

6、还一直需要开发新的策略来克服免疫抑制性环境，从而使免疫疗法、特别是免疫检查点抑制剂治疗更有效并且所有患者都可用。

7、本发明寻求满足这些需求和其它需求。

技术实现思路

1、癌症是一种全身性疾病，包括肿瘤细胞本身和宿主间质细胞二者的多种组分。现在清楚的是，肿瘤微环境中的间质细胞在癌症发展中起重要作用。癌间质包括成纤维细胞特别是癌相关成纤维细胞(caf)、血管内皮细胞、免疫细胞和细胞外基质。caf是肿瘤间质中最丰富的组分，它们构成癌间质的主体并影响肿瘤微环境，使它们促进癌症启动、血管生成、侵袭和转移。

2、本发明人发现了新的caf亚群，它们在肿瘤部位建立免疫抑制性微环境中发挥关键作用。本发明人使用scrna-seq来解决caf-s1免疫抑制性亚群的异质性，并鉴定了8个不同的caf-s1簇。其中，3个caf-s1簇(1、2、5)属于炎性(“icaf”)亚组，5个caf-s1簇(0、3、4、6、7)属于肌成纤维细胞(“mycaf”)亚组，icaf和mycaf亚组以前在胰腺癌中描述过(ohlund d等，j exp med 2017；214(3):579-96)。

3、本发明人鉴定的8个caf-s1簇的特征在于下列编码基因的高表达：细胞外基质(ecm)蛋白(簇0)、解毒途径(簇1)、白介素信号传导(簇2)、转化生长因子β(tgfβ)信号传导途径(簇3)、伤口愈合(簇4)、干扰素γ(簇5)、干扰素αβ(簇6)和肌动球蛋白途径(簇7)。因此，本发明人对它们作了如下注释：ecm-mycaf(簇0)，解毒-icaf(簇1)，il-icaf(簇2)，tgfβ-mycaf(簇3)，创伤-mycaf(簇4)，ifnγ-icaf(簇5)，ifnαβ-mycaf(簇6)和acto-mycaf(簇7)。

4、通过分析公开可用的scrna-seq数据，在头颈鳞状细胞癌(hnscc)和非小细胞肺癌(nsclc)中证实了这些caf-s1簇的存在，证明了这些caf-s1簇跨不同癌症类型的关联性。

5、此外，本发明人发现，mycaf亚组的两个caf-s1簇——即ecm-mycaf(簇0)和tgfβ-mycaf(簇3)的丰度与免疫抑制性环境显著相关，而解毒-icaf和il-icaf的含量则不相关。

6、实际上，具有高水平的pd-1+、ctla-4+和tigit+cd4+t淋巴细胞(它们自身富含treg)和小分率的cd8+t淋巴细胞的肿瘤中富含ecm-mycaf(簇0)和tgfβ-mycaf(簇3)簇。有趣的是，ecm-mycaf(簇0)特异性签名(signature)含有lrrc15基因，该基因最近已被鉴定为对胰腺癌的免疫疗法有反应的患者的决定因素(dominguez等，cancer discov 2020；10(2):232-53)。

7、与ecm-mycaf(簇0)和tgfβ-mycaf(簇3)相反，创伤-mycaf(簇4)与免疫抑制性环境无关，但与t淋巴细胞的高度全面浸润有关。因此，由于在对免疫疗法无反应的患者的肿瘤中富含创伤-mycaf簇(簇4)，创伤-mycaf簇可能在通常对免疫疗法敏感的高浸润性肿瘤中充当原发性抵抗这种类型的治疗的新的替代标志物。因而，在诊断时评估肿瘤内特定caf-s1簇的含量为预测对免疫检查点抑制剂的原发性抵抗提供了附加价值。

