用于检测血红素结合蛋白:血红素复合物的CD91多肽的制作方法

本发明涉及cd91多肽用于检测和定量生物样品中的血红素结合蛋白:血红素复合物的用途，涉及cd91多肽用于从生物样品分离血红素结合蛋白:血红素复合物的用途以及涉及监测使用cd91多肽的溶血治疗。

背景技术：

1、溶血以红细胞的破坏为特征并且是与红细胞异常相关的贫血病症的标志，所述红细胞异常例如酶缺陷、血红蛋白病、遗传性球形红细胞增多症、阵发性夜间血红蛋白尿和刺状细胞性贫血，以及外源因素例如脾肿大、自身免疫性病症(例如，新生儿溶血病)、遗传性疾病(例如，镰状细胞病或g6pd缺乏)、微血管病性溶血、革兰氏阳性细菌感染(例如，链球菌、肠球菌和葡萄球菌)、寄生虫感染(例如，疟原虫)、毒素和创伤(例如烧伤)(schaer等人,blood,2013；121(8):1276-84)。溶血也是一种常见的输血病症，特别是大量输血和在使用体外心肺维持的患者中(rezogali等人,j.cardiothorac.vasc.anesth.,2017；31(2):505-15)。

2、患有与溶血相关病况的患者中观察到的副作用主要归因于从红细胞释放铁和含铁化合物，例如血红蛋白(hb)和血红素(buehler等人,transfusion,2004；44(10):1516-30)。在生理条件下，释放的血红蛋白被可溶性蛋白质例如触珠蛋白结合，并转运到巨噬细胞和肝细胞(schaer等人,front physiol.,2014；5:415和alayash等人,trendsbiotechnol.,2013；31(1):2-3)。然而，在溶血发生加快且性质上变成病理性的情况下，触珠蛋白的缓冲能力被压倒(muller-eberhard等人,blood,1968；32(5):811-5)。结果，血红蛋白被快速氧化成铁血红蛋白，其进而释放游离血红素(包含原卟啉ix和铁)。虽然血红素在一些生物进程中起决定作用(例如，作为必需蛋白质例如血红蛋白和肌红蛋白的一部分)，但是游离血红素是高毒性的。游离血红素是氧化还原活性铁的来源，其产生损害脂膜、蛋白质和核苷酸的高毒性活性氧种类(ros)(roumenina等人,j.mol.med.,2016；22(3):200-13)。由于血红素嵌入脂膜的能力，血红素的毒性进一步加剧，在脂膜中血红素引起膜组分的氧化且促进细胞溶解和死亡。持续低水平细胞外hb/血红素暴露的进化压力已导致补偿机制，该机制控制在生理稳态条件下和轻度溶血期间游离hb/血红素的副作用。这些系统包括释放一组结合hb或血红素的血浆蛋白，包括hb清除剂触珠蛋白(hp)和血红素清除剂蛋白血红素结合蛋白(hpx)和α1微球蛋白。

3、血浆和脑脊液中主要的结合血红素的蛋白是血红素结合蛋白。因此，血红素结合蛋白是对抗血红素对细胞有害影响的关键防御。当血红素与血红素结合蛋白以复杂、非线性但重要的关系结合时，血红素结合蛋白:血红素复合物通过受体介导的机制被多种细胞(包括肝细胞、巨噬细胞和合体滋养细胞)内吞，其中复合物在溶酶体中降解。血红素结合蛋白:血红素复合物的受体蛋白是cd91蛋白(hvidberg等人,blood,2005；106(7):2572-9)。

4、分化簇91(cd91)(lillis等人,physiol rev.,2008；88(3)；887-918和strickland等人,arterioscler.thromb.vasc.biol.,2014；34(3):487-98)，也另称为prolow-密度脂蛋白受体相关蛋白1、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(简称：lrp1)、α-2-巨球蛋白受体(a2mr)或载脂蛋白e受体(apoer)，最早由herz等人,the embo journal,1988；7(13):4119-27)描述。人前蛋白原是一种600kda的前体蛋白，其通过弗林蛋白酶水解加工成515kdaα链和85kdaβ链(通过sds鉴定)，它们是非共价缔合的。基于一级氨基酸序列的整个蛋白质的分子量为504,606kda。它在多种细胞类型上表达，包括巨噬细胞、肝细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经元、血管平滑肌细胞和合体滋养细胞，在血管平滑肌细胞、肝细胞和神经元中最为丰富。在脊椎动物中发现了cd91直系同源物，其中已经阐明了许多物种的核苷酸和氨基酸结构。

