使用包埋介质的组织样品光学透明化方法与流程

使用包埋介质的组织样品光学透明化方法
1.本发明涉及根据权利要求1的前序部分所述的方法，如权利要求10所述的用于制备生物组织样品的试剂盒，以及如权利要求13所述的应用。
2.为了使组织样品能够进行三维成像，例如通过光片显微术，需要透明的生物组织样品。在生物制剂中获得透明性需要从生物制品中除去特别是血色素血红蛋白的血红素基团和脂质。在“脱水”过程中，用可与水混溶的有机溶剂和水的各种混合物处理组织。为了从组织中完全除去水，用递增比例的有机溶剂进行处理。这里有许多选择，例如四氢呋喃、甲醇、异丙醇、叔丁醇和乙醇。乙醇是目前最常用的在病理学中使组织透明化的脱水介质。所有“脱水”过程的最终结果是无水样品。
3.各种透明化方法中的最后步骤是将折射率调节到进行显微术的组织的折射率。根据spalteholz(“das durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen”[on the transparency of human and animal preparations],s.hirzel发表,1911,德国专利229044号)，脱水组织的折射率对于骨为n＝1.547。基于他凭经验确定的最佳混合物，其他组织的折射率可以估计为约n＝1.551。这种高折射率需要使用通常与水不混溶的芳族化合物。对于他的研究，spalteholz使用冬青油(水杨酸甲酯)和苯甲酸苄酯或异黄樟素的混合物，其混合比例根据各种组织定制。
[0004]
可从dodt，leischner，schierloh，mauch，deininger，deussing，eder，和becker的“ultramicroscopy:three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain”中了解spalteholz方法的一种变体，其中使用“murray透明剂”(苯甲酸苄酯和苄醇的2：1混合物，折射率n＝1.559)作为包埋介质。从becker,saghafi,weiler和dodt“chemical clearing and dehydration of gfp expressing mouse brains”(2012)plos one 7(3):e33916.https://doi.org/10.1371/journal.pone.003391中可知另一种变体。spalteholz包埋介质和许多其它芳族化合物进行了测试。二苯甲基醚(dbe，折射率n＝1.562)作为最适合的化合物出现并且已经成为组织透明化中的事实上的金标准。dbe的优点还在于其易于使用，因为不需要将溶液混合然后检查其折射率；它可以以纯物质的形式直接使用。
[0005]
从wo 2017/093323a1中已知有使用肉桂酸乙酯(eci)和相关的肉桂酯作为当时的常用的包埋介质的无毒替代物。它表现出比用于组织处理的其它芳族化合物例如二苯甲基醚、苄醇或苯甲酸苄酯更低的急性和慢性毒性。由于作为纯物质它实现了所需的折射率，因此消除了混合步骤，从而消除了工作步骤和可能的误差源。
[0006]
因此，适合作为脱水样品包埋介质的纯液体物质的选择目前限于两种化合物，二苯甲基醚和肉桂酸乙酯。然而，两种物质都有缺点：二苯甲基醚是有毒的。虽然肉桂酸乙酯具有低毒性，但其熔点为6℃至9℃，因此用肉桂酸乙酯透明化的样品不能储存在冰箱中，因为包埋介质将在其中结晶。肉桂酸乙酯还具有相对较高的蒸气压。
[0007]
本发明的目的是提供一种制备用于光学显微镜检查的生物组织的透明组织样品的方法，该方法克服了上述缺点，并且特别地涉及相比必须产生作为包埋介质的混合物而