8、本发明人特别表明，在诊断时，这些特定的caf-s1簇与黑色素瘤患者和nsclc患者两者对免疫疗法的原发性抵抗有关。特别是，ecm-mycaf(簇0)增加了foxp3高t细胞的分率并刺激cd4+cd25+t淋巴细胞表面处pd-1和ctla-4两者的蛋白水平，这转而增加了tgfβ-mycaf(簇3)的比例。这揭示了免疫抑制性ecm-mycaf(簇0)和tgfβ-mycaf(簇3)caf-s1簇和treg之间促进免疫抑制并参与对免疫疗法的抵抗的正反馈回路。因此，这些数据支持开发将pd-1和/或ctla-4阻断与靶向特定caf-s1簇组分的疗法相结合的策略，以克服对免疫检查点阻断的原发性抵抗。

9、相应地，本发明人的数据支持在肿瘤样本中鉴定新的具有antxr1+fap+caf的患者子集，这些患者表现出免疫抑制并且具有对免疫疗法的抵抗或低反应。因此，在该特定患者子集中，靶向antxr1+caf从而抑制或减轻antxr1+fap+caf的免疫抑制性作用的药剂可以带来治疗效益。另外，该药剂与免疫治疗剂的组合可防止发生对免疫治疗剂的抵抗或恢复对其的反应。此外，即使所有caf-s1细胞都表达fap，用fap抑制剂治疗antxr1+fap+患者仍会具有更大的治疗效益，因为antxr1+fap+caf是免疫抑制性的并与免疫疗法抵抗有关，而antxr1+fap-caf则不是。在这种情况下，利益/风险的权衡支持在这一特定的患者子集中进行这种治疗，特别是与免疫疗法相结合。

10、最后，本发明人将antxr1鉴定为caf-s1簇0、3和4的特异性标志物，允许鉴定与免疫抑制效应相关的caf。

11、在第一方面，本发明涉及一种用于检测来自患癌对象的癌样本中的免疫抑制性成纤维细胞的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的炭疽毒素受体1(antxr1)阳性成纤维细胞，antxr1+成纤维细胞的存在是免疫抑制性caf的指示。

12、在第二方面，本发明涉及一种用于预测患癌对象对免疫治疗剂的反应的体外方法，其中所述方法包括检测来自所述患者的癌样本中的antxr1+成纤维细胞，其中所述癌样本中的antxr1+成纤维细胞预测所述患者对免疫治疗剂的反应性。

13、在第三方面，本发明涉及一种用于治疗患者的癌症的免疫治疗剂，其中所述患者提供的癌样本具有(a)低数量或低百分比的antxr1+成纤维细胞；或(b)没有antxr1+成纤维细胞。

14、特别地，所述用于预测对象对免疫治疗剂的反应的方法还包括确定antxr1+成纤维细胞的百分比，antxr1+成纤维细胞的百分比是antxr1+成纤维细胞的数量相对于癌样本中的成纤维细胞总数或相对于癌样本中的细胞总数。

15、特别地，antxr1+成纤维细胞是fap+antxr1+成纤维细胞。优选地，antxr1+成纤维细胞是antxr1+癌相关成纤维细胞(caf)，优选fap+antxr1+caf。

16、更加优选地，antxr1+成纤维细胞选自：fap+antxr1+lamp5-sdc1+成纤维细胞、优选caf；fap+antxr1+lamp5+sdc1+/-成纤维细胞、优选caf；和antxr1+sdc1-lamp5-cd9+成纤维细胞、优选caf。

17、在第四方面，本发明涉及antxr1作为生物标志物在鉴定免疫抑制性成纤维细胞、优选免疫抑制性caf中的用途。本发明还涉及成纤维细胞群体中、优选caf群体中的antxr1作为患癌对象的肿瘤中的生物标志物在预测所述对象对免疫疗法的反应中的用途。

18、在第五方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的靶向antxr1+成纤维细胞的药剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有antxr1+fap+成纤维细胞、优选caf并且所述药剂抑制或降低antxr1+成纤维细胞的免疫抑制性作用，优选所述药剂选自：(i)任选与细胞毒性药物缀合的抗antxr1抗体、包含抗antxr1部分的多特异性分子、抗antxr1 t细胞受体(tcr)和抗antxr1嵌合抗原受体(car)，以及(ii)表达抗antxr1 tcr或抗antxr1 car的免疫细胞、优选t细胞或自然杀伤细胞；或其任何组合。

