检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器及其制备方法和应用

1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.可溶性cd146（scd146）与癌症的发生发展密切相关，其作为分子标记在癌症早期诊断和治疗方面具有重要作用。光电化学生物传感器检测分子标记物的优势备受关注，但是已报道的传感器大多数是基于单方向信号响应策略构建起来的，不利于消除实际样品中干扰物对检测抗干扰能力和灵敏度的不良影响，可能会出现假阳性或假阴性误差，严重限制了其在scd146分析检测中的应用与发展。
3.信号翻转型光电化学生物传感器具有高选择性和高灵敏度的优势在最近发展流行起来。光电流方向翻转作为一个新兴的信号响应策略，其信号翻转机制及应用研究仍需进一步探究。作为光电流方向翻转体系的核心要素，光电活性材料直接影响其翻转效能，现有翻转体系中的两个光电活性材料通常需要生物元件（如抗体、核酸、多肽）连接而没有直接接触，导致电子转移路径增长，光电转换效率降低。同时，基于硫化镉、碲化镉、氧化铜等构建的翻转体系因有毒或光稳定性差也限制了它们的实际应用。因此，开发一种高性能的新型光电流方向翻转传感平台是一项值得深入探讨且有意义的研究工作。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明有必要提供一种检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器及其制备方法和应用，以解决上述问题。
5.具体地，本发明提供一种检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器的制备方法，包括步骤：制备氧化铟锡/二氧化钛电极：对金属有机框架材料进行碳化处理得到二氧化钛多面体；以所述二氧化钛多面体为溶质，配制二氧化钛多面体悬浮液；将所述二氧化钛多面体悬浮液滴加到氧化铟锡电极上，制得氧化铟锡/二氧化钛电极；制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极：将单链辅助dna探针吸附到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面上，以封闭所述二氧化钛多面体上的活性位点，清洗得到氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极；制备共轭物ab
1-fe3o4@au-dna：将氨基化的fe3o4磁珠与金纳米颗粒进行振摇处理，使所述氨基化的fe3o4磁珠与所述金纳米颗粒通过共价键结合形成fe3o4@au颗粒，获得fe3o4@au溶液；依次向所述fe3o4@au溶液中加入第一目标捕获抗体（ab1）和支持dna探针（support dna），并进行室温振摇孵育和磁分离处理，使得所述ab1、支持dna探针和所述fe3o4@au颗粒通过共价键结合，制得
ab
1-fe3o4@au-dna共轭物溶液；其中，该共轭物ab
1-fe3o4@au-dna可以表述为：第一目标捕获抗体ab1和支持dna探针共同修饰的fe3o4@au颗粒共轭物；制备共轭物ab
2-aunps-dna：先向ph为8～9的金纳米颗粒溶液中加入第二目标捕获抗体（ab2）进行反应，再加入支持dna探针和步行dna探针（dna walker）形成混合溶液，该混合溶液发生反应使得所述ab2、支持dna探针和步行dna探针通过共价键与所述金纳米颗粒溶液中的金纳米颗粒结合，得到ab
2-aunps-dna共轭物溶液；其中，该共轭物ab
2-aunps-dna可以表述为：第二目标捕获抗体ab2、支持探针和步行探针共同修饰的金纳米颗粒共轭物；构建中间探针：先将不同浓度的癌症标志物加入到所述ab
1-fe3o4@au-dna共轭物溶液中进行孵育和磁分离处理，再加入所述ab
2-aunps-dna共轭物溶液进行孵育和磁分离处理，然后加入限制性核酸内切酶nt.bsmal进行反应和磁分离处理，获取上清液，该上清液中含有靶向诱导三维双支持dna步行器循环信号放大反应的中间探针；制备传感器：将所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极与所述上清液中的中间探针进行混合孵育处理，使其中的中间探针与单链辅助dna探针形成特异性双链并使单链辅助dna探针从所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极上释放出来，暴露出所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极中的二氧化钛多面体上的活性位点，得到具有活性位点的氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极；将氮化碳量子点吸附在所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极上形成氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点复合电极，使得二氧化钛和氮化碳量子点直接接触，以制得直接接触式信号翻转型生物传感器。
