一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶-7活性的方法

1.本发明属于酶检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶-7活性的方法。


背景技术：

2.基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,mmps)是一类由细胞分泌的锌离子依赖性内肽酶的总称，能够降解细胞外基质蛋白和基底膜的主要成分，从而参与一系列重要的生理和病理过程。mmps在调节细胞黏附、胚胎发育、骨重建和创伤修复等生理过程起着重要作用。目前已经发现了二十多种人源mmps，其中mmp-7是一种最小的mmps，在正常生理条件下表达水平很低，开发mmp-7活性的检测方法具有重要意义。
3.荧光分析法具有灵敏度高、操作简便、检测快速、选择性好等优势，在生物分析中具有广泛应用。常用的荧光物质主要包括有机荧光探针(罗丹明类、花菁类等)和纳米荧光探针(量子点、贵金属纳米簇等)。虽然荧光检测具有很多优点，但容易受外部环境、光漂白、探针负载和留存等因素的影响，而降低结果的精确性。比率荧光法的出现正好克服了这一缺点，它是以两个不同波长处的荧光强度的比值作为响应信号来对检测物进行定量，不受光源强度和仪器灵敏度的影响，有利于提高检测的灵敏度和动态范围。因而，构建比率型荧光探针用于mmp-7活性的检测表现出巨大潜力。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶-7活性的方法，该探针能够有效对金属蛋白酶-7(mmp-7)活性进行检测。
5.本发明首先提供一种比率型荧光纳米探针的制备方法，包括：
6.步骤一：通过溶剂热法制备mnfe2o4纳米粒子；
7.步骤二：将步骤一的mnfe2o4纳米粒子与dib-peg-nh2混合搅拌后得到氨基聚乙烯乙二醇包裹的铁酸锰纳米粒子mnfe2o
4-peg-nh2；
8.步骤三：将fitc-pep和rhb-pep混合后加入nhs和edc活化，再加入步骤二得到的mnfe2o
4-peg-nh2搅拌，得到比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes。
9.优选的是，所述的步骤一mnfe2o4纳米粒子尺寸为18～22nm。
10.优选的是，所述的步骤二中mnfe2o4纳米粒子与dib-peg-nh2的质量比为1:1。
11.优选的是，所述的步骤二的混合搅拌温度为20～25℃，时间为4h。
12.优选的是，所述的fitc-pep、rhb-pep、mnfe2o
4-peg-nh2的质量比为0.25～4:1:20，nhs和edc的浓度分别为5mmol l-1
和2mmol l-1
。
13.优选的是，所述的fitc-pep序列为fitc-gly-asn-gly-arg-gly-lys-gly-lys-val-pro-leu-ser-leu-thr-met-gly-cys，rhb-pep序列为rhodamine b-gly-asn-gly-arg-gly-lys-gly-cys。
14.优选的是，所述的步骤三的活化温度为20～25℃，时间为2h。
15.优选的是，所述的步骤三的搅拌温度为20～25℃，时间为24h。
16.本发明还提供上述制备方法得到的比率型荧光纳米探针。
17.本发明提供一种基于上述比率型荧光纳米探针定量检测mmp-7活性的方法，其包括如下步骤：
18.将比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes与不同浓度的mmp-7在37℃
19.下共同孵育，所述的孵育时间为100～150min，进行荧光光谱测试，分别在激发波长为490nm和550nm条件下，测试fitc和rhb的荧光光谱；通过计算得到mmp-7浓度和i
fitc
/i
rhb
的关系式，如下：
20.i
fitc
/i
rhb
＝0.0459c-0.0174；
21.式中：c为mmp-7浓度，单位为nmol/l，i
fitc
为测试样在490nm处的
22.荧光强度值，i
rhb
为测试样在550nm处的荧光强度值，线性相关系数为0.998。
23.本发明的有益效果
24.本发明提供一种比率型荧光纳米探针、制备方法及定量检测基质金属蛋白酶-7活性的方法，采用溶剂热法制备mnfe2o4纳米粒子，再在其表面包裹上一层氨基修饰聚乙烯乙二醇，将其从疏水性转变成亲水性，用于底物多肽fitc-pep和靶向多肽rhb-pep的连接，将mmp-7的底物多肽(fitc-pep)和靶向多肽(rhb-pep)末端的羧基活化后，通过与mnfe2o
4-peg-nh2的氨基发生席夫碱反应，从而连接到纳米粒子表面，得到比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes，由于mnfe2o4的吸收光谱和fitc的荧光发射光谱发生重叠，而与rhb的荧光发射光谱重叠较少，导致fitc的荧光被淬灭，rhb的荧光几乎不受影响。当底物多肽fitc-pep被mmp-7剪切后，fitc从纳米粒子表面脱离，导致其荧光恢复。根据fitc和rhb的荧光强度比值(i
