用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物及其应用

1.本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物及其应用。


背景技术：

2.以结直肠肿瘤为代表的恶性肿瘤严重威胁我国人民的健康，世卫组织最新数据显示，全球20％的新发癌症病人在中国，24％的癌症死亡病人在中国。我国每年新发肿瘤病例约为312万例。而每年用于癌症治疗的医疗开支将达到每年100亿美元。结直肠肿瘤在我国发病率居第三位、死亡率居第五位的恶性肿瘤，辅助放化疗是结直肠癌患者重要治疗手段，我们先期以结直肠肿瘤为突破口，针对这一种我国高发的癌种，通过构建结直肠癌多级特征谱，建立结直肠肿瘤化疗疗效评估模型检测技术，可指导临床个体化结直肠肿瘤治疗的方案，提高结直肠肿瘤总体治疗水平，并带来一定的社会经济效益。
3.临床上，ii期和iii期结直肠癌患者通常采用手术治疗的方式，但仍有部分患者在术后发生远处转移，从而造成不良预后结果。目前，用于结直肠癌术后远处转移预测的特异性的分子标志物尚欠缺。因此，研究可用于预测结直肠癌术后转移的分子是一件意义重大的任务。
4.蛋白质是生命活动的承担者和体现者，随着质谱技术的发现，肿瘤的蛋白质组学分析是一种具有光明前景的方法，可用于确定侵袭性、生存结果和治疗监测的预后和预测标志物。虽然先前的蛋白质组学分析研究已被用于产生在结直肠癌和非癌组织之间差异表达的生物标记物，但不同预后患者之间的蛋白质组学分析差异在很大程度上尚未被探索。此外，由于样本量小、缺乏大规模验证队列和标准化程序，很少有蛋白质组生物标记物应用于临床实践。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明的目的在于用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物及其应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一组用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物，由fhl3蛋白、gga1蛋白、nudfs7蛋白和tgfbi蛋白组成。
7.作为本发明所述的用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物的的优选实施方式，所述结直肠癌为ii期或iii期结直肠癌。
8.本发明还提供所述用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物在制备用于预测直肠癌患者术后远处转移风险的试剂中的应用。
9.作为本发明所述的应用，所述试剂包括基于质谱的蛋白质组学技术、多重免疫组化技术联合人工智能自动定量技术检测肿瘤组织fhl3蛋白、gga1蛋白、nudfs7蛋白和tgfbi蛋白表达水平的试剂。
10.本发明还提供一种直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法，包括以下
步骤：
11.(1)差异表达蛋白的获取：收集待测样本，进行组织全蛋白提取，采用质谱分析、wilcox检验分析、lasso logistic算法和svm logistic模型对提取的全蛋白进行分析筛选，得差异表达蛋白；
12.(2)基于差异表达蛋白构建直肠癌患者术后远处转移风险预测模型：对步骤(1)所获得的差异表达蛋白的表达水平进行检测，获得组织中表达该差异表达蛋白的肿瘤细胞的构成比例，并将各细胞的构成比例代入计算公式中，得到风险评分值；根据风险评分值判断直肠癌患者术后远处转移风险。
13.作为本发明所述直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法的优选实施方式，所述差异表达蛋白包括fhl3蛋白、gga1蛋白、nudfs7蛋白和tgfbi蛋白。
14.作为本发明所述直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法的优选实施方式，所述肿瘤细胞包括fhl3+肿瘤细胞、gga1+nudfs7+肿瘤细胞及tgfbi+肿瘤间质细胞。
15.作为本发明所述直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法的优选实施方式，所述计算公式为：风险评分＝1.500
×
fhl3+肿瘤细胞的构成比例(％)－2.552
×
gga1+ndufs7+肿瘤细胞的构成比例(％)+1.704
×
tgfbi+肿瘤间质细胞的构成比例(％)。
16.作为本发明所述直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法的优选实施方式，所述风险评分值的阀值为0.978，如果风险评分值≤0.978，则判断该样品为术后远处转移低风险；如果是》0.978，则判断该样品为术后远处转移高风险。