6.优选地，所述金属有机框架材料为mil-125。
7.基于上述制备方法，所述制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极的步骤包括：将所述单链辅助dna探针在95℃退火5 min，并待冷却至室温后，将所述单链辅助dna探针滴加到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面进行吸附处理，清洗即得到所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极。
8.基于上述制备方法，所述癌症标志物为scd146、更换对应的抗体，可选择不同的蛋白癌症标志物。
9.基于上述制备方法，所述氮化碳量子点采用微波法一步合成。具体地，所述氮化碳量子点的制备方法包括：以柠檬酸和尿素为原料，溶解于超纯水中并进行微波处理形成深棕色固体；所述深棕色固体冷却至室温后再加入超纯水溶解获得深棕色溶液；对所述深棕色溶液进行离心处理并取其上清液，获得所述氮化碳量子点。
10.本发明还提供一种检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器，其主要是由上述检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器的制备方法制得的。
11.本发明还提供一种上述检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器在检测癌症标志物方面的应用。
12.基于上述应用，包括将所述检测癌症标志物的生物传感器置于含0.1 m ph 7.4的抗坏血酸的tril-hcl缓冲溶液中，并施加-0.2 v的偏压进行pec检测，检测出所述癌症标志
物在不同浓度下的光电流信号；依据检测结果构建癌症标志物的浓度和光电流信号之间的线性方程。
13.基于上述应用，将所述单链辅助dna探针吸附到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面上的时间为30～120 min，将氮化碳量子点吸附到所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极中二氧化钛多面体暴露出的活性位点上的时间为30～120 min。优选地，将所述单链辅助dna探针吸附到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面上的时间为90 min，将氮化碳量子点吸附到具有活性位点的所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极表面上的时间为60 min。
14.基于上述应用，scd146的浓度范围为10-5000000 fg/ml时，构建的线性回归方程是i=-174.34logc
scd146-1314.00 (r2=0.9977)，检测下限2.1 fg/ml；其中，i是利用所述检测癌症标志物的生物传感器检测出的光电流信号，c
scd146
代表scd146的浓度。
15.因此，本发明提供的检测癌症标志物的生物传感器是一种光电化学生物传感器，属于直接接触式二氧化钛多面体//氮化碳量子点环保型光电流方向翻转体系，克服现有光电流方向翻转体系存在电子转移路径长或有毒等问题，同时拓展光电流方向翻转策略在光电化学生物传感器中的应用与发展。
16.上述检测癌症标志物的生物传感器基于直接接触式光电流方向翻转策略、靶向诱导三维双支持dna步行器循环信号放大技术和金属有机框架材料吸附特性的有机结合起来，进行光电流信号翻转设计，不仅放大了光电流信号的读出，而且缩短了翻转材料之间的电子传递路径，提高光电流方向翻转效能，使得生物传感器检测结果更为准确，提高检测灵敏度；此外，本发明提供的生物传感器基于光电流方向翻转策略只有在识别目标时，才能产生一个方向相反的光电流信号，因此，不同干扰蛋白对本检测体系均无明显的干扰；因此，利用本发明提供的上述生物传感器能够实现环保型检测癌症标志物，并具有灵敏度高、选择性高、重现性好、稳定性高等优点，还可以实现准确低浓度癌症标志物的检测，光电化学生物分析提供了一条新的途径，具有良好的应用前景。
附图说明
