用于自中而下抗体表征的方法与流程

本公开涉及抗体表征测序的新颖方法，诸如自中至下抗体表征和测序，例如，用于从头抗体测序、鉴定样品中的已知抗体或验证样品中的抗体的序列。在一些实施例中，这些方法涉及将抗体暴露于组织蛋白酶d、组织蛋白酶l和/或组织蛋白酶d和l，随后进行质谱法和序列鉴定和解卷积。

背景技术：

1、当前用于鉴定样品中的蛋白质序列(诸如抗体序列)的方法包括自下而上分析、自中至下分析和自上而下分析。在绝大多数情况下使用的自下而上分析中，通常可使用几种不同蛋白酶(例如4-5种蛋白酶)以产生相对较短的重叠肽(例如9-30个氨基酸长或约1-5kda)，用于液相色谱(lc)和质谱法(ms)分析。例如，如果执行此类方案以确定未知抗体的序列(即从头测序)，则必须产生大量质谱，且随后使用专门的测序程序进行组装，这些程序使用关于产物离子峰之间提取的质量偏移的信息。该方法的一个局限性为序列分析的准确性可能依赖于获得极高质量ms(例如串联式ms(ms/ms)裂解效率和低质量误差)数据以及检测跨越整个蛋白质的肽。此外，自下而上分析可对软件产生挑战，因为其可能需要将大量小肽的序列信息正确拼接在一起成为完整的蛋白质序列。使用少量肽或蛋白质片段的自中至下方法可能有助于缓解这些软件挑战。

2、自中至下方法可用于抗体，例如，其中抗体首先在重链的ch1与ch2区域之间的铰链区附近或在其中被切割，以产生例如f(ab')2、f(ab')、fc、fd、vl-cl片段。最常用的酶为来自酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的半胱氨酸蛋白酶ides，其在铰链区后被切割以产生f(ab')2片段和fc/2片段。二硫键还原后，可产生轻链(lc)片段、fd’片段和fc片段，各片段的大小约为25kda，长度约为200个氨基酸。

3、当使用普通ms仪器进行分析时，这些相对较长片段难以完全裂解，且因此可能不适合从头测序。例如，目前常用的ms仪器包括具有碰撞诱导解离的飞行时间仪器或orbitraptm高能碰撞解离(hcd)仪器，这些仪器缺乏电子诱导解离(一种高效的正交裂解方法)且缺乏紫外光解离(其也适用于极大的多肽)。因此，可能需要用自下而上的测序方法来补充仅提供有限覆盖范围的自中至下方法，以进行从头抗体测序。因此，需要替代的自中至下方法，其产生更适合常用的工业标准lc-ms/ms cid和hcd仪器的蛋白质片段，且因此更实用。

技术实现思路

1、本发明尤其包括用于切割抗体的方法，其包括将抗体与组织蛋白酶l、组织蛋白酶d或组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合混合以获得一个或多个抗体片段，其中该抗体包括轻链和重链，该轻链包括轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)，该重链包括重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，并且其中组织蛋白酶l和/或d在vl区与cl区之间和/或在vh区与ch区之间切割抗体以产生vl抗体片段和/或vh抗体片段和cl抗体片段和/或ch抗体片段。在一些实施例中，该方法还包括在切割后分离抗体片段中的一个或多个。在一些实施例中，该抗体片段在切割后不被分离。在一些实施例中，切割后，通过质谱法来分析一个或多个抗体片段。

2、例如，本发明还涵盖用于分析抗体序列的方法，其包括：(a)用组织蛋白酶l、组织蛋白酶d或组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合切割抗体以获得一个或多个抗体片段，其中该抗体包括轻链和重链，该轻链包括轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)，该重链包括重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)，并且其中组织蛋白酶l和/或d在vl区与cl区之间和/或在vh区与ch区之间切割抗体以产生vl抗体片段和/或vh抗体片段和cl抗体片段和/或ch抗体片段；(b)在切割后任选地分离抗体片段中的一个或多个；以及(c)对一个或多个抗体片段进行质谱法(ms)分析。

3、在任何上述方法中，在一些实施例中，抗体为igg抗体，例如人igg1、igg2、igg2a、igg2b或igg4抗体。在一些实施例中，切割产生vl片段和/或vh片段。在一些此类实施例中，对vl片段和/或vh片段进行ms分析。在本文的一些方法中，重链恒定区至少包含ch1区，且任选地进一步包含铰链、ch2区和/或ch3区。在本文的一些方法中，抗体重链恒定区至少包含ch1、铰链和ch2区，且其中组织蛋白酶l和/或组织蛋白酶d进一步在ch1区与铰链之间切割抗体。