更省力，避免了具有高毒性的包埋介质，并且允许脱水组织样品的冷藏储存。
[0008]
根据本发明，该目的通过如权利要求1所述的方法来实现。该目的还通过如权利要求9所述的试剂盒和如权利要求11所述的应用来实现。
[0009]
其它的实施方式是从属权利要求或下文描述的主题。
[0010]
根据本发明的用于制备用于光学显微镜检查的生物组织的透明组织样品的方法包括以下步骤：
[0011]
a)用脱水溶剂使组织样品脱水，和
[0012]
b)通过将脱水的组织样品置于具有与该组组相匹配的折射率包埋介质中使脱水的组织样品透明化。
[0013]
所述包埋介质包含苯甲醛茴香醚，优选选自3-甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛和4-乙氧基苯甲醛。
[0014]
根据本发明的方法的目的是在用于光学显微镜的生物或人组织样品中实现光学透明度。生物组织例如是人组织或动物组织。
[0015]
透明化方法的透明化步骤是将折射率调节为进行显微术的组织的折射率。为此，将组织样品转移到用于调节折射率的溶液中：包埋介质。包埋介质必须与脱水步骤中使用的溶剂混溶。
[0016]
在一个实施方式中，包埋介质含有10体积％至100体积％的苯甲醛醚和0体积％至90体积％的折射率为约1.3、优选约1.5的光学上合适的惰性有机溶剂。例如，包埋介质含有90体积％至100体积％的苯甲醛醚。
[0017]
在另一个实施方式中，包埋介质含有10体积％至100体积％的苯甲醛醚和0体积％至90体积％的折射率为约2.0、优选约1.65的光学上合适的惰性有机溶剂。例如，包埋介质含有90体积％至100体积％的苯甲醛醚。
[0018]
本发明所述的所有百分比是体积百分比(体积％)。
[0019]
在优选的实施方式中，包埋介质由本发明的苯甲醛茴香醚组成，即苯甲醛茴香醚作为纯物质使用。纯物质在此被理解为指具有工业上可获得的纯度的苯甲醛茴香醚。
[0020]
苯甲醛醚是苯甲醛茴香醚。苯甲醛茴香醚优选选自3-甲氧基苯甲醛(间-茴香醛；cas编号591-31-1)、4-甲氧基苯甲醛(对茴香醛；cas编号123-11-5)、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛(6-羟基-间茴香醛；cas编号672-13-9)和4-乙氧基苯甲醛(homoanisaldehyde；cas编号10031-82-0)。作为工业产品的3-甲氧基苯甲醛具有约97.0％的纯度。作为工业产品的4-甲氧基苯甲醛具有约97.0％的纯度。作为工业产品的2-羟基-5-甲氧基苯甲醛具有约98.0％的纯度。作为工业产品的4-乙氧基苯甲醛具有约99％的纯度。
[0021]
脱水步骤a)的目的是获得不含水的组织样品。在一个实施方式中，优选用各种脱水组合物以递减的水系列(即含有递增比例的水混溶性有机溶剂的混合物)处理组织样品多个轮次，以从组织中除去水。使用醇、酮或醚作为脱水介质。合适的脱水溶剂是例如乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇(iupac：2-甲基丙-2-醇)、四氢呋喃或丙酮。
[0022]
这里的脱水介质具有以下性质：(1)它与水完全混溶，以便和固定剂可以通过递增浓度系列逐渐从组织中除去，和(2)它与用来将折射率调节至脱水组织的折射率的包埋介质完全混溶。
[0023]
在一个替代实施方式中，脱水步骤a)用2,2-二甲氧基丙烷(dmp)进行，其通过与组
织中存在的水的化学反应从组织中除去所述水。
[0024]
在根据本发明的方法中，在一个实施方式中的获得不含水的组织样品的脱水步骤a)涉及使用如下的脱水组合物：