17.图1是本发明实施例一提供的检测癌症标志物的信号翻转型光电化学传感器的制备流程图。
18.图2是本发明实施例一提供的生物传感器采用的二氧化钛多面体的表征图。
19.其中，该图中的图a是mil-125的扫描电镜图。图b二氧化钛多面体的扫描电镜图。图c为mil-125（a）和二氧化钛多面体（b）的x射线衍射谱图。图d为二氧化钛多面体的钛 2p x射线光电子能谱图。图e为二氧化钛多面体的氧 1s x射线光电子能谱图。图f为mil-125的氮气等温吸脱附曲线图。图g为二氧化钛多面体的氮气等温吸脱附曲线图。图h为二氧化钛多面体的紫外-可见-近红外吸收光谱图。
20.图3是本发明实施例1提供的生物传感器采用的氮化碳量子点的表征图。
21.其中，该图中的图a为氮化碳量子点的透射电镜图。图b为氮化碳量子点的x射线衍射谱图。图c为氮化碳量子点的紫外-可见吸收光谱图。图d为二氧化钛多面体（a）和氮化碳量子点（b）的zeta电位图。
22.图4是本发明实施例1提供的生物传感器的机理验证图。
ggt ata ttt；支持dna探针（support dna）：nh
2-(ch2)
6-ttt tat acc gtc tcg cac act ttc gct act ctg ttt；单链辅助dna探针：aaa cag agt agc gaa agt gtg。
38.本发明实施例采用的实验仪器：所有水溶液均使用来自milli-q过滤系统（milliporecorp., usa）的超纯水制备。使用ds5紫外-可见分光光度计（ds5，英国）测试紫外-可见光谱。透射电子显微照片图像由jeol jem 2100f（日本）表征。
39.x射线衍射是在x射线衍射仪（bruker d8 advance）上使用单色化cu kα辐射获得的。x射线光电子能谱是在多功能成像电子光谱仪（thermo escalab 250 xi）上获得的。
40.装有420 nm截止滤光片的氙灯（pls-sxe 300）用作光源(波长》 420 nm)，光电化学和电化学阻抗谱测量是由带有氧化铟锡电极的chi 660e电化学工作站完成的（直径5.6 mm）作为工作电极，饱和甘汞电极（sce）作为参比电极，铂丝作为对电极。eis测量在5 mm (1:1) [fe(cn)6]
3-/4-溶液中进行，该溶液含有0.1m kcl，频率范围为0.1 hz至100 khz，振幅为5 mv。本发明实施例采用的电化学和光电化学测试均使用三电极体系：直径为5.6 mm的氧化铟锡（珠海凯为光电科技有限公司）导电玻璃为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极。
[0041]
实施例1请参阅图1，本发明实施例一提供一种检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器，该传感器主要由以下步骤制得，该制备步骤包括制备氧化铟锡/二氧化钛电极、制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极、制备共轭物ab
1-fe3o4@au-dna、制备共轭物ab
2-aunps-dna、构建中间探针和制备传感器等步骤。
[0042]
一、制备氧化铟锡/二氧化钛电极将如图2a所示的金属有机框架材料mil-125在380℃管式炉中碳化4 h衍生得到如图2b所示的二氧化钛多面体；将该二氧化钛多面体分散于超纯水中，制得浓度为1 mg/ml二氧化钛多面体悬浮液；将25 μl、1 mg/ml所述二氧化钛多面体悬浮液滴加在清洗干净的氧化铟锡工作电极上，制得氧化铟锡/二氧化钛电极。
[0043]
从图2a可以看出，mil-125多面体具有类似饼状结构，平均尺寸约为600 nm，深度约为280 nm。将其在空气中碳化后，得到图2b所示的二氧化钛多面体并保持了相似的形貌，但二氧化钛多面体的平均尺寸减小。图2c所示的x粉末射线衍射图进一步证实了二氧化钛多面体的成功制备。从图2c可以看出，曲线a显示mil-125多面体的所有衍射峰；其碳化后，mil-125多面体的衍射峰完全消失，如曲线b所示，对应于二氧化钛锐钛矿相结构（jcpds no. 73-1764）的晶面，说明成功合成了锐钛矿型二氧化钛。
[0044]
采用x射线光电子能谱分析二氧化钛多面体的元素组成和化学态。从图2d可以得到，钛 2p谱归因于钛（iv）的钛 2p
3/2
和ti 2p
1/2
，其中结合能分别为458.8和464.7 ev。图2e所示的o 1s谱在530.02、531.4和532.8 ev处可以解褶成三个峰，分别对应金属氧化物ti-o、部分c=o或c-o和-o-h。表明存在ti-o-c键和-cooh基团。为了进一步探索二氧化钛多面体的比表面积和多孔结构，进行氮气吸脱附等温线测试，结果如图2e和2f所示，二氧化钛多面体的bet比表面积计算为102.3 m2/g。
