一种测定水体中叶绿素a含量的前处理方法与流程

1.本发明属于环境水生态监测技术领域，具体是涉及一种在运用分光光度法测定水体中叶绿素a含量时与之配合的水样前处理方法。


背景技术：

2.叶绿素是植物光合作用中重要的光合色素，它可以将阳光转变成能量，它存在于植物细胞内的叶绿体中，反射绿光并吸收红光和蓝光，使植物呈现绿色。叶绿素a是浮游植物或藻类植物中最丰富的色素，也是藻密度、藻种类等的重要指示因素，因此检测水体中的叶绿素a浓度是水生态监测的重要指标之一，也是反映水体富营养化程度的重要参数指标。
3.目前，国标采用的水体叶绿素a的测定方法主要有《水质叶绿素a的测定分光光度法》(hj 897-2017)，和《水和废水监测分析方法》(第四版)中分光光度法。两者的前处理方法均为丙酮研磨提取，但该前处理方法在实际操作过程中主要存在以下缺点：(1)研磨过程中丙酮溶剂易粘沾于研磨器壁，造成叶绿素a损失；(2)反复研磨提取，定容体积仅10ml，叶绿素a浓度高时易造成提取不完全；(3)丙酮溶剂体积浓度为90％，研磨过程中溶剂本身极易挥发，且长时间使用高浓度丙酮溶剂对实验操作人员身体具有一定危害；(4)研磨需要时间较长，过程中叶绿素a易发生光解。针对上述问题，现有技术中尚未见有很好地解决办法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种操作简便、快速、能充分提取水样中叶绿素a的前处理方法。
5.本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
6.一种测定水体中叶绿素a含量的前处理方法，采用以下步骤：
7.(1)取50～200ml水样，用0.45μm水系微孔滤膜进行抽滤，控制真空泵压力0.05mpa；
8.(2)将完成抽滤的滤膜折叠后装入10ml带盖密封离心管，置于-20℃环境下速冻20min，然后置于40℃～50℃水浴10min，再重复速冻与水浴过程1～3次；
9.(3)按1∶1的质量比配置丙酮-甲醇试剂，待用；
10.(4)打开完成步骤(2)处理的离心管的密封盖，加入5ml丙酮-甲醇试剂，盖上密封盖，置于离心管振荡器，转数240r/min，振荡15～20min，至滤膜完全溶解成絮状；
11.(5)将振荡完成后的离心管置于离心机，转数4000r/min，离心15～20min，收集上清液；
12.(6)向离心管中加入5ml丙酮-甲醇试剂，再次离心15～20min，收集上清液；
13.(7)合并步骤(5)和(6)所得上清液置于10ml比色管中，用丙酮-甲醇试剂定容后，作为待测样品备用。
14.所述的带盖密封离心管优选聚丙烯pp材质，承受温度范围为-80℃至120℃。
15.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
16.1、本发明能够有效提高前处理操作中叶绿素a的萃取程度，从而提升测定结果的准确度。
17.2、现有标准实验方法采用不易溶于有机溶剂的普通滤膜。本发明则采用0.45μm的水系微孔滤膜进行抽滤，该滤膜溶于有机试剂，在丙酮、甲醇等溶剂中的溶解效果好，能够提高叶绿素a的萃取完全程度。
18.3、采用带盖密封离心管，能够避免在振荡和离心过程中有机试剂的挥发和损失，提高叶绿素a的溶解率。
19.4、本发明采用速冻破壁，水浴溶出的方式。在反复速冻与水浴时，水样藻细胞中形成了冰晶，细胞剩余液体中盐浓度的增高可以使细胞破裂，引起叶绿素a的快速溶出，固定其含量。
20.5、丙酮属于《易制毒化学品管理条例》中第三类名录化学品，具有毒性，特别是对神经系统有麻醉作用，并对人体的黏膜有刺激作用。现有标准实验需要使用体积浓度90％丙酮溶液，本发明则采用丙酮∶甲醇(1∶1)试剂进行叶绿素a的提取，在保证检测结果准确可靠的基础上，能够有效降低丙酮试剂的使用量。
21.6、现有标准实验方法采用单个样品逐个研磨的方式。本发明的方法实现了批量化的样品前处理，极大地提高了操作效率，节省工作时间；同时，振荡方式能加快叶绿素a溶于丙酮-甲醇试剂的速度，避免了不同样品人工操作研磨过程中出现的手动误差，提高叶绿素a含量检测数据的稳定性与重现性。
具体实施方式
22.下面通过实施例对本发明作进一步地详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
23.实验1
24.实验地点选择云南省金沙江流域滇池外海，为云南省科技计划社会发展领域项目《云南典型生态区生态保护与修复技术研究与应用示范》课题一《云南典型生态区生态监测、生态安全评估和预警研究》的研究区，该地水华灾害严重。取滇池水样作为实验原水，该水样主要藻种为蓝藻中的铜绿微囊藻。正常情况下叶绿素a浓度为40～60μg/l。以本发明方法的多个实施例和现有技术的比较例进行对比实验。实施例和比较例分别各取平行水样3份进行测定。
25.实施例1