[0025]-其由具有递增乙醇浓度的水性乙醇组成，其中脱水组合物的乙醇浓度为30体积％至100体积％，或
[0026]-其由具有递增四氢呋喃浓度的水性四氢呋喃组成，其中脱水组合物的四氢呋喃浓度为30体积％至100体积％，或
[0027]-其由具有递增甲醇浓度的水性甲醇组成，其中脱水组合物的甲醇浓度为30体积％至100体积％，或
[0028]-其由另一种醇、酮或醚的水性混合物组成，其中脱水组合物的溶剂浓度为30体积％至100体积％。
[0029]
在根据本发明的方法的替代实施方式中，使用如下的脱水组合物进行脱水步骤a)以获得具有》2％的残余水含量的组织样品：
[0030]-其由具有递增乙醇浓度的水性乙醇的组合物组成，其中脱水组合物的乙醇浓度为50体积％至98体积％、优选70体积％至98体积％、更优选75体积％至98体积％，或者
[0031]-其由另一种醇、酮或醚的水性混合物组成，其中脱水组合物的溶剂浓度为50体积％至98体积％、优选70体积％至98体积％、更优选75体积％至98体积％。
[0032]
使用的脱水组合物优选甚至在脱水步骤的最后阶段仍含有2体积％至30体积％的水。在该实施方式中，还可以使用例如残余水含量为例如4体积％至6体积％的变性乙醇。
[0033]
在根据本发明的方法的另一个替代实施方式中，脱水步骤a)在梯度混合器中进行。为此，将组织样品置于混合容器(梯度混合器)中。通过入口引入脱水溶剂直至达到5体积％至20体积％的残余水含量。脱水溶剂可以具有100体积％的溶剂浓度或2体积％至50体积％的残余水含量。在一个变化形式中，梯度混合器中的组织样品在开始时直接引入溶剂浓度为50体积％的脱水溶剂中，然后以小增量增加梯度。
[0034]
组织样品优选直接从梯度混合器转移到包埋介质中，而不先在高纯度溶剂中温育。优选地，在步骤a)或步骤b)中不进行在高纯度溶剂中的温育步骤。
[0035]
出人意料的是，以这种方式的组织样品透明化是可能的。根据现有技术，梯度混合器中的方法如下进行：将组织样品置于混合容器(梯度混合器)中。容器具有例如在顶部的入口和侧出口。如果在50％乙醇中的样品置于该混合容器中，并且用计量泵通过入口引入高浓度(》95体积％的溶剂)，则建立试图渐近地达到100体积％的值的梯度。这导致样品被供给有利的稳定增加的乙醇含量。由于用混合物不可能达到100％，样品通常随后在高纯度乙醇中进行温育。根据现有技术，该温育步骤重复多次。因此，由于成本原因，计量泵可以常规地填充工业级乙醇。
[0036]
在本发明的方法中，(1)用无水乙醇的最终(任选地重复)温育步骤变得多余，并且(2)使用梯度混合器达到的终点对于步骤b)中的组织样品的进一步透明化是足够的，条件是乙醇含量高于约80％。
[0037]
在另一个替代实施方式中，脱水步骤a)在单轮中进行。不使用包含两轮以上的脱水系列；相反，根据步骤a)的脱水通过将组织样品置于溶剂浓度为至少70体积％的脱水溶剂中以单轮进行。该实施方式特别适用于具有几乎不吸水的致密组织的组织样品。在随后
的步骤b)中，将组织样品立即置于包埋介质中，而仍不在高纯度溶剂中进行温育以完全脱水。这导致显著的时间节省，同时也显著节省所使用的试剂。对试剂的节省首先是由于需要的溶剂的量更小。其次，不再需要使用高纯度无水溶剂；可替代地使用工业级溶剂。在乙醇的情况下，不需要例如使用昂贵的100％高纯度乙醇；可以替代地使用成本更低的变性乙醇。根据现有技术，重复用高纯度无水溶剂进行温育以便完全除去最后痕量的水，而出于相同的原因，许多方案也重复进行在包埋介质中的温育。由于在本发明的两种实施方式中省略了用于可靠地从组织中去除残留水的最终温育，因此本发明的方法节省了试剂。
[0038]
在根据本发明的方法的一个实施方式中，在步骤a)中脱水并且在步骤b)中光学透明化之前，组织样品