[0045]
另外，图2f插图中的bjh孔径分布曲线表明二氧化钛多面体的平均孔径为5.1 nm，有利于小分子的快速传质和吸附。具有高比表面积、多孔结构的二氧化钛多面体，可能具有
良好的光电化学性质，并能够提供足够的活性位点。图2h显示了二氧化钛多面体的紫外-可见-近红外吸收光谱，二氧化钛多面体的最大吸收带大约出现在580 nm处，比常规二氧化钛纳米材料（380 nm）相比，明显红移，大致归因于其多孔结构。二氧化钛多面体的可见吸收明显增强，吸收范围广，表明它们在可见光（波长 》 420 nm）照射下适合作为光电活性材料，有利于光电化学生物传感器的构建。
[0046]
二、制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极将10 μm单链辅助dna探针在95 ℃退火5 min，并待冷却至室温后，取20 μl退火后的单链辅助dna探针滴加到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面，利用该氧化铟锡/二氧化钛电极表面中的二氧化钛多面体的多孔结构和静电吸附作用结合单链辅助探针，使单链辅助dna探针吸附到所述氧化铟锡/二氧化钛电极表面上，以封闭二氧化钛多面体上的活性位点，吸附30～120 min后，清洗得到氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极。
[0047]
三、制备ab
1-fe3o4@au-dna共轭物fe3o4纳米颗粒：取0.6 g 六水合氯化铁溶解于20 ml乙二醇中，形成澄清溶液，再加入1.5 g醋酸钠，大力搅拌30 min，然后转移至50 ml反应釜中并置于200 ℃，8 h.冷却至室温后，用无水乙醇和超纯水多次清洗磁分离收集固体并进行冷冻干燥得到棕黑色粉末fe3o4纳米颗粒。
[0048]
au纳米颗粒：首先将150 ml 1 mm haucl4加热至暴沸，再迅速向其中加入15 ml 38.8 mm柠檬酸钠溶液，剧烈搅拌10 min后，将烧瓶置于冰水浴中迅速终止反应，将溶液收集并置于4℃备用，得到au纳米颗粒。
[0049]
fe3o4@au溶液的制备：取30 mg上述fe3o
4 纳米颗粒和1 ml 97% 3-氨丙基三乙氧基硅烷分散于20 ml无水乙醇中，超声5 min，室温下震荡6 h。通过磁分离并重新分散于15 ml超纯水中得到1.5 mg/ml氨基化的fe3o4纳米颗粒，取1 ml上述溶液，加10 ml上述制备的au纳米颗粒和1 ml 超纯水，振摇3 h使氨基化的fe3o4纳米磁珠和au纳米颗粒通过共价键结合，磁分离后得到fe3o4@au颗粒，将其分散于1 ml 水得到fe3o4@au溶液。
[0050]
ab
1-fe3o4@au-dna的制备：取30 μl ab1加入到1 ml所述fe3o4@au溶液中，室温反应1 h，再加入100 μl支持dna探针(10 μm)，室温振摇12 h使得ab1、所述支持dna探针和所述fe3o4@au颗粒通过共价键结合形成ab
1-fe3o4@au-dna共轭复合物。通过磁分离后，将得到的ab
1-fe3o4@au-dna共轭复合物重新分散于pbs缓冲溶液中获得ab
1-fe3o4@au-dna共轭物溶液，存储备用。
[0051]
四、制备ab
2-aunps-dna共轭物向1 ml上述制备的au纳米金颗粒中加入30 μl 碳酸钠溶液加入至使溶液ph在8～9范围内，然后加入30 μl ab2，室温反应1 h，之后再加入10 μl 步行dna探针和100 μl 支持dna探针形成混合溶液，将该混合溶液置于4 ℃、反应18 h，使ab2、支持dna探针和步行dna探针通过共价键与金纳米颗粒结合形成ab
2-aunps-dna共轭复合物。最后通过15000 rpm、30 min、4 ℃离心处理以去除未结合的核酸链和抗体，再分散于含1%牛血清白蛋白的pbs缓冲液（含1%牛血清白蛋白和1％ 聚乙二醇20000的pbs缓冲溶液）中获得ab
2-aunps-dna共轭物溶液，并于4 ℃避光保存。
[0052]
五、制备中间探针向100 μl 所述ab
1-fe3o4@au-dna共轭物溶液中加入10 μl目标物scd146，37 ℃下
反应90min后，磁分离清洗去除未结合的目标物并加入100μl所述ab
2-aunps-dna共轭物溶液，37℃振摇90min，再次磁分离并分散于100μlpbs溶液。然后加入5u限制性核酸内切酶nt.bsmal，37℃反应2h，通过磁分离后取其上清液，该上清液中含有靶向诱导三维双支持dna步行器循环信号放大反应的中间探针。
[0053]