4、在一些实施例中，用组织蛋白酶l切割抗体。在一些实施例中，用组织蛋白酶d切割抗体。在一些实施例中，用组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合切割抗体。在一些情况下，还使用额外酶，诸如ides或另一蛋白酶。在其他情况下，用于切割的酶由组织蛋白酶l组成，由组织蛋白酶d组成，或由组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合组成。在一些情况下，该方法包括将抗体与组织蛋白酶l和组织蛋白酶d同时孵育。

5、在一些实施例中，进行切割以实现vl区与cl区之间以及vh区与ch区之间至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％切割。在一些情况下，进行切割以实现在铰链处或铰链下方至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％切割。在一些情况下，抗体为igg抗体且经组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合切割，其中切割产生vl、vh、cl、ch1、ch2、ch3、ch2-ch3、cl+ch1(键合)、f(ab')和f(ab')2片段。在一些实施例中，切割产生包含轻链cdr1、cdr2和cdr3中的每一者的片段，诸如vl、f(ab')或f(ab')2片段，和/或包含重链cdr1、cdr2和cdr3中的每一者的片段，诸如vh、f(ab')或f(ab')2片段。

6、在本文的一些方法中，通过将抗体与组织蛋白酶l、组织蛋白酶d或组织蛋白酶d和l的组合在ph 2-8(诸如ph 2-7、ph 2-6、ph 3-6、ph 3-5、ph 2、ph 2.5、ph 3、ph 3.5、ph 4、ph 4.5、ph 5、ph 5.5、ph 6、ph 7或ph 8)下，在室温至50℃的温度下，且在不超过50％的有机溶剂(例如乙腈、甲醇、乙醇或异丙醇)存在下一起孵育来进行切割，其中抗体处于天然状态。在本文的一些方法中，在一或多种浓度为0-50％、5-50％、5-30％、0％-30％、10-30％、0-10％、5-15％、10-20％、15-25％或20-30％的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈)存在下进行切割。在本文的一些方法，包括那些包含一或多种浓度为0-50％、5-50％、5-30％、0-30％、10％-30％、0-10％、5-15％、10-20％、15-25％或20-30％的有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈)的方法中，ph为3-5，诸如3、3.5、4、4.5或5。在一些此类情况下，ph为3.5至4.5。在一些此类情况下，ph为4。在一些切割反应中，存在不超过30％的有机溶剂。在一些此类情况下，切割是在10-30％有机溶剂(例如10-30％乙腈、10-30％甲醇、10-30％乙醇或10-30％异丙醇)存在下进行。在一些切割反应中，存在不超过10％的有机溶剂。在一些切割反应中，温度介于37℃与50℃之间。

7、本文的公开内容还包括用于分析抗体序列的方法，其包含：(a)使抗体与组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合一起使用以获得一个或多个抗体片段，其包含至少一个轻链可变区(vl)片段和/或重链可变区(vh)片段，(i)其中抗体处于天然状态；(ii)其中抗体含有包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)的轻链，以及包含重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)的重链，且其中组织蛋白酶l和d在vl区与cl区之间和/或在vh区与ch区之间切割抗体以产生vl抗体片段和/或vh抗体片段以及cl抗体片段和/或ch抗体片段，以及(iii)其中切割在25℃与50℃之间的温度和3至5的ph下，且在不超过30％的有机溶剂存在下进行；(b)在切割后任选地分离抗体片段中的一个或多个；和(c)对一个或多个抗体片段进行质谱法(ms)分析。

8、在本文的任何方法中，切割后，可对一个或多个抗体片段进行以下中的一者或多者：缓冲液交换、色谱(例如液相色谱(诸如高效液相色谱)或毛细管电泳)、过滤(例如分子量截止过滤)、还原二硫键、接触胍盐酸盐或烷基化。例如，这些步骤中的一个或多个可在ms分析之前或在进行ms分析的样品的一部分上执行(例如，一部分样品的还原或烷基化，以便比较有及无这些改变的ms分配)。在一些实施例中，切割后的一个或多个抗体片段通过层析或过滤分离。在一些此类情况下，一个或多个抗体片段通过液相色谱分离。