19、特别地，所述靶向antxr1+成纤维细胞的药剂与免疫治疗剂联合使用。

20、在第六方面，本发明涉及一种用于治疗患者癌症的fap抑制剂，其中所述患者在来自所述患者的肿瘤样本中具有antxr1+fap+成纤维细胞、优选caf。在一个特定方面，所述fap抑制剂与免疫治疗剂联合使用。

21、优选地，fap抑制剂选自：他拉布司他(talabostat)或pt-100(cas编号149682-77-9，[(2r)-1-[(2s)-2-氨基-3-甲基丁酰基]吡咯烷-2-基]硼酸)，利拉利汀(linagliptin)(tradjenta)(cas编号668270-12-0；8-[(3r)-3-氨基哌啶-1-基]-7-丁-2-炔基-3-甲基-1-[(4-甲基喹唑啉-2-基)甲基]嘌呤-2,6-二酮)，具有n-(4-喹啉基)-甘氨酰-(2-氰基吡咯烷)骨架的fap抑制剂，fapi-02(cas编号2370952-98-8；(s)-2,2',2”-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-氰基吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)，fapi-04(cas#2374782-02-0；(s)-2,2',2”-(10-(2-(4-(3-((4-((2-(2-氰基-4,4-二氟吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基)氨甲酰基)喹啉-6-基)氧基)丙基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)，和fapi-46(cas编号：2374782-04-2)，肽靶向放射性核素如fap-2286，及其任何组合。

22、在第七方面，本发明涉及一种产品或试剂盒，其包含：a)靶向antxr1+成纤维细胞的药剂和b)免疫治疗剂，作为在治疗患者癌症中同时、分别或顺序使用的组合制剂。

23、特别地，所述免疫治疗剂选自刺激患者免疫系统攻击恶性肿瘤细胞的治疗性治疗、用肿瘤抗原对患者进行免疫接种、刺激免疫系统的分子如细胞因子、治疗性抗体、过继t细胞疗法、car细胞疗法、免疫检查点抑制剂、及其任何组合，优选免疫检查点抑制剂。

24、优选地，检查点抑制剂选自针对细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白(ctla-4)、程序性细胞死亡蛋白1(pd-1)、程序性细胞死亡配体(pd-l1)、具有ig和itim结构域的t细胞免疫受体(tigit)、淋巴细胞激活基因3(lag-3)、含t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域蛋白-3(tim-3)、b和t淋巴细胞衰减因子(blta)、ido1的抗体或其任何组合，优选选自针对ctla-4、pd-1、pd-l1和tigit的抗体或其任何组合，更优选针对pd-1或ctla-4的抗体及其组合。

25、特别地，所述免疫治疗剂选自伊匹单抗(ipilimumab)、纳武单抗(nivolumab)、bgb-a317、帕博利珠单抗(pembrolizumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维单抗(avelumab)、或德瓦鲁单抗(duvalumab)、bms-986016和艾卡哚司他(epacadostat)，或其任何组合。

26、特别地，所述癌症选自前列腺癌、肺癌、非小细胞肺癌(nsclc)、乳腺癌、胃癌、肾癌、卵巢癌、肝细胞癌、骨肉瘤、黑色素瘤、下咽癌、食道癌、子宫内膜癌、宫颈癌、胰腺癌、肝癌、结肠或结直肠癌、腺癌、肉瘤、非鳞状细胞癌、鳞状细胞癌、神经内分泌肿瘤、肌肉癌、肾上腺癌、甲状腺癌、子宫癌、皮肤癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、膀胱癌、头颈癌，优选所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、nsclc、黑色素瘤和转移性黑色素瘤，更优选所述癌症选自头颈癌、nsclc、黑色素瘤和转移性黑色素瘤。