六、制备传感器该制备传感器的步骤包括：制备氮化碳量子点、制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极以及制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点复合电极。
[0054]
5.1所述制备氮化碳量子点的步骤包括：采用微波一步法合成氮化碳量子点，取0.5g柠檬酸和0.5g尿素溶解于25ml超纯水中，中高火微波7min，观察到由无色液体变成深棕色固体形成氮化碳量子点，待冷却至室温后，加入5ml超纯水溶解得到深棕色溶液，10000rpm离心5min后取其上清液，获得氮化碳量子点溶液，4℃保存备用。
[0055]
该步骤制备的氮化碳量子点采用透射电镜表征其形貌和尺寸，如图3a所示，从图3a中可以观察到氮化碳量子点呈准球形，均匀地分散；分析该图3a中的插图中高分辨透射图像其面间距约为0.32nm，这对应于出六边形g-c3n4的（002）面晶格面，如此表明该步骤成功制备了氮化碳量子点。
[0056]
图3b测试了氮化碳量子点的x射线衍射谱，氮化碳量子点的2θ值在27.1
°
处出现明显的特征峰，该特征峰是（002）晶面上的共轭芳香环堆积。另外，图3c进一步表征了氮化碳量子点的紫外-可见光谱，观察到其在345nm有明显的吸收峰，同时在445nm左右有一个肩峰存在，这与现有文献报道基本一致。
[0057]
此外，从zeta电位分析图3d中可以看出：二氧化钛多面体表面带正电，电位约为+23.3mv；而氮化碳量子点则带负电，约-19.5mv；如此进一步说明二氧化钛多面体和氮化碳量子点之间能够通过静电吸附作用结合。
[0058]
5.2所述制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极的步骤包括：将含有所述含有靶向诱导三维双支持dna步行器循环信号放大反应的中间探针的上清液滴加到所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极上，室温孵育90min使所述中间探针与所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极上的单链辅助dna探针特异性结合，迫使单链辅助dna探针从二氧化钛多面体上释放出来，暴露出二氧化钛多面体上的活性位点，得到具有二氧化钛多面体活性位点的氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极。
[0059]
5.3所述制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点复合电极的步骤包括：清洗所述氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极；将上述采用微波一步法制得的氮化碳量子点溶液稀释10倍，获得稀释氮化碳量子点溶液；向清洗后的氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极上滴加20μl所述稀释氮化碳量子点溶液室温吸附孵育60min使氮化碳量子点通过二氧化钛多面体的多孔结构和静电吸附作用修饰在二氧化钛多面体表面上，形成氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点复合电极，从而制备出直接接触式信号翻转型传感器。
[0060]
（1）直接接触式信号翻转型传感器机理研究1）光电流信号检测的试验条件及方法分别将制备的二氧化钛多面体、氮化碳量子点溶液直接滴加在氧化铟锡电极上，
过夜干燥得到氧化铟锡/二氧化钛电极、氧化铟锡/氮化碳量子点电极；另外，将氮化碳量子点溶液滴加在氧化铟锡/二氧化钛电极上，孵育30～120min后得到氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合电极。然后利用电化学工作站三电极体系，将制备的电极置于含0.1m抗坏血酸的tril-hcl缓冲溶液（ph7.4，0.1m）测试i-t曲线得到光电流信号。结果如图4a所示。
[0061]
从图4a中可以看出：曲线a显示的氧化铟锡/二氧化钛电极的阳极光电流信号为2.124μa，曲线b显示氧化铟锡/氮化碳量子点电极显示出相对微弱的阳极光电流信号。从曲线c中可以看出：氧化铟锡/二氧化钛电极与氮化碳量子点孵育后，形成的氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合修饰电极不仅产生了一个比较大的阴极光电流-3.579μa，而且与曲线a显示的氧化铟锡/二氧化钛电极光电流方向相反。如此表明当氮化碳电子点与二氧化钛多面体直接接触时，氮化碳电子点可以作为信号翻转剂，实现光电流方向的转换。
[0062]