fitc
/i
rhb
)随mmp-7浓度的变化关系即可实现对mmp-7活性的检测。
25.本发明采用比率型荧光纳米探针，能有效消除激发功率密度、激发光路长度和光漂白等因素的干扰，提高检测的准确度；另外，本发明mmp-7检测方法简单，只需将荧光纳米探针与待测样品混合孵育即可测定，具有较强的应用性。
附图说明
26.图1为本发明方法的原理示意图。
27.图2为本发明实施例1制备的mnfe2o4纳米粒子的透射电镜照片。
28.图3为本发明实施例1制备的mnfe2o4纳米粒子的紫外可见吸收光谱图和fitc及rhb的荧光光谱图。
29.图4为本发明实施例3中采用不同比例的fitc-pep和rhb-pep制备的mnfe2o
4-pep-dyes，用于mmp-7检测得到的i
fitc
/i
rhb
与fitc-pep和rhb-pep比值的关系图。
30.图5为本发明实施例4中制备的不同浓度mnfe2o
4-pep-dyes，用于mmp-7检测得到的i
fitc
/i
rhb
与mnfe2o
4-pep-dyes浓度的关系图。
31.图6为本发明实施例5中mnfe2o
4-pep-dyes与mmp-7孵育不同时间后检测得到的i
fitc
/i
rhb
与时间的关系图。
32.图7为本发明实施例6中mnfe2o
4-pep-dyes与不同浓度mmp-7孵育120min后的fitc(a)和rhb(b)的荧光光谱图及i
fitc
/i
rhb
与mmp-7浓度的关系曲线图(c)。
33.图8为本发明实施例7中mnfe2o
4-pep-dyes分别与trypsin、caspase-3、caspase-9、bsa、mmp-9、mmp-2、mmp-7孵育120min后的fitc(a)和rhb(b)的荧光光谱图及i
fitc
/i
rhb
与mmp-7浓度的关系曲线图(c)。
具体实施方式
34.本发明首先提供一种比率型荧光纳米探针的制备方法，包括：
35.步骤一：通过溶剂热法制备mnfe2o4纳米粒子；具体优选包括：
36.将fecl3、mncl2和油酸钠溶解在乙醇、h2o和己烷的混合物中，在60℃加热回流4h除去水相，再加热至70℃反应2h后，将混合物在真空条件下加热至110℃后反应2h以除去残留溶剂，得到粘性金属油酸盐前体mnfe2(c
18h33
o2)8；所述的fecl3、mncl2和油酸钠的摩尔比优选为2:1:8；乙醇、h2o和己烷的体积比优选为1:1:2；
37.取上述mnfe2(c
18h33
o2)8和oa(油酸)溶解在1-ode(1-十八烯)中并抽真空30min，在氩气保护下将溶液加热至200℃，然后以1℃min-1
的速率加热至330℃，并在此温度下反应1h，加入异丙醇，离心收集沉淀，得到mnfe2o4纳米粒子。所述的mnfe2(c
18h33
o2)8和oa的摩尔比优选为2:1；所述的得到的mnfe2o4纳米粒子尺寸为18～22nm。
38.步骤二：将步骤一的mnfe2o4纳米粒子与dib-peg-nh2在溶剂中混合搅拌后得到氨基聚乙烯乙二醇包裹的铁酸锰纳米粒子mnfe2o
4-peg-nh2；所述的的mnfe2o4纳米粒子与dib-peg-nh2的质量比优选为1:1，所述的的混合搅拌温度优选为20～25℃，时间优选为4h，溶剂优选为chcl3；
39.步骤三：将fitc-pep和rhb-pep混合后加入nhs和edc活化，所述的活化温度优选为20～25℃，时间优选为2h，再加入步骤二得到的mnfe2o
4-peg-nh2搅拌，所述的搅拌温度优选为20～25℃，时间优选为24h，得到比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes。所述的fitc-pep、rhb-pep、mnfe2o
4-peg-nh2的质量比优选为0.25～4:1:20，更优选为3:1:20nhs和edc的浓度分别优选为5mmol l-1
和2mmol l-1
。
40.按照本发明，所述的fitc-pep序列为fitc-gly-asn-gly-arg-gly-lys-gly-lys-val-pro-leu-ser-leu-thr-met-gly-cys，rhb-pep序列为rhodamine b-gly-asn-gly-arg-gly-lys-gly-cys。
41.所述的fitc-pep和rhb-pep是根据文献获得mmp-7的特异性识别位点氨基酸序列val-pro-leu-ser-leu-thr-met-gly(chem.eur.j.2012,18,7189-7195)和靶向氨基酸序列asn-gly-arg(anti-cancer agents in medicinal chemistry,2018,18,74-86)，为了便于连接到纳米粒子表面以及后期酶的剪切，在序列两端分别增加几个氨基酸，将设计好的多肽序列送至生物公司合成。
