评定癌症的测定的制作方法

本发明涉及用于检测和/或监测患者癌症的免疫测定。癌症可以是，特别是肺癌、乳腺癌、结直肠癌或胰腺癌。在某些实施方式中，免疫测定可以用于检测患者的癌症分期或确定患者的癌症预后。

背景技术：

1、xxviii型胶原蛋白在文献中描述不多，但涉及其物理作用的研究正在慢慢出现。它主要位于周围神经和背根神经节中，但也存在于皮肤中1,2。xxviii型胶原蛋白是珠状胶原蛋白，结构上类似于vi型胶原蛋白，具有位于528氨基酸胶原结构域的侧翼的两个血管性血友病因子a结构域3。发现xxviii型胶原蛋白在健康的肺组织中水平很低，但在博莱霉素诱导的肺损伤中过度表达4，其可能表明表达xxviii型胶原蛋白的细胞可能参与组织修复过程。xxviii型胶原蛋白以前也被认为在小鼠肝癌中上调5。

技术实现思路

1、本发明人现在已经确定xxviii型胶原蛋白的形成在癌症诸如特别地肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌或胰腺癌中是上调的，并且已经开发出竞争性的elisa，所述竞争性的elisa利用靶向xxviii型胶原蛋白c端的一端的单克隆抗体，其可以用于检测和/或监测癌症并确定癌症的分期和/或预后。

2、因此，本发明提供了一种用于检测和/或监测患者癌症的免疫测定方法，所述方法包括：

3、(i)使来自患者的生物流体样品与特异性地结合xxviii型胶原蛋白的c端表位的单克隆抗体接触，

4、(ii)检测并测定在所述单克隆抗体和在样品或多种样品中的肽之间的结合量，以及

5、(iii)将在步骤(ii)中测定的所述单克隆抗体的所述结合量与正常健康受试者相关的值和/或与已知癌症严重程度相关的值和/或与在先前时间点从所述患者获得的值和/或预定的截止值关联。

6、免疫测定可以是，但不限于，竞争测定或夹心法测定。免疫测定可以是，例如，放射免疫测定或酶联免疫吸附测定(elisa)。这种测定是本领域技术人员已知的技术。

7、癌症在某些实施方式中可以是肺癌、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和/或胰腺癌。特别地，癌症可以是肺癌、乳腺癌、结直肠癌和/或胰腺癌。

8、该方法在某些实施方式中可以是用于检测患者癌症严重程度的方法。例如，该方法可以是用于检测患者的癌症分期的方法，和/或确定患者癌症预后的方法(诸如例如确定患者的可能生存时间或生存概率)。

9、在某些实施方式中，患者例如可以是正在经受癌症治疗的患者，而该方法可以包括监测患者的癌症。

10、患者的生物流体样品可以是，但不限于，血液、血清、血浆、尿或来自细胞或组织培养物的上清液。优选地，生物流体是血清或血浆，最优选地是血清。

11、如本文使用的术语“单克隆抗体”既指整个抗体，也指其保留整个抗体的结合特异性的其片段，诸如例如fab片段、f(ab')2片段、单链fv片段或本领域技术人员已知的其他此类片段。众所周知，整个抗体通常具有两对相同的多肽链的“y形”结构，每对多肽链由一条“轻”链和一条“重”链构成。每条轻链和重链的n端区域包含可变区，而重链和轻链中的每一条的c端部分构成恒定区。可变区包括三个互补决定区(cdr)，其主要负责抗原识别。恒定区允许抗体招募免疫系统的细胞和分子。保留结合特异性的抗体片段至少包括cdr和可变区足以保留所述结合特异性的其余部分。

12、在本发明的方法中，可以使用包括本领域已知的任何恒定区的单克隆抗体。人类恒定轻链被分类为κ和λ轻链。重恒定链被分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别限定了抗体的同种型为igm、igd、igg、iga和ige。igg同种型有若干个亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。单克隆抗体可以优选属于igg同种型，包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任何一个。

13、抗体的cdr可以用本领域已知的方法确定，诸如kabat等人所描述的方法。抗体可以从b细胞克隆中生成，如实例中所述。抗体的同种型可以通过对人类igm、igg或iga同种型，或人类igg1、igg2、igg3或igg4亚类具有特异性的elisa测定。生成的抗体的氨基酸序列可以使用标准技术来测定。例如，可以从细胞中分离出rna，并用于通过反转录生成cdna。然后使用引物对cdna进行pcr，其扩增抗体的重链和轻链。例如，对所有vh(可变重链)序列的前导序列具有特异性的引物可以和与位于先前已经确定的同种型恒定区的序列结合的引物一起使用。可以使用与κ或λ链的3'端结合的引物和vκ或vλ前导序列退火的引物一起来扩增轻链。全长的重链和轻链可以被生成和测序。

14、在根据本发明的方法的一些实施方式中，生物流体样品与单克隆抗体接触，该单克隆抗体特异性地结合c端氨基酸序列qetciqg(seq id no：1)(在本文也称为“pro-c28”)。优选地，所述单克隆抗体不识别或不特异性地结合所述c端氨基酸序列的延伸形式qetciqga(seq id no：2)。优选地，所述单克隆抗体不识别或不特异性地结合所述c端氨基酸序列的截短形式qetciq(seq id no：3)。

