天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法与流程

1.本发明涉及中医药检测技术领域，具体是一种天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法。


背景技术：

2.天王补心制剂具滋阴养血，补心安神之功效；临床用于心阴不足，心悸健忘，失眠多梦，大便干燥。天王补心制剂包括天王补心丸与天王补心丸（浓缩丸），这两者的处方均由丹参，当归，石菖蒲，党参，茯苓，五味子，麦冬，天冬，地黄，玄参，远志(制)，酸枣仁(炒)，柏子仁，桔梗，甘草，朱砂等16味药材组成。天王补心丸为棕黑色的水蜜丸、褐黑色的小蜜丸或大蜜丸；气微香，味甜、微苦；天王补心丸（浓缩丸）为棕黑色浓缩丸；气微香，味甘、苦。该方剂最早可追溯自宋代陈自明 《妇人大全良方》 卷六，后经明代薛已校注。明代洪九 《摄生总要》 中亦有记载“治心血不足， 神志不宁， 津液枯竭， 健忘怔忡， 大便不利， 口舌生疮等证。
”ꢀ
现代医学报道表明， 天王补心丸临床可治疗失眠、 焦虑、 抑郁、 神经衰弱、 甲状腺功能亢进引起的眩晕等， 2015年版《中国药典》一部成药制剂中对其进行了收载。
3.天王补心制剂方中所含的酸枣仁为处方臣药，助君药养阴清热。酸枣仁ziziphi spinosae semen（zss）为鼠李科枣属植物酸枣 ziziphusjujuba mill. var. spinosa bunge) hu ex h. f. chou的干燥成熟种子。其味甘、酸，性平，归肝、胆、心经，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津之功效。作为治疗失眠的首选药物，酸枣仁临床使用频率高达 67.3%。唐《新修本草》指出“酸枣生河东川泽”。酸枣主要分布在我国北部的山西、河北、陕西、山东、辽宁等省区。理枣仁ziziphi mauritianae semen（zms）为酸枣仁同科同属植物滇刺枣 ziziphus mauritiana lam.的成熟种子，习称“滇枣仁”“缅枣仁”或“进口酸枣仁”。理枣仁始载于明代兰茂所著《滇南本草》：“滇南甚多。食之，元气不散，多睡，能调心肾交接，久服令人目清延年”。理枣仁作为云南民间习用药材，在当地用于治疗失眠。滇刺枣分布于云南、四川等省和缅甸、印度等亚洲国家。
[0004] 中医药学在临床应用酸枣仁治疗失眠已有2000余年历史，其产地相对稳定，广泛分布于我国华北地区。理枣仁为近现代用药，主要分布在我国西南地区。近年来酸枣仁市场需求量增大，野生资源萎缩，导致价格攀升。酸枣仁和理枣仁的性状特征和传统功效较为相似，理枣仁冒充或掺伪酸枣仁的现象较为普遍，两者在中药材市场及临床应用较为混乱。中国食品药品检定研究院在中药材及饮片抽验工作中发现酸枣仁的主要质量问题是伪品理枣仁冒充掺入混用的情况。理枣仁为云南省地方习用药材,其饮片收载于《云南中药饮片标准》2005年版第一册， 包括理枣仁和炒理枣仁2种饮片规格。理枣仁的颜色、质地与正品酸枣仁极相似， 不易区别，特别是在入成药后，难以区分和鉴定。为了避免品种混用，保证药品的正确使用和日常检验、监管的需要，有必要建立两者的鉴别方法。酸枣仁(炒)为天王补心制剂的重要原料药材之一，目前公开文献中未见有关于天王补心制剂中理枣仁的掺伪检查的相关报道，因此，建立天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，有利于保证天王补心制剂的质量。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于针对现有技术的不足而提供的一种天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，该方法操作简便，准确率高，采用该方法可以快速地检测出天王补心制剂中是否存在理枣仁掺伪酸枣仁投料的现象，以保证天王补心制剂的产品质量。
[0006]
本发明采用的技术方案如下：一种天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，所述天王补心制剂包括天王补心丸与天王补心丸（浓缩丸），该检测方法包括以下步骤：（1）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.2ml/min；（2）质谱条件与系统适用性试验：采用电喷雾电离源（esi），正离子模式，多反应监测（mrm）；选择质荷比m/z 535.3
→
148.1和m/z 535.3
→
133.1作为检测离子对，取对照品溶液，进样1μl，上述2对检测离子对的mrm色谱峰的信噪比均应大于3:1；（3）供试品溶液的制备： 取本品水蜜丸适量，研细，取约1g，精密称定；或取浓缩丸适量，研细，取约0.6g，精密称定；或取小蜜丸适量，剪碎，取适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取约3g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180w，频率50khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；（4）对照品溶液的制备：取欧鼠李叶碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8ng的溶液，即得；（5）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，测定，即得；（6）结果判定：以质荷比m/z 535.3
→
148.1和m/z 535.3
→
133.1提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与欧鼠李叶碱对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z535.3
→
148.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
[0007]