5、作为低密度脂蛋白受体蛋白家族(ldlr家族)的成员，cd91含有富含半胱氨酸的补体型配体结合重复序列、表皮生长因子前体型重复序列(egf重复序列)、β-推进器结构域、跨膜结构域和细胞质结构域。cd91的胞外结构域是α链，其包含31个富含半胱氨酸的补体型配体结合重复序列，排列在4个“配体结合结构域”中，分别具有2、8、10和11个重复序列(编号为i、ii、iii和iv)。配体结合结构域结合多种配体，包括细胞外基质蛋白、生长因子、蛋白酶、蛋白酶抑制剂复合物和其他参与脂蛋白代谢的蛋白质。在四个结构域中，结构域ii和iv结合大部分配体(kang等人,biochem.cell biol.,2014；53:15-23)。半胱氨酸形成分子内二硫键，这被认为对配体结合结构域的稳定性很重要。富含半胱氨酸的egf重复序列的22个拷贝位于配体结合结构域的侧翼。egf重复序列和β-推进器结构域用于在低ph条件下释放配体，例如在内体内，其中β-推进器结构域假定在配体结合重复序列处取代配体。跨膜结构域是β链，它包含100个残基的细胞质尾部。这个尾部包含两个npxy基序，它们负责内吞和信号转导中的功能。

6、cd91在细胞内信号传导和内吞作用中起着关键作用，因此它参与许多细胞和生物过程，包括脂质和脂蛋白代谢、蛋白酶降解、血小板衍生生长因子受体调节、整合素成熟和再循环、血管张力的调节、血脑屏障通透性的调节、细胞生长、细胞迁移、炎症、细胞凋亡以及神经退行性疾病、动脉粥样硬化和癌症等疾病(lillis等人,j.thromb.haemost.,2005；3(8):1884-93和smith等人,exp.cell res.,1997；232:246-54)。

7、cd91蛋白还作为一种受体蛋白在包括肝细胞、巨噬细胞和神经元在内的多种细胞中通过受体介导的机制参与了血红素结合蛋白:血红素复合物的内吞作用，导致细胞血红素摄取和溶酶体血红素结合蛋白降解，从而从血液中消除危险的血红素。已知cd91是对血红素结合蛋白:血红素复合物具有最高亲和力的受体(hada等人,biochim.biophys.acta,2014；1840(7):2351-60)。

8、尽管内源性血红素结合蛋白在生理性稳态条件下可以控制游离血红素的副作用，但在病理生理条件下几乎没有维持稳态血红素水平的作用，例如与溶血有关的那些条件下，其中高水平的血红素导致内源性血红素结合蛋白耗竭，从而引起血红素介导的氧化组织损伤。研究表明，在溶血性病症(例如镰状细胞病(scd)和β地中海贫血)的实验小鼠模型中，血红素结合蛋白输注减轻血红素诱导的内皮激活、炎症和氧化损伤。还显示血红素结合蛋白施用显著地降低促炎细胞因子的水平，并抵消溶血动物中血红素诱导的血管收缩(belcher等人,blood,2014；123(3):377-90和belcher等人,plos one,2018；13(4):e0196455)。

9、由于在病理生理条件下释放的血红素复合物可能需要额外施用血红素结合蛋白，以复合血红素并补偿其有害影响，因此检测血红素结合蛋白:血红素复合物并测定其在受试者中的量至关重要。

10、然而，到目前为止还没有找到合适的检测剂。虽然由于cd91对血红素结合蛋白:血红素复合物具有高亲和力，是检测和定量患有与溶血相关病况的受试者样品中的血红素结合蛋白:血红素复合物的合适试剂，但cd91蛋白的大尺寸使其难以操作。例如，鉴于蛋白质的大尺寸，重组生产是不可能的，或者只有在加重的条件下才可能。另一方面，仅仅分离和纯化蛋白质并不能提供足够的产率用于不复杂的用途作为检测试剂。因此，需要血红素结合蛋白:血红素复合物的检测试剂，使得能够有效检测血红素结合蛋白:血红素复合物，并且容易、快速且经济高效地以高产率生产有效的检测试剂。

11、本发明通过提供以高亲和力结合血红素结合蛋白:血红素复合物的cd91多肽来解决这一问题。

技术实现思路