42.本发明还提供上述制备方法得到的比率型荧光纳米探针。
43.本发明提供一种基于上述比率型荧光纳米探针定量检测mmp-7活性的方法，其包括如下步骤：
44.将比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes与不同浓度的mmp-7在37℃
45.下共同孵育，所述的mmp-7的浓度有优选为25-150μg ml-1
，优选为100μgml-1
，所述的孵育时间为100～150min，优选为120min，进行荧光光谱测试，分别在激发波长为490nm和550nm条件下，测试fitc和rhb的荧光光谱；通过计算得到mmp-7浓度和i
fitc
/i
rhb
的关系式，
如下：
46.i
fitc
/i
rhb
＝0.0459c-0.0174；
47.式中：c为mmp-7浓度，单位为nmol/l，i
fitc
为测试样在490nm处的荧光强度值，i
rhb
为测试样在550nm处的荧光强度值，线性相关系数为0.998。
48.本发明的检测原理如图1所示：采用溶剂热法制备mnfe2o4纳米粒子，再在其表面包裹上一层氨基修饰聚乙烯乙二醇，用于底物多肽fitc-pep和靶向多肽rhb-pep的连接，得到比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes，由于mnfe2o4的吸收光谱和fitc的荧光发射光谱发生重叠，而与rhb的荧光发射光谱重叠较少，导致fitc的荧光被淬灭，rhb的荧光几乎不受影响。当底物多肽fitc-pep被mmp-7剪切后，fitc从纳米粒子表面脱离，导致其荧光恢复。根据fitc和rhb的荧光强度比值(i
fitc
/i
rhb
)随mmp-7浓度的变化关系即可实现对mmp-7活性的检测。
49.以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
50.本发明中所设计的缩写及术语解释：mmp：基质金属蛋白酶，oa：油酸，1-ode：1-十八烯，dib-peg-nh2：3,4-二羟基苄胺-聚乙烯乙二醇-氨基，edc：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，nhs：n-羟基硫代琥珀酰亚胺，mes：2-(n-吗啉)乙磺酸，pbs：磷酸盐缓冲液,apma：胶原酶潜酶活化剂，trypsin：胰蛋白酶，caspase：细胞凋亡酶，bsa：牛血清白蛋白。
51.实施例1
52.一种mnfe2o4纳米粒子的制备方法，具体包括如下步骤：
53.将4mmol fecl3、2mmol mncl2和16mmol油酸钠溶解在10ml乙醇、10ml h2o和20ml己烷的混合物中，在60℃加热回流4h除去水相，再加热至70℃反应2h后，将混合物在真空条件下加热至110℃后反应2h以除去残留溶剂，得到粘性金属油酸盐前体mnfe2(c
18h33
o2)8。取6mmol mnfe2(c
18h33
o2)8和3mmol oa溶解在12ml ode中并抽真空30min，在氩气保护下将溶液加热至200℃，然后以1℃ min-1
的速率加热至330℃，并在此温度下反应1h，加入45ml异丙醇，离心收集沉淀(6000rpm，10min)，得到mnfe2o4纳米粒子，最后分散在chcl3中备用。
54.对本实施例制备的mnfe2o4纳米粒子进行透射电镜表征和紫外可见吸收光谱表征。其中透射电镜图如图2所示，纳米粒子尺寸均一，分散性良好，平均粒径为20
±
1.5nm。紫外可见吸收光谱如图3所示，随着波长的增加，吸收强度逐渐减小，可以看出，吸收曲线和fitc的荧光发射光谱发生重叠，而与rhb的荧光发射光谱重叠较少，因而当他们靠近时导致fitc的荧光被淬灭，而rhb的荧光几乎不受影响。
55.实施例2
56.一种比率型荧光纳米探针mnfe2o
4-pep-dyes的制备方法，具体包括如下步骤：
57.(1)制备mnfe2o
4-peg-nh2：将实施例1制备的20mg mnfe2o4纳米粒子与20mg dib-peg-nh2在5ml chcl3中混合，室温下搅拌4h后离心(10000rpm，10min)，采用己烷和chcl3混合液洗涤沉淀后，产物重新分散于水中，得到mnfe2o
4-peg-nh2。
58.(2)制备mnfe2o
4-pep-dyes：
59.将fitc-pep和rhb-pep按质量比1:1混合于含5mmol l-1
nhs和2mmol l-1
edc的10ml 10mmol l-1
的mes中，孵育2h后加入10ml 1mg ml-1
mnfe2o
4-peg-nh2，室温搅拌24h后离心(10000rpm，10min)，沉淀分散在pbs(10mmol l-1
，ph7.4)中，4℃保存。
60.实施例3
61.一种优化mnfe2o
4-pep-dyes与mmp-7孵育时间的方法，具体包括如下步骤：
62.将10nmol l-1