进一步的，上述的天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，步骤（2）中所述的质谱条件还包括： 干燥气温度：200℃；干燥气流速：12l/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温
度：350℃；鞘流气流速：11l/min；毛细管电压：4kv；喷嘴电压：500v。
[0008]
本发明的有益效果为：本发明以欧鼠李叶碱（frangufoline）作为指标，采用hplc-ms/ms法建立了天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，该检测方法操作简便，具有灵敏度高、精密度高，专属性好，检测效率高，回收率高，测定结果准确等特点，且具有良好的稳定性和重现性。采用该方法可以快速准确地检测出天王补心制剂中的酸枣仁成分是否有掺假理枣仁的现象，为保证天王补心制剂的产品质量提供了方便快捷的检查方法，为天王补心制剂中酸枣仁的投料监管提供了技术支撑，进一步为天王补心制剂质量标准的建立奠定了基础。
附图说明
[0009]
图1 炒理枣仁和炒酸枣仁中欧鼠李叶碱峰比较图（局部放大）；图2 欧鼠李叶碱对照品mrm图；图3 阴性（缺炒酸枣仁）样品mrm图；图4 对照制剂欧鼠李叶碱 mrm图；图5 10%掺伪样品欧鼠李叶碱mrm图；图6 天王补心丸（山西天生制药有限责任公司供，批号：121001）mrm图；图7 天王补心丸（国药集团冯了性(佛山)药业有限公司供，批号：190001）mrm图；图8 欧鼠李叶碱标准曲线图；图9检测限样品mrm图；图10 agilent eclipse c18柱 检出欧鼠李叶碱阳性样品mrm图；图11waters xbridgebeh c
18
柱 检出欧鼠李叶碱阳性样品mrm图；图12各生产厂家产品的理枣仁掺伪情况图；图13天王补心丸（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂供，批号：20015016 ）mrm图；图14天王补心丸（广盛原中医药有限公司供，批号：2004022）mrm图；图15天王补心丸（山西天生制药有限责任公司供，批号：120003）mrm图；图16 天王补心丸（同药集团大同制药有限公司供，批号：2006043）mrm图；图17 天王补心丸（云南腾药制药股份有限公司供，批号：202008132）mrm图。
具体实施方式
[0010]
实施例11 仪器与试药仪器：安捷伦1290超高效液相系统；安捷伦6460三重串联四级杆ms系统。
[0011]
ml204型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。欧鼠李叶碱对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司供，含量：99.7%，批号：21091005），炒理枣仁（均为缅甸进口，国内炮制）；炒酸枣仁（购自河南、山东、河北），乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。159批天王补心丸为2021年国家评价性抽验的样品。
[0012]
2 本发明实验条件的考察及方法学验证2.1流动相的选择：以agilent eclipse c18柱（1.8
µ
m，2.1 mm
×
100mm）为色谱柱，
柱温35℃，流速0.2ml/min。经过实验，以乙腈-0.1%甲酸流动相体系，分别采用正负离子模式进行扫描，发现电离模式为正离子模式时,欧鼠李叶碱（c
31h42
n4o4）有较大的响应，母离子为m/z 535.3,为[m+h]
+
。故采0.1%甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b。确定梯度洗脱程序如表1。
[0013]
2.2 质谱条件的选择：欧鼠李叶碱对照品溶液（10μg/ml）进行质谱条件优化,优化得出的参数详见表2。确定质谱条件如下：采用电喷雾电离源（esi），正离子方式扫描， mrm方式检测；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12l/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11l/min；毛细管电压：4kv；喷嘴电压：500v。
[0014]
2.3 炒理枣仁和炒酸枣仁中欧鼠李叶碱含量考察22批炒理枣仁和10批炒酸枣仁，粉碎后分别取样1g，精密加甲醇50ml，称定重量，超声处理30min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，进样，记录欧鼠李叶碱峰面积，结果见表3，图1。
[0015]
从上述数据分析可知，炒理枣仁中欧鼠李叶碱峰面积远大于炒酸枣仁中欧鼠李叶碱峰面积，最低差异594倍（炒理枣仁中最低值除以炒酸枣仁中最高值），最高差异3223倍（炒理枣仁中最高值除以炒酸枣仁中最低值）。欧鼠李叶碱可作为是否存在炒理枣仁掺伪、替代炒酸枣仁投料的判断依据。
[0016]
2.4 限度的测定按照炒理枣仁掺伪10%的比例制备天王补心丸样品22份，欧鼠李叶碱平均结果为0.776μg/g，见表4，对应对照品的浓度为8ng/ml，以10%掺伪作为检测低限即以欧鼠李叶碱
对照品的浓度（8ng/ml）为限度，规定结果判断标准为：以质荷比m/z 535.3
→
148.1和m/z 535.3
→
133.1提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与欧鼠李叶碱对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中质荷比m/z535.3
→
148.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
[0017]
2.5方法学验证2.5.1专属性试验：按处方比例，制成相当于45g的缺酸枣仁的阴性对照制剂，加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，分别按拟定的供试品溶液制备方法依法制成缺酸枣仁的