15、优选地，所述抗体对c端氨基酸序列qetciqg(seq id no：1)的亲和力与所述抗体对延伸的c端氨基酸序列qetciqga(seq id no：2)的亲和力的比为至少10比1，更优选为至少50比1、至少100比1、至少500比1、至少1,000比1、至少10,000比1、至少100,000比1、或至少1,000,000比1。

16、优选地，所述抗体对c端氨基酸序列qetciqg(seq id no：1)的亲和力与所述抗体对截短的c端氨基酸序列qetciq(seq id no：3)的亲和力的比为至少10比1，更优选为至少50比1、至少100比1、至少500比1、至少1,000比1、至少10,000比1、至少100,000比1、或至少1,000,000比

17、如本文使用的术语“c端”是指在多肽末端的c端肽序列，即在多肽的c端的一端，并且不理解为在其大方向上的意思。

18、与c端氨基酸序列qetciqg(seq id no：1)特异性地结合的单克隆抗体可以通过本领域已知的任何合适技术生成。例如，单克隆抗体可以针对具有氨基酸序列qetciqg(seqid no：1)的合成肽来制备，诸如例如通过：用包括序列qetciqg(seq id no：1)的合成肽免疫啮齿动物(或其他合适的哺乳动物)，该合成肽可以任选地与免疫原性载体蛋白(诸如钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin))连接，分离和克隆产生单个抗体的细胞，并测定所得的单克隆抗体以确保其具有所需的特异性。下文描述了用于产生与c端氨基酸序列qetciqg(seq id no：1)特异性地结合的单克隆抗体的示例性方案。

19、在根据本发明的方法的一些实施方式中，对xxviii型胶原蛋白c端表位具有特异性的单克隆抗体的结合量与正常健康受试者相关的值和/或与已知癌症严重程度相关的值和/或与在先前时间点从患者获得的值关联。

20、如本文使用的术语“与正常健康受试者相关的值和/或与已知癌症严重程度相关的值”是指通过上述方法为被认为是健康即没有癌症的受试者确定的标准化数量，和/或通过上述方法为已知患有已知严重程度的癌症的受试者确定的标准化数量。因此，例如，如果该方法是用于检测肺癌、乳腺癌或结直肠癌的方法，则单克隆抗体的结合量可以与通过该方法为健康受试者确定的标准化数量和/或与通过该方法为已知患有已知严重程度的所述癌症的受试者确定的标准化数量关联。

21、在根据本发明的方法的一些实施方式中，对xxviii型胶原蛋白的c端表位具有特异性的单克隆抗体的结合量与一个或多个预定的截止值关联。

22、如本文使用的“截止值”是指从统计学角度确定的结合量，该结合量表明患者的癌症可能性很高，或患者的特定分期或其他严重程度水平的癌症的可能性很高。例如，可以选择截止值，以便患者样品中的生物标志物结合的测量值达到或超过统计学截止值，所述统计学截止值对应于患者的至少70％的概率、优选至少80％的概率、优选至少85％的概率、更优选至少90％的概率、最优选至少95％的概率存在或可能存在癌症或特定分期的癌症或其他严重程度水平的癌症。

23、对xxviii型胶原蛋白c端表位具有特异性的单克隆抗体结合量的预定的截止值可以例如是至少50ng/ml，更优选地可以是至少60ng/ml、至少70ng/ml、至少80ng/ml、至少90ng/ml或至少100ng/ml。在这方面，通过使用统计分析已经发现，在所述截止值处或所述截止值以上的对xxviii型胶原蛋白c端表位具有特异性的单克隆抗体的测量结合量(例如，在例如使用至少60ng/ml的截止值的情况下，测量量为60ng/ml或更大)可能是各种癌症的指示。还发现的是，从统计学上看，更高的单克隆抗体测量结合量与癌症的晚期分期和较差的预后关联。因此，如果该方法是用于检测患者癌症分期的方法，那么可以使用每个癌症分期的截止值，更高的截止值用于更晚的分期。同样，如果该方法是用于确定患者癌症预后的方法，那么可以使用与某些预后(诸如可能的生存期或生存机会)相对应的截止值。通过使用这样的统计截止值，有可能利用本发明的方法给出具有高水平可信度的诊断。应用这样的统计截止值是特别有利的，因为它产生了独立的诊断测定；即它消除了为得出诊断结论而与健康个体和/或已知癌症严重程度的患者进行任何直接比较的需要。当利用该测定法评估已经具有一般表明(例如由体检和/或咨询专业医生确定)是癌症的医学迹象或症状的患者时，这也可能是特别有利的，因为它可以作为用于证实初步诊断的快速和明确的工具，并且从而有可能消除对更多侵入性程序的需要，并加速适当的治疗方案的启动。它还可能避免对长的住院时间的需要。在癌症的特定情况下，加速诊断可以导致疾病在更早的分期被检测，这反过来可能提高整体的生存机会。