2）莫特-肖特基曲线测试条件及方法利用电化学工作站三电极体系，分别将制备的氧化铟锡/二氧化钛电极、氧化铟锡/氮化碳量子点电极、氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点电极置于tril-hcl缓冲溶液（ph7.4，0.1m）na2so4溶液(ph6.8，0.2m)中测试阻抗-电压曲线，然后换算得到莫特-肖特基曲线。结果如图4b～4d所示。
[0063]
从图4b和图4c中可以看出：氧化铟锡/氮化碳电子点电极和氧化铟锡/二氧化钛电极均呈现正斜率，对应于n型半导体特性，而氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合电极呈现负斜率，对应于p型半导体，该结果与图4a所示的光电流信号研究结果一致。
[0064]
3）tauc图对应的测试条件及方法利用ds5紫外-可见分光光度计（ds5，英国）分别测试二氧化钛多面体溶液、氮化碳量子点溶液的紫外-可见光谱，然后换算得到tauc图。结果如图4e和图4f所示。
[0065]
请参阅图4e，合成的二氧化钛多面体具有2.52ev的禁带，其导电带与价带相对于普通氢电极（nhe）分别为-0.73v和1.79v。从图4f显示氮化碳量子点具有2.55ev的禁带，其导电带与价带相对于普通氢电极nhe分别为-0.18v和2.37v。
[0066]
所以，从图4中可以得出本发明的光电流方向翻转机制为：在可见光（波长大于420nm）照射下，二氧化钛多面体被激发，光生电子/空穴分别在导带/价带上形成。随后，光生电子从二氧化钛多面体的导带-0.73v转移到氧化铟锡电极上，同时，抗坏血酸作为电子供体氧化电位0.15v，位于二氧化钛的导带和价带之间，可以被二氧化钛的光生空穴氧化，导致更多的光生电子占据二氧化钛多面体的导带，并转移至氧化铟锡电极上，产生较大的阳极光电流。
[0067]
当氮化碳量子吸附二氧化钛多面体修饰到氧化铟锡电极上形成氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合修饰电极时，二氧化钛多面体和氮化碳量子点均容易被激发，并分别在导带/价带上形成相应的光生电子/空穴，基于能级水平匹配，二氧化钛多面体导带-0.73v的光生电子转移到氮化碳量子的导带-0.18v，用于电化学还原电解液中的氧气，其中氧气的还原电位-0.046v作为电子受体；氮化碳量子点的价带2.37v的光生空穴转移到二氧化钛多面体的导带1.79v。此外，伴随着氮化碳量子点导带的部分光生电子返回到价带，导致光生电子/空穴对的复合。在这个过程中，抗坏血酸有效地氧化清除导带上的空穴，抑制光生电子/空穴对的复合，促进光生电子的转移，从而增强氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合修饰电极的阴极光电流。因此，基于氮化碳量子点和二氧化钛多面体之间优异的匹配水平能带，形成二氧化钛多面体//氮化碳量子点光电流方向翻转体系，氮化碳量子点可
促进二氧化钛多面体光生电子/空穴的分离和转移，诱导二氧化钛多面体的光电流方向翻转。
[0068]
（2）光电化学生物传感器的表征试验条件：在-0.2 v偏压下，分别以本发明实施例中采用的氧化铟锡/二氧化钛电极、氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极、氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极、氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点电极作为电极，置于含0.1 m 抗坏血酸的tril-hcl缓冲溶液（ph 7.4，0.1 m）中进行光电化学测试，置于5 mm (1:1) [fe(cn)6]
3-/4-溶液中（该溶液含有0.1 m kcl，频率范围为0.1 hz至100 khz，振幅为5 mv）进行阻抗测试。测试结果如图5所示。
[0069]
由于抗坏血酸的消耗，光电流随着光照时间的增加而衰减。因此，本发明通过使用不同修饰电极产生的最大光电流值来显示光电化学测试结果。从图5a中可以看出：曲线a所示的氧化铟锡/二氧化钛电极有一个明显的阳极光电流2.124 μa。曲线b显示经过单链辅助dna探针修饰形成的氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极的光电流减弱，其值为1.010 μa，这是由于该电极表面吸附的单链辅助dna探针差导电性，阻碍了光生电子的产生，从而减弱阳极光电流信号。
[0070]