阴性对照制剂溶液和对照制剂溶液，进样测定。结果阴性对照制剂色谱和对照制剂色谱中，均未出现与欧鼠李叶碱对照品色谱保留时间相同的色谱峰，见图2～4。表明阴性对照制剂和对照制剂均对该掺伪检查方法无干扰。10%掺伪样品及阳性样品（山西天生制药有限责任公司供，批号：121001、合格样品（国药集团冯了性(佛山)药业有限公司供，批号：190001）图谱见图5～7。
[0018]
2.5.2线性关系的考察2.5.2.1 对照品线性：分别精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg，置50ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取1ml置同一10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得混合对照品储备液（欧鼠李叶碱：20.06μg/ml）。精密吸取上述对照品储备液1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度。分别精密吸取0.1ml、0.25ml、0.4ml、0. 5ml、1ml、2.5ml、5.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。精密吸取上述溶液，注入液相色谱质谱联用仪，测定峰面积，以各浓度对照品的进样量（pg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表5，图8。
[0019]
2.5.2.2 掺伪线性水蜜丸：天王补心丸制剂线性溶液的制备，按天王补心丸的处方和制法，制备5%、10%、20%、50%、80%、100%掺炒理枣仁的样品，各取1g按拟定的方法提取，测定峰面积，以掺入量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表6。炒理枣仁掺入量5%～100%范围内，炒理枣仁掺入量与色谱峰峰面积线性关系良好。
[0020]
大蜜丸：天王补心丸制剂线性溶液的制备，按天王补心丸的处方和制法，制备5%、10%、20%、50%、80%、100%掺炒理枣仁的样品，加硅藻土后，各取4.5g按拟定的方法提取，测定
峰面积，以掺入量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表7。炒理枣仁掺入量5%～100%范围内，炒理枣仁掺入量与色谱峰峰面积线性关系良好。
[0021]
浓缩丸：天王补心丸制剂线性溶液的制备 按天王补心丸的处方和制法，制备5%、10%、20%、50%、80%、100%掺炒理枣仁的样品，各取0.6g，按拟定的方法提取，测定峰面积，以掺入量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表8。炒理枣仁掺入量5%～100%范围内，炒理枣仁掺入量与色谱峰峰面积线性关系良好。
[0022]
2.5.3重复性考察水蜜丸:取未掺入炒理枣仁的样品（九芝堂股份有限公司，批号：201912015），适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0023]
大蜜丸: 精密称取未掺入炒理枣仁的样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：20015235），剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，
放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0024]
浓缩丸:取未掺入炒理枣仁的样品（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：19g29），适量，研细，取约0.6g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。测定，结果符合方法学要求，详见表9、10、11。
[0025]
2.5.4精密度考察10%掺伪量精密度考察：取10%掺伪量重复性考察项下的第一份供试品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算rsd，结果表明该法精密度好，见表12、13、14。
[0026]
2.5.5稳定性考察取“2.5.3重复性考察”项下的一份样品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h、20 h、24h
进样，记录峰面积，计算rsd，结果见表15、16、17。结果显示供试品溶液在24h内稳定。
[0027]
2.5.6回收率试验（按10%、50%、100%掺伪量进行回收率试验）10%掺伪量：水蜜丸 取未掺入炒理枣仁的样品（九芝堂股份有限公司，批号：201912015）适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0028]
大蜜丸:未掺入炒理枣仁的样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：20015235），剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0029]
浓缩丸:取未掺入炒理枣仁的样品（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：19g29），适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置100ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液
1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0030]
50%掺伪量：水蜜丸取未掺入炒理枣仁的样品（九芝堂股份有限公司，批号：201912015）适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0031]
大蜜丸: 取未掺入炒理枣仁的样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：20015235），剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0032]