[0039]
·
经固定和/或
[0040]
·
用甲醛固定和/或
[0041]
·
经洗涤和/或
[0042]
·
用水洗涤和/或
[0043]
·
在含有非离子型洗涤剂的碱性水溶液中温育和/或
[0044]
·
用洗涤剂溶液脱脂(delipidation)和/或
[0045]
·
用有机溶剂脱脂(delipidation)和/或
[0046]
·
用氧化性试剂漂白和/或
[0047]
·
用氨基醇脱色。
[0048]
在根据本发明的方法的一个实施方式中，在步骤a)中脱水和在步骤b)中光学透明化之前，组织样品经固定，并且固定剂选自
[0049]-交联固定剂，例如甲醛、戊二醛、丙烯醛、碳二亚胺、焦碳酸二乙酯、双亚氨基酯或乙二醛或其混合物，和/或
[0050]-凝固剂固定剂，例如醇和其它有机溶剂、酸、重铬酸钾、硝酸铅、硫酸铜和氯化汞及其混合物。
[0051]
根据本发明的方法优选在组织制备步骤之后和电泳步骤之后进行。因此，在根据本发明的方法中处理的组织样品已经被预处理。电泳预处理优选根据de 102016123458b3中描述的电泳透明化方法进行。对于电泳透明化的性能，参考专利说明书de102016123458b3，其内容在此并入本技术。
[0052]
在根据本发明的方法中，光学透明化的组织样品优选地在另一步骤中在显微镜下检查以获得样品内部结构的图像，其中所述显微镜是光学显微镜，优选地是光片显微镜、共焦显微镜、双光子显微镜或光学投影断层摄影(opt)显微镜。
[0053]
迄今为止使用的包埋介质二苯甲基醚(dbe)的折射率为n＝1.562。第二种纯物质肉桂酸乙酯的折射率为n＝1.559。在本发明的苯甲醛茴香醚中，3-甲氧基苯甲醛的折射率例如为n＝1.552，2-羟基-5-甲氧基苯甲醛的折射率为n＝1.580。本发明的苯甲醛茴香醚作为用于脱水组织样品的组织透明化的包埋介质的应用实现了与用水杨酸甲酯/苯甲酸苄酯以及用肉桂酸乙酯处理的组织样品的透明度至少相同的透明度，在一些情况下甚至透明度更好。
[0054]
spalteholz的研究先前已经表明不同组织的折射率彼此略有不同。他的原始1911公开文献以基于水杨酸甲酯和bb的最佳混合比凭经验确定的折射率递增的顺序列出了一
系列人类组织：早期胚胎(5：1-3：1，取决于体重)《成人脱钙骨(5：3)n＝1.547《成人肌肉，大约与较晚期胚胎相同(2：1)《脑和脊髓(1：1)。这种变化对于不同组织的透明度和通过显微镜检查所述组织、以及特别是对于可以用显微镜进行的定量光谱测定具有直接影响。根据本发明的方法提供了使用各种纯物质作为包埋介质的优点，其可以根据组织类型选择以接近组织的折射率。
[0055]
与迄今为止通常用作包埋介质的苯甲酸苄酯/苄醇混合物(babb)和水杨酸甲酯/苯甲酸苄酯混合物相比，苯甲醛茴香醚具有如下优点：正如二苯甲基醚，它们可以纯物质的形式使用：由于纯物质已经实现了所需的折射率，因此不需要通过混合包埋介质来设定折射率。这消除了混合步骤，从而消除了多余的工作步骤和可能的误差源。
[0056]
出人意料的是，本发明的苯甲醛茴香醚比迄今为止已知的包埋介质更快地渗透脱水组织，并且快速地使组织透明。这节省了制备样品时的时间，允许更迅速地提供样品用于在光学显微镜下检查。因此，光学显微镜检查的结果也变得更迅速可用。脱水的组织的密度由仍然存在于组织中的脱水溶剂例如乙醇的密度决定。由于包埋介质通常具有更高的密度，可以容易地通过组织样品在包埋介质中的下沉来监测包埋介质完全渗透到组织样品中。例如，采用2-羟基-5-甲氧基苯甲醛，包埋介质仅在30至45分钟后就完全渗透到组织样品中，即组织样品位于容器的底部。另一方面，采用常规包埋介质如二苯甲基醚或水杨酸甲酯/苯甲酸苄酯混合物，该方法步骤通常花费几小时至过夜。根据本发明的方法因此提供了这样的优点，即包埋介质更快速地扩散到组织样品的组织中，在样品的制备中实现显著的时间节省。因此可以通过光学显微镜更迅速地检查组织样品。