曲线c显示：当单链辅助dna探针与中间探针结合形成双链后，电极表面的单链辅助dna探针含量减少，所以，氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极的阳极光电流信号部分恢复（1.304 μa）。曲线d显示：当滴加氮化碳量子点溶液孵育后，由于氮化碳量子点的引入，由于二氧化钛多面体与氮化碳量子点之间的能级关系，使光电信号极性发生转换，所以，氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点复合电极形成了一个较大的阴极光电流，-2.987 μa。
[0071]
从图5b可以看出：曲线a显示氧化铟锡/二氧化钛电极的r
ct
值为35.73 ω；由于核酸链的差导电性，单链辅助dna探针在氧化铟锡/二氧化钛电极表面的固定有效地阻碍[fe(cn)6]3−
/4
−
离子和电极之间的电子转移过程，导致电荷转移的电阻增强，所以，曲线b显示氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极的r
ct
值为69.86 ω；当氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极与酶切释放的核酸链中间探针孵化，单链辅助探针和中间探针因碱基配对关系形成双链，然后被冲洗掉，所以，曲线c显示氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极得到一个减少的r
ct
值62.24 ω；当将氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极浸入在氮化碳量子点溶液中孵育时，由于电极上的单链辅助探针与中间探针结合后，二氧化钛多面体上的活性位点释放出来，使氮化碳量子点可以利用二氧化钛多面体的孔径和静电吸附作用直接固定到电极上，促进电子的转移，所以，曲线d显示氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点电极得到一个减小的r
ct
值55.88 ω。各个修饰电极r
ct
值的预期变化基本与图5a所示的研究结果相一致，表明用检测癌症标志物的光电化学生物传感器已成功制备。
[0072]
本发明实施例提供的检测癌症标志物的信号翻转型光电化学生物传感器影响其光电流信号的主要因素有两个：一个是制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极步骤中的单链辅助探针的吸附时间，另一个是制备传感器步骤中氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点电极制备过程中的氮化碳量子点的吸附时间。下面就该两个因素做进一步分析。
[0073]
单链辅助探针吸附时间的影响
实验条件：基本上参照上述实施例一提供的方法根据单链辅助探针吸附时间的不同制备出对应的传感器，其中，“制备氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极”步骤中，单链辅助探针吸附时间分别为0、30、60、90、120 min，“制备传感器”步骤中氮化碳量子点的吸附时间为60 min，其它步骤与实施例一相同。利用制备出的上述传感器参照前述“（2）光电化学生物传感器的表征”部分的实验条件进行光电化学测试，测试结果如图6所示。
[0074]
从图6中可以看出：在单链辅助dna探针吸附时间为0～90 min时，氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极的光电响应逐渐减弱，这可能是由于单链辅助dna探针吸附反应时间越长，固定在电极上的单链辅助dna探针也就越多，从而对二氧化钛多面体上光生电子-空穴的产生和转移的阻碍增强，但实验发现，在吸附时间超过90 min之后，光电响应减弱的趋势渐趋于平缓，如此说明氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针电极上可固定的单链辅助探针量已经基本达到饱和，因此，优选90 min作为单链辅助dna探针在氧化铟锡/二氧化钛电极上的吸附反应时间。
[0075]
氮化碳量子点吸附时间的影响实验条件：“制备传感器”步骤中氮化碳量子点的吸附时间为0、30、60、90、120 min。实验结构如图7所示。
[0076]
从图7中可以看出：在氮化碳量子点吸附时间为0～60 min时，氧化铟锡/二氧化钛/氮化碳量子点复合电极产生的阴极光电流随着氮化碳量子点吸附时间的延长而增大，且在60 min之后电流响应变化几乎趋于平缓。因此，优选60 min作为氮化碳量子点在氧化铟锡/二氧化钛电极上的最佳吸附时间。
[0077]
实施例2本实施例提供一种实施例1提供的检测癌症标志物的生物传感器在检测癌症标志物方面的应用。
[0078]