浓缩丸:取未掺入炒理枣仁的样品（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：19g29）适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密4ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0033]
100%掺伪量：水蜜丸取未掺入炒理枣仁的样品（九芝堂股份有限公司，批号：201912015）适量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密8ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0034]
大蜜丸: 取未掺入炒理枣仁的样品（北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，批号：20015235），剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密8ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0035]
浓缩丸:取未掺入炒理枣仁的样品（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：19g29）适
量，研细，取约1g共6份，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入欧鼠李叶碱甲醇溶液（精密称取欧鼠李叶碱对照品10.06mg置50ml量瓶中，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，精密吸取1ml置20ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密8ml,置同一200ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度,摇匀，即得。）20ml（共加6份)，密塞，称定重量，超声处理（功率600w，频率45khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。
[0036]
进样，测定数据，计算回收率，结果见表18～20。20。20。
[0037]
2.5.7 检测限
取欧鼠李叶碱（0.3ng/ml）进样分析，按信噪比s/n=3折算，欧鼠李叶碱、的检测限为7ng/g。见图9。
[0038]
2.5.8耐用性同时采用另一品牌的色谱柱：waters xbridgebeh c
18
柱（2.5
µ
m， 2.1 mm
×
100mm），对检出山麦冬掺伪的阳性样品进样分析，结果两根色谱柱的分析结果一致。见图10～11。
[0039]
实施例2 样品测定一种天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，所述天王补心制剂包括天王补心丸与天王补心丸（浓缩丸），该检测方法包括以下步骤：（1）色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1%甲酸溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，按下表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.2ml/min；（2）质谱条件与系统适用性试验：采用电喷雾电离源（esi），正离子模式，多反应监测（mrm）；干燥气温度：200℃；干燥气流速：12l/min；雾化气压力：20（psi）；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：11l/min；毛细管电压：4kv；喷嘴电压：500v；选择质荷比m/z 535.3
→
148.1和m/z 535.3
→
133.1作为检测离子对，取对照品溶液，进样1μl，上述2对检测离子对的mrm色谱峰的信噪比均应大于3:1；（3）供试品溶液的制备： 取本品水蜜丸适量，研细，取约1g，精密称定；或取浓缩丸适量，研细，取约0.6g，精密称定；或取小蜜丸适量，剪碎，取适量，精密称定，精密加入等量的硅藻土，研匀，取约3g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取适量，精密称定，精密加入两倍量的硅藻土，研匀，取约4.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理（功率180w，频率50khz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀；精密吸取续滤液1ml，置5ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得；（4）对照品溶液的制备：取欧鼠李叶碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含8ng的溶液，即得；（5）测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各1μl，注入高效液相色谱-串联质谱联用仪，测定，即得；（6）结果判定：以质荷比m/z 535.3
→
148.1和m/z 535.3
→
133.1提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现与欧鼠李叶碱对照品色谱保留时间一致的色谱峰；若同时出
现，则供试品色谱中质荷比m/z535.3
→
148.1的色谱峰面积值应不得大于对照品色谱中相应的峰面积值。
[0040]
采用所述的天王补心制剂中理枣仁的掺伪检测方法，对本次抽样的159批天王补心丸（实际抽样193批，重复批号34批）进行检测，结果检出理枣仁15批，检出样品占全部天王补心丸样品的9.4%，以云南腾药制药股份有限公司的样品为主。结果表明上述企业部分批次样品存在理枣仁掺伪或替代投料的情况。见图12～17，表21、22。
[0041]