mmp-7酶原在含1mmol l-1
apma的tcnb缓冲液(ph 7.5，50mmol l-1
tris，10mmol l-1
cacl2，150mmol l-1
nacl，0.05％brij-35)中在37℃激活1h，再与实施例2中制备的mnfe2o
4-pep-dyes(50μg ml-1
)在37℃下分别孵育不同时间(0，10，20，30，60，120，180min)后测定荧光光谱，并计算i
fitc
/i
rhb
，其中i
fitc
为测试样在490nm处的荧光强度值，i
rhb
为测试样在550nm处的荧光强度值，如图4所示，随着反应时间的延长，荧光强度比值逐渐增大，120min后基本达到稳定，从而确定最佳反应时间为120min。
63.实施例4
64.一种优化mnfe2o
4-pep-dyes中fitc-pep和rhb-pep使用比例的方法，具体包括如下步骤：
65.分别将不同质量比(1:4,1:2,1:1,2:1,3:1,4:1)的fitc-pep和rhb-pep混合后按实施例2的方法制备得到6种mnfe2o
4-pep-dyes。将10nmol l-1
mmp-7酶原在含1mmol l-1
apma的tcnb缓冲液(ph 7.5，50mmol l-1
tris，10mmol l-1
cacl2，150mmol l-1
nacl，0.05％brij-35)中在37℃激活1h，再分别与6种mnfe2o
4-pep-dyes混合于500μl pbs中在37℃下孵育120min后测定荧光光谱，并计算i
fitc
/i
rhb
，如图5所示，随着fitc-pep/rhb-pep的不断增加，i
fitc
/i
rhb
逐渐增大，当fitc-pep/rhb-pep大于3:1时，i
fitc
/i
rhb
不再变化，因此fitc-pep与rhb-pep的质量比优选为3:1。
66.实施例5
67.一种优化检测mmp-7时mnfe2o
4-pep-dyes浓度的方法，具体包括如下步骤：
68.按照实施例4中优选的质量比为3:1的fitc-pep和rhb-pep来制备mnfe2o
4-pep-dyes，将10nmol l-1
mmp-7酶原在含1mmol l-1
apma的tcnb缓冲液(ph 7.5，50mmol l-1
tris，10mmol l-1
cacl2，150mmol l-1
nacl，0.05％brij-35)中在37℃激活1h，再分别与不同浓度25,50,100,150μg ml-1
mnfe2o
4-pep-dyes在37℃下孵育120min后测定荧光光谱，并计算i
fitc
/i
rhb
，如图6所示，随着荧光探针浓度的增加，i
fitc
/i
rhb
逐渐增大，当其浓度大于100μg ml-1
时，i
fitc
/i
rhb
不再变化，因此mnfe2o
4-pep-dyes浓度优选为100μg ml-1
。
69.实施例6
70.一种mmp-7检测的方法，具体包括如下步骤：
71.首先将不同浓度mmp-7在含1mmol l-1
apma的tcnb缓冲液(ph 7.5，50mmol l-1
tris，10mmol l-1
cacl2，150mmol l-1
nacl，0.05％brij-35)中于37℃激活1h。再与实施例5中制备的100μg ml-1
mnfe2o
4-pep-dyes在500μlpbs中于37℃下孵育120min后测定荧光光谱，并计算i
fitc
/i
rhb
，如图7所示，随着mmp-7浓度的增加，fitc的荧光强度逐渐增大，而rhb的荧光强度几乎不变，i
fitc
/i
rhb
也逐渐增大，对其进行线性拟合后，函数关系式为：
72.i
fitc
/i
rhb
＝0.0459c-0.0174
73.式中：c为mmp-7的浓度，单位为nmol l-1
，i
fitc
为测试样在490nm处的荧光强度值，i
rhb
为测试样在550nm处的荧光强度值，线性相关系数为0.998。
74.实施例7
75.一种利用实施例5制备的mnfe2o
4-pep-dyes检测mmp-7时的选择性测试，具体包括如下步骤：
76.将100ng ml-1
trypsin、caspase-3、caspase-9、bsa、mmp-9、mmp-2和10nmol l-1
mmp-7分别与100μg ml-1
mnfe2o
4-pep-dyes在500μl pbs中于37℃下孵育120min后测定荧光光谱，并计算i
fitc
/i
rhb
，如图8所示，其他酶或bsa加入到体系中不会引起fitc荧光的恢复，即不会引起i
fitc
/i
rhb
的增大，只有mmp-7才能导致fitc荧光的恢复和i
fitc
/i
rhb
的增大，表明此方法具有较好的选择性。
77.以上对本发明的具体实施例进行了描述。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权力要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。