具体地，实施例1提供的上述生物传感器在制备过程中，单链辅助探针在氧化铟锡/二氧化钛电极上的吸附反应时间为90 min，氮化碳量子点在氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针电极上的吸附时间为60 min；将所述生物传感器置于0.1 m 抗坏血酸的tril-hcl缓冲溶液（ph 7.4，0.1 m）中，施加-0.2 v偏压，进行光电化学测试，检测出scd146分别在10、100、200、1000、10000、50000、100000、1000000和5000000 fg/ml浓度下的光电流信号；依据检测结果构建scd146的浓度和光电流信号之间的线性方程，如图8所示。
[0079]
从图8中可以看出：随着scd146浓度从10增加到5000000 fg/ml，氧化铟锡/二氧化钛/单链辅助探针/中间探针/氮化碳量子点电极出现极性翻转产生的阴极光电流增加，并与scd146浓度从10-5000000 fg/ml浓度范围内具有良好的线性，线性回归方程是i=-174.34logc
scd146-1314.00 (r2=0.9977)；其中，i是利用所述检测癌症标志物的生物传感器检测出的光电流信号，c
scd146
代表scd146的浓度。
[0080]
检测限实验方法或条件利用制备的传感器检测10次空白溶液的光电流信号，基于检测限=3σ/s（式中σ为空白样品的标准偏差；s为校正曲线的斜率）计算检测限。计算出scd146浓度的检测下限为2.1 fg/ml。
[0081]
选择性实验本发明实施例选择血清中的psa和cea作为scd146选择性实验的干扰蛋白。利用制
备的传感器分别测试干扰蛋白溶液的光电流信号，测试结果如图9所示。
[0082]
从图9中可以看出：干扰蛋白psa和cea溶液引起的光电流响应与空白溶液产生相同的光电流方向，且电流响应值大小相近。然而，实验发现在上述干扰蛋白分别与目标物同样以浓度比100:1混合时，即c
pas : c
scd146
为500 ng/ml:5 ng/ml、c
cea : c
scd146
为500 ng/ml:5 ng/ml；均产生了与目标物scd146相同方向和相近大小的光电流响应，如此表明本发明实施例提供的利用上述检测癌症标志物的生物传感器检测scd146的方法具有良好的选择性。
[0083]
重现性实验在相同实验条件下分别制备五组生物传感器，对200 fg/ml scd146溶液进行检测，得到光电流信号，并计算五组光电流的相对标准偏差。
[0084]
在相同实验条件下分别制备五组生物传感器，并检测200 fg/ml scd146溶液，得到五组光电流信号，计算其相对标准偏差为2.7%。
[0085]
稳定性实验
[0086]
本发明实施例提供的生物传感器在4℃冰箱中分别放置7、14和21天后， 依次对10000fg/ml的scd146溶液进行测试，得到光电流信号。测试结果如 图9所示。实验结果如图9所示，该生物传感器的光电流可在3周内保持初始信号 的99.7％。
[0087]
所以，本发明实施例提供的信号翻转型传感器在scd146检测中的应用具有如下优点：1）超灵敏度：本发明实施例将直接接触式光电流方向翻转策略、靶向诱导三维双支持dna步行器循环信号放大技术以及金属有机框架材料吸附特性等有机结合起来，不仅放大了光电流信号的读出，而且加快了翻转材料之间的电子传递路径，提高光电流方向翻转效能，使得传感器的检测更为准确，提高检测灵敏度。在最优实验条件下，实验得出传感器的线性范围为10-5000000 fg/ml，检出限低至2.1 fg/ml。
[0088]
2）高选择性：本发明实施例基于光电流方向翻转策略研发的传感器只有在目标识别时，才能产生一个方向相反的光电流信号；不同干扰蛋白对本检测体系均无明显的干扰。
[0089]
3）好重现性：在相同实验条件下分别制备五组生物传感器，检测200 fg/ml scd146，其相对标准偏差为2.7 %。
[0090]
4）高稳定性：本发明实施例提供的生物传感器在4℃冰箱中分别放置7、14和21天后，对scd146检测的光电流约仍保持其初始光电流响应的99%。
[0091]
因此，本发明实施例提供的检测癌症标志物的光电化学生物传感器整合光电流方向翻转策略、三维双支持dna步行器循环放大技术以及金属有机框架材料吸附特性，进行直接接触式光电流信号翻转设计，发展一种低成本、高选择性、超灵敏检测scd146的环保型光电化学新方法，提高光电流方向翻转效能，解决常规光电化学生物传感器受干扰物和灵敏度限制而不能准确超灵敏检测scd146的问题，为scd146的分析研究提供新型的技术策略，促进癌症的早期诊断和预后评估。
[0092]
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。