本发明总体上涉及用于使用氢交换质谱法鉴定所关注蛋白质或蛋白质药物产品中的宿主细胞蛋白的结合位点的方法。
背景技术：
1、残留的宿主细胞蛋白(hcp)的存在可能会引起生物医药产品的潜在安全风险以及制造中的问题，特别是在存在具有酶促活性的hcp的情况下。由于重组dna技术已经广泛用于在宿主细胞中产生生物医药产品，所以有必要去除杂质以获得具有高纯度的生物医药产品。在进行临床研究之前，进行纯化生物处理之后的任何残余杂质应以可接受的低水平存在。具体地，来源于哺乳动物表达系统，例如，中国仓鼠卵巢(cho)细胞的残余hcp可能危及产品安全性、质量和稳定性。有时，即使微量的特定hcp也可能引起免疫原性应答或不期望的修饰。因此，需要监测药物产品中以及制造过程期间的宿主细胞蛋白。
2、尽管通常在药物中鉴定出羧肽酶(g3h8v5)，但从未报告过其影响单克隆抗体的完整性。在本文中，在fd'药物中鉴定出羧肽酶，并且描述了其对fd'药物的稳定性的影响。fd'药物中羧肽酶的量也被量化，并且发现表明，存在低至10ppm的羧肽酶可能会损害fd'药物稳定性。这项研究的扩展表明，羧肽酶(g3h8v5)也可以影响fab蛋白的稳定性，但不会影响由igg1或igg4工程化的重组单克隆抗体。
3、同时，尚未完全理解hcp与mab之间的相互作用。最普遍接受的概念是hcp与mab共存，因为hcp与mab之间存在非特异性结合。在本文中，应用氢氘交换质谱法(hdx-ms)研究fd'药物与羧肽酶之间的相互作用，并且鉴定了允许羧肽酶切割fd'药物的特异性结合位点。在由fabricator切割的fab蛋白中也发现了类似的结合位点。然而，fd'融合药物和mab药物中未鉴定出特异性结合位点。
4、应当理解，存在对鉴定和表征具有酶促活性的hcp杂质的方法的需要。具体地，这些方法应该能够研究hcp的结合和/或酶促机制，如鉴定蛋白质药物产品中的hcp的结合位点。这些方法应该能够在制造过程期间对生物医药产品中和样品中的酶促hcp杂质提供稳健、可靠和灵敏的检测和表征。此外，这些方法应该能够基于蛋白质药物产品修饰消除或阻断hcp的酶促活性。
技术实现思路
1、限定hcp杂质的可接受的水平已经成为使用生物处理系统制造生物医药产品的关键问题。需要鉴定和表征残余hcp杂质，以研究hcp的结合和/或酶促机制。本技术提供了用于使用氢交换质谱法(hx-ms)，例如，氢/氘交换质谱法(hdx-ms)鉴定蛋白质药物产品中hcp的结合位点的方法。本技术还提供了用于修饰蛋白质药物产品以消除由酶促hcp进行的切割或修饰的方法。另外，本技术提供了用于阻断鉴定出的结合位点以消除由hcp进行的切割或修饰的方法。
2、本公开提供了一种用于鉴定所关注蛋白质与第二蛋白质之间的结合位点的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联。一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘在室温下温育所述样品，持续约60秒至约24小时。另一方面，所述方法进一步包括通过将ph调节至约2.3和/或将温度调节至约0℃来淬灭所述样品。另一方面，将所述混合物注入到与所述质谱仪联机的液相色谱系统中。又另一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。
3、一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。另一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的c端。另一方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。又另一方面，所述所关注蛋白质是vegf结合蛋白或vegf微阱。在另外的方面，所述所关注蛋白质是fab或f(ab')2。一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
4、本公开至少部分提供了一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所关注蛋白质的切割的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)通过以下鉴定由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割机制中涉及的残基：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述混合物中所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联；以及(b)使鉴定出的残基突变为第二残基，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。
5、一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。另一方面，将所述混合物注入到液相色谱系统中。另一方面，所述液相色谱系统与所述质谱仪联机。又另一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。另一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的c端。另一方面，所述天冬氨酸残基突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。又另一方面，所述谷氨酸残基突变为碱性氨基酸或中性氨基酸。在另外的方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。另一方面，所述所关注蛋白质是vegf结合蛋白或vegf微阱。一方面，所述所关注蛋白质是fab或f(ab')2。另一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。
6、本公开至少部分提供了一种用于修饰所关注蛋白质以消除由第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割的方法。在一些示例性实施例中，所述方法包括：(a)通过以下鉴定所述所关注蛋白质与所述第二蛋白质之间的结合位点：使用氧化氘温育包含所述所关注蛋白质和所述第二蛋白质的样品；将水解剂添加到所述样品中，以获得具有至少一种消化物的混合物；使用质谱仪测定所述至少一种消化物的分子量数据；以及将所述至少一种消化物的所述分子量数据与从至少一种已知蛋白质标准品获得的数据相关联；以及(b)阻断所述鉴定出的结合位点，以消除由所述第二蛋白质对所述所关注蛋白质的切割。一方面，所述第二蛋白质是宿主细胞蛋白。一方面，使用氧化氘温育所述样品，持续约60秒至约24小时。一方面，将所述混合物注入到液相色谱系统中。一方面，所述液相色谱系统与所述质谱仪联机。一方面，所述质谱仪耦接到所述液相色谱系统。一方面，所述第二蛋白质能够切割所述所关注蛋白质。一方面，所述切割涉及酸性残基，如天冬氨酸残基或谷氨酸残基。另一方面，所述切割发生在所述所关注蛋白质的c端。一方面，所述第二蛋白质是羧肽酶。一方面，所述第二蛋白质是丝氨酸类型羧肽酶。一方面，所述所关注蛋白质是vegf结合蛋白或vegf微阱。一方面，所述所关注蛋白质是fab或f(ab')2。一方面，所述所关注蛋白质是蛋白质药物产品、抗体、双特异性抗体、抗体片段、抗体的fab区、抗体-药物缀合物、融合蛋白或药物。一方面，所述方法进一步包括使用基因突变、敲除、化学修饰、酶促修饰或其组合阻断所述鉴定出的结合位点。
7、当结合以下描述和附图考虑时，将更好地认识和理解本发明的这些方面和其它方面。以下描述虽然表明各个实施例及其众多具体细节，但是以说明而非限制的方式给出的。在本发明的范围内可以进行许多替换、修改、添加或重新排列。