26.取100ml水样，用0.45μm水系微孔滤膜进行抽滤，控制真空泵压力0.05mpa，获得截留水中叶绿素a的滤膜。将完成抽滤的滤膜折叠后装入10ml带盖密封离心管(聚丙烯pp材质，承受温度范围为-80℃至120℃)，置于-20℃环境下速冻20min，然后置于40～50℃水浴10min，再重复速冻与水浴过程1次。细胞速冻破壁，升温膨胀裂开溶出叶绿素a。将带盖密封离心管打开，加入5ml丙酮∶甲醇(1∶1)试剂，盖上密封盖，置于离心管振荡器，转数240r/min，振荡15min，至滤膜完全溶解成絮状。将振荡完成后的离心管置于离心机，调节转数4000r/min，离心15min，收集上清液至10ml比色管中。向离心管中补加5ml丙酮∶甲醇(1∶1)试剂，置于离心机，调节转数4000r/min，离心15min，收集上清液合并至前述10ml比色管中。将收集合并的上清液用丙酮∶甲醇(1∶1)试剂定容至10ml，作为待测样品备用。
27.然后按《水质叶绿素a的测定分光光度法》(hj 897-2017)标准的要求对待测样品进行分光光度值的测定以及叶绿素a浓度计算。结果见表1。
28.实施例2：
29.重复实施例1，有以下不同点：水样的取样体积为200ml。
30.实施例3：
31.重复实施例1，有以下不同点：重复速冻与水浴过程3次。
32.实施例4：
33.重复实施例1，有以下不同点：振荡时间为20min。
34.实施例5：
35.重复实施例1，有以下不同点：离心时间为20min。
36.比较例1：
37.取100ml水样，对水样的前处理完全按《水质叶绿素a的测定分光光度法》(hj 897-2017)标准中要求的丙酮研磨提取方法进行后得到待测样品。
38.实施例1～5和比较例1的实验检测数据见表1。
39.表1实验1检测数据
[0040][0041]
从表1的数据可以看出，实施例1-5测得叶绿素a浓度值标准偏差低于比较例，说明本发明方法测定数据的重现性与稳定性较高。且实施例1-5测得叶绿素a浓度值明显高于比较例1，说明本发明方法对叶绿素a提取程度更完全，方法更优越，叶绿素a浓度值测定结果准确性得到提高。
[0042]
实验2
[0043]
实验地点选择云南省红河州石屏县异龙湖，为云南省红河哈尼族彝族自治州重点环境保护项目《异龙湖流域生物多样性与生态系统服务功能研究》的研究区。异龙湖属云南省珠江水系南盘江流域，水华灾害严重。取异龙湖水样作为实验原水，该水样主要藻种为蓝藻中的拟柱孢藻，正常情况下叶绿素a浓度为80～90μg/l。以本发明方法的多个实施例和现有技术的比较例进行对比实验。实施例和比较例分别各取平行水样3份进行测定。
[0044]
实施例6
[0045]
取50ml水样，用0.45μm水系微孔滤膜进行抽滤，控制真空泵压力0.05mpa，获得截留水中叶绿素a的滤膜。将完成抽滤的滤膜折叠后装入10ml带盖密封离心管(聚丙烯pp材质，承受温度范围为-80℃至120℃)，置于-20℃环境下速冻20min，然后置于40～50℃水浴10min，再重复速冻与水浴过程1次。将带盖密封离心管打开，加入5ml丙酮∶甲醇(1∶1)试剂，盖上密封盖，置于离心管振荡器，转数240r/min，振荡15min，至滤膜完全溶解成絮状。将振荡完成后的离心管置于离心机，调节转数4000r/min，离心15min，收集上清液至10ml比色管中。向离心管中补加5ml丙酮∶甲醇(1∶1)试剂，置于离心机，调节转数4000r/min，离心15min，收集上清液合并至前述10ml比色管中。将收集合并的上清液用丙酮∶甲醇(1∶1)试剂定容至10ml，作为待测样品备用。
[0046]
然后按《水质叶绿素a的测定分光光度法》(hj 897-2017)标准的要求对待测样品进行分光光度值的测定以及叶绿素a浓度计算。结果见表2。
[0047]
实施例7：
[0048]
重复实施例6，有以下不同点：水样的取样体积为100ml。
[0049]
实施例8：
[0050]
重复实施例6，有以下不同点：重复速冻与水浴过程2次。
[0051]
实施例9：
[0052]
重复实施例6，有以下不同点：振荡时间为20min。
[0053]
实施例10：
[0054]
重复实施例6，有以下不同点：离心时间为20min。
[0055]
比较例2：
[0056]
取100ml水样，对水样的前处理完全按《水质叶绿素a的测定分光光度法》(hj 897-2017)标准中要求的丙酮研磨提取方法进行后得到待测样品。
[0057]
实施例6～10和比较例2的实验检测数据见表2。
[0058]
表2实验2检测数据
[0059][0060]
从表2的数据可以看出，在叶绿素a浓度较高的水样测试过程中，实施例6-10中测得叶绿素a浓度值标准偏差能维持较低水准，低于比较例2，说明本发明方法对于叶绿素a高
浓度水样测定同样适用。且通过叶绿素a浓度值测定值比较，实施例6-10明显高于比较例2，说明本发明方法能明显提高叶绿素a的提取效果，测定结果准确度与精确度更能实际反映待测水样的真实状况。