9、在执行ms分析的一些实施例中，ms包含lc-ms或lc-ms/ms。在其他情况下，该一个或多个抗体片段在切割后不被分离。在执行质谱法的一些实施例中，质谱法包括直接注入质谱法(dims)、静态喷雾注入质谱法(static spray infusion mass spectrometry)或流动注射质谱法。

10、在执行质谱法的本文的一些实施例中，质谱数据是用于判定一个抗体片段的至少10个氨基酸延伸段的氨基酸序列。在一些实施例中，确定一个抗体片段的至少15个氨基酸延伸段的氨基酸序列。在一些实施例中，确定一个抗体片段的至少20个氨基酸延伸段的氨基酸序列。在一些实施例中，确定至少一个抗体cdr区的氨基酸序列。在一些实施例中，vh和/或vl的cdr1、cdr2和cdr3的序列经判定。在一些实施例中，确定至少一个抗体片段，诸如vh片段和/或vl片段的完整氨基酸序列。在一些实施例中，该序列由自上而下的分析确定。在一些实施例中，该序列是通过自下而上分析来进一步分析或进行确认。在一些实施例中，抗体vh区和/或vl区的氨基酸序列为未知的。在一些实施方案中，抗体的氨基酸序列为未知的。一些实施例还包含对抗体的cl和/或ch区域，诸如由被切割所产生的cl、ch1、ch2和/或ch3片段进行ms。在一些情况下，本文中的任何方法进一步包括对至少一个抗体片段进行艾德曼降解(edman degradation)。在本文的一些方法中，切割在如下的组织蛋白酶l和/或组织蛋白酶d与抗体的比下进行：1:20至1:2000、1:20至1:500、1:50至1:500、1:100至1:500、1:200至1:1000、1:200至1:2000、1:500至1:2000、1:1000至1:2000、或1:20、1:50、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、或1:1000。在本文的一些方法中，抗体在切割后保持天然状态。在本文的一些方法中，在切割期间或之后，不使用变性剂或还原二硫键的试剂来处理抗体。在本文的一些方法中，抗体在切割期间和之后保留它的二硫键。本文的一些方法包括在切割后对一个或多个抗体片段进行质谱法(ms)分析，其中抗体保持天然状态且在ms分析之前未用变性剂或还原二硫键的试剂来处理。

11、本发明还包括包含根据上述方法产生的抗体片段的组合物。在一些情况下，组合物包含由用组织蛋白酶l、组织蛋白酶d或组织蛋白酶l和d的组合产生的igg抗体片段，其中抗体片段包含vh片段和vl片段中的一或两者，以及以下片段中的至少一者、至少两者，或至少三者：cl、ch1、ch2、ch3、ch2-ch3、cl+ch1(键合)、f(ab')和f(ab')2。在一些情况下，vh和/或vl片段的长度包含90至150个氨基酸，诸如95至140个氨基酸，诸如100至140个氨基酸，或诸如100至120个氨基酸。在一些此类情况下，vh和/或vl片段具有10-16kda，诸如10-13kda，诸如10-12kda，诸如10-11kda，或诸如11-12kda的分子量。

12、本发明还包含用于用组织蛋白酶l、组织蛋白酶d或组织蛋白酶l和组织蛋白酶d的组合消化蛋白质的试剂盒，该试剂盒包含(a)组织蛋白酶l和/或组织蛋白酶d；(b)一或多种反应缓冲液；以及任选地用于(c)关于消化蛋白质的说明书。在一些情况下，试剂盒提供用于根据上述方法切割抗体的试剂。在一些试剂盒中，反应缓冲液为ph 2-8、ph 2-7、ph 2-6、ph 2-5、ph 3-6、ph 3-5、ph 3-4、ph 4-5、ph 2、ph 2.5、ph 3、ph 3.5、ph 4、ph 4.5、ph 5、ph 5.5、ph 6、ph 7或ph 8；且反应缓冲液包含一或多种有机溶剂。在一些实施例中，反应缓冲液包含浓度为0-50％、5-50％、5-30％、0-30％、10％-30％、0-10％、5-15％、10-20％、15-25％或20-30％的一或多种有机溶剂(例如甲醇、乙醇、异丙醇或乙腈)。在一些情况下，反应缓冲液的ph为3、3.5、4、4.5或5。在一些试剂盒中，反应缓冲液的ph为4。

13、应理解，前述一般描述和以下详细描述均仅为示例性的和说明性的，且不限制权利要求。并入本说明书中且构成其一部分的附图说明了某些实施例或方面，且与说明书一起用于解释本文所述的原理。