[0057]
如果组织样品含有残留的水并被转移到其中水无法再被溶解的作为包埋介质的有机溶剂中，则水被捕获在组织中，并且由于其不完全的混溶性，导致对透明度有不利影响的浊度。因此，迄今为止惯常地例如将组织样品与高纯度乙醇一起温育多次，随后通常与包埋介质一起反复温育，以避免不利地影响样品的透明度。根据现有技术，如已经解释的，重复与高纯度无水溶剂的温育是为了完全除去最后痕量的水，出于相同的原因，许多方案也重复在包埋介质中的温育。
[0058]
根据本发明，用苯甲醛茴香醚进行组织透明化。出人意料的是，发现含有残余水的组织样品也可获得良好的透明度。在2体积％至5体积％的少量残余水含量下，未观察到对透明度的不利影响，并且甚至在高达20体积％或高达30体积％的高水含量下，取决于所处理的组织的类型，仅观察到极低的浊度，而这仍允许通过光学显微镜进行样品检查。
[0059]
因此，根据本发明的方法提供了一种特别快速和简单的用于使组织样品脱水的方法，因为与迄今为止已知的所有包埋介质不同，高达10体积％的低残留水含量对光学显微镜检查的结果没有不利影响，并且即使在更大量的残留水的情况下也实现了可接受的组织样品中的透明度。
[0060]
与使用传统包埋介质的透明化方法相比，根据本发明的方法还允许了简化的程序。根据现有技术，在脱水过程中，组织样品在具有递增浓度的脱水溶剂(例如，具有递增浓度的乙醇)的容器间转移。这需要若干的单独步骤，这些步骤是分开的。此外，在最终的一个或多个步骤中总是需要使用高纯度溶剂，例如高纯度乙醇。
[0061]
在根据本发明的方法中，还可以使用具有残余水含量的脱水溶剂。例如，可以使用变性的95％至97％工业级乙醇代替高纯度乙醇。因此，根据本发明的方法还节省了所用溶
剂的成本。
[0062]
当使用梯度混合器时，根据本发明的方法还允许简化的程序，因为在此同样不需要随后用高纯度溶剂完全脱水。
[0063]
此外，苯甲醛茴香醚具有低毒性。当用作包埋介质时，这是有利的，因为显微镜中的组织样品位于使用者气道的正下方，并且使用者可以吸入从样品中上升的蒸气。根据欧洲化学品管理局echa，与二苯甲基醚或苯甲酸苄酯/苄醇混合物不同，茴香醛的毒性没有毒理学影响。
[0064]
根据本发明的用于制备用于光学显微镜的生物组织样品的试剂盒包括：
[0065]-用于使该组织样品脱水的脱水溶剂，和
[0066]-包埋介质，其用于通过将脱水的组织样品置于所述包埋介质中来使该样品透明化，
[0067]
其中，
[0068]
包埋介质是如上所述的苯甲醛茴香醚，其选自3-甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛和4-乙氧基苯甲醛。苯甲醛茴香醚优选以上文所述的浓度和纯度使用。
[0069]
试剂盒中的脱水溶剂是醚、酮或醇，优选地，溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇、叔丁醇、2,2'-硫代二乙醇、三氯乙醇、四氢呋喃和丙酮。
[0070]
根据本发明，苯甲醛茴香醚：
[0071]
选自3-甲氧基苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、2-羟基-5-甲氧基苯甲醛和4-乙氧基苯甲醛，
[0072]
用作包埋介质，所述包埋介质用于制备用于光学显微镜检查的生物组织样品特别是人组织样品。
[0073]
根据本发明使用的苯甲醛茴香醚优选以上文所述的浓度和纯度使用。
实施例
[0074]
实施例1
[0075]
将体积为约0.25ml(0.5
×
0.5
×
1cm3)的若干组织样品(猪肺)在无水乙醇中脱水并拍照。用乙醇脱水的组织样品示于图1的左侧。
[0076]
然后将脱水的组织样品置于5ml的相应包埋介质中3小时。使用的包埋介质是根据本发明的2-羟基-5-甲氧基苯甲醛，和作为对比例的水杨酸甲酯与苯甲酸苄酯的混合物，其折射率调节至2-羟基-5-甲氧基苯甲醛的折射率。同样拍摄透明化步骤的结果。结果示于图1的右侧。发现用水杨酸甲酯/苯甲酸苄酯透明化已经导致组织样品的良好透明度。然而，用本发明的2-羟基-5-甲氧基苯甲醛获得的透明度甚至更好。
[0077]
实施例2
[0078]
使用2-羟基-5-甲氧基苯甲醛、肉桂酸乙酯和二苯甲基醚作为包埋介质，如实施例1所述制备体积为约0.25ml(0.5
×
0.5
×
1cm3)的若干组织样品(猪肺)。
[0079]
然后将组织样品储存在无水乙醇中过夜，并将包埋介质再次从组织样品中洗出。将组织样品转移到具有规定水含量的乙醇中，以便在组织中获得规定的残留水含量，温育2小时，然后放回对应的包埋介质中进行照相。将组织样品置于乙醇含量为95体积％、90体
积％和80体积％的乙醇中。拍摄结果并示于图2中。第一行显示包埋介质中的100％脱水的组织样品，第二行显示包埋介质中的在水含量为5体积％的乙醇中温育的组织样品，第三行显示包埋介质中的在水含量为10体积％的乙醇中温育的组织样品，第四行显示包埋介质中的在水含量为20％的乙醇中温育的组织样品。最下行显示了在无水乙醇中的相同组织样品，即，在它们被置于对应包埋介质中之前。当在乙醇中完全脱水时，所有样品具有相等的不透明度。
[0080]
发现现有技术中已知的包埋介质二苯甲基醚和肉桂酸乙酯仅在没有残余水或仅有非常少量的残余水时才获得了所需的透明度。在dbe的情况下，5体积％的残余水含量足以使样品不再透明，因此不能在显微镜下检查。在95％eci的残余水含量下同样已经显示出明显浑浊，并且组织样品不再是完全透明的。另一方面，用2-羟基-5-甲氧基苯甲醛透明化的组织样品甚至在10体积％的残余水含量(90体积％乙醇)下仍保持完全透明，并且在20％残余水(80％乙醇含量)下仅显示轻微浑浊。
[0081]
实施例3
[0082]
将体积为约0.25ml(0.5
×
0.5
×
1cm3)的组织样品在无水乙醇中脱水。然后将它们转移到样品容器中的包埋介质中。使用的包埋介质是根据本发明的2-羟基-5-甲氧基苯甲醛，和作为对比例的二苯甲基醚和水杨酸甲酯与苯甲酸苄酯的混合物。观察到在2-羟基-5-甲氧基苯甲醛的情况下，组织样品在15分钟后已经明显地下沉到表面以下，并且取决于组织类型，在30至45分钟后位于容器的底部。在二苯甲基醚中组织样品花费几个小时沉到底部，这与水杨酸甲酯/苯甲酸苄酯的混合物和dbe所需时间相当。
[0083]
在进一步的实验中，测定组织样品中脱水溶剂乙醇被包埋介质替代的速率。使用的包埋介质是根据本发明的2-羟基-5-甲氧基苯甲醛和作为比较例的二苯甲基醚和肉桂酸乙酯。将组织样品置于包埋介质中15分钟、30分钟和70分钟，然后拍照。结果如图3所示。在最上行，组织样品在透明化15分钟后拍摄照片。在中间行，组织样品在透明化30分钟后拍照。在最下行，组织样品在透明化70分钟后拍摄照片。可以看出，用2-羟基-5-甲氧基苯甲醛处理的组织样品在70分钟后已经是透明的，而用eci处理的样品仅显示出轻微的透明度，而用dbe处理的组织样品根本不透明。因此，根据本发明的透明化方法实现了组织样品的更快速的透明化。
[0084]
本发明不限于上述实施方式之一，而是可以以各种方式修改。
[0085]
从权利要求书、说明书和附图中显而易见的所有特征和优点、包括方法步骤，其单独地或以各种组合对本发明而言都至关重要。