17.本发明还提供根据所述直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法构建的直肠癌患者术后远处转移风险预测模型。
18.本发明的有益效果为：本发明提供了用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物及应用，本发明通过分析筛选得到一组可用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物，并使用基于质谱的蛋白质组学技术、多重免疫组化技术联合人工智能自动定量技术的方法对其肿瘤组织中蛋白分子fhl3，gga1，nudfs7，tgfbi进行表达水平的检测，代入到特定计算公式中进行ii期或iii期结直肠癌患者术后发生远处转移的风险评分的计算，对结直肠癌患者术后远处转移风险进行预测，更好地指导ii期或iii期结直肠癌患者的治疗。
附图说明
19.图1为训练组、内部验证组、外部验证组结直肠癌患者无远处转移生存率的kaplan-meier分析；
20.图2为训练组、内部验证组、外部验证组结直肠癌患者无病生存率的kaplan-meier分析；
21.图3为各模型对ii期和iii期结直肠癌患者术后发生远处转移预测的特异性和敏感性分析的roc曲线。
具体实施方式
22.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。
23.实施例1
24.本实施例对用于预测结直肠癌患者术后远处转移风险的标志物进行分析筛选，具体方法如下：选取60例ii期或iii期结直肠癌患者，其中30例为术后发生远处转移的病人，其余30例为术后未发生远处转移的病人。收集以上病人的肿瘤组织以及配对的癌旁组织(正常结直肠黏膜组织)，经组织全蛋白提取、变性还原、蛋白烷基化、酶解、肽段脱盐和分离后进行液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)分析。对于质谱分析的原始数据，通过采用mascot等软件程序，结合控制错误发现率(fdr)低于1％，共鉴定10320个蛋白质分子，其中3222个蛋白质在超过90％的样本中都有表达。使用wilcox检验分析成对的肿瘤组织和正常组织样本之间的差异表达蛋白，以及转移组和非转移组之间肿瘤组织中的差异表达蛋白，共发现12个差异表达蛋白。其中6种差异表达蛋白在肿瘤组织中较正常组织表达上调，且同时在转移组中较非转移组表达上调，其余6种差异表达蛋白在肿瘤组织中较正常组织表达下调，且同时在转移组中较非转移组表达下调。最后，我们通过使用lasso logistic算法和svm logistic模型从12个差异表达蛋白中选择以下4个蛋白gga1、fhl3、tgfbi、ndufs7，进行后续的研究和模型的建立。
25.实施例2
26.本实施例提供了一种直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法，并使用该模型对193例样本的直肠癌患者术后远处转移风险进行预测。
27.本实施例的一种直肠癌患者术后远处转移风险预测模型的构建方法，包括以下步骤：对实施例1所获得的差异表达蛋白的表达水平进行检测，获得组织中表达该差异表达蛋白的fhl3
+
肿瘤细胞、gga1
+
nudfs7
+
肿瘤细胞及tgfbi
+
肿瘤间质细胞的构成比例(％)，并将各细胞的构成比例代入计算公式中，计算公式：风险评分值＝1.500
×
fhl3
+
肿瘤细胞的构成比例(％)－2.552
×
gga1
+
ndufs7
+
肿瘤细胞的构成比例(％)+1.704
×
tgfbi
+
肿瘤间质细胞的构成比例(％)，根据风险评分值判断直肠癌患者术后远处转移风险。所述风险评分值的阀值为0.978，如果风险评分值≤0.978，则判断该样品为术后远处转移低风险；如果是》0.978，则判断该样品为术后远处转移高风险。采用上述模型对193例患者进行预测。结果如表1和图1、图2所示。将91例患者分为低风险组，将102例分为高风险组。预测分组和结果如表1和图1、图2所示。由表1和图1、图2可知，在训练集、内部验证集和外部验证集中，与低风险组患者相比，高风险组患者的无远处转移生存率(图1)、无病生存率(图2)和总生存率(表1)均较差。
28.表1
[0029][0030]
实施例3
[0031]
本实施例的采用两组验证组对实施例2构建的直肠癌患者术后远处转移风险预测模型进行验证。
[0032]
(1)将内部验证组的193例患者分为高风险组(107例)和低风险组(86例)，由表1和图1、图2可知，与低风险组患者相比，高风险组患者的无远处转移生存率(hr3.28，95％ci 1.63-6.6；p《0.001；图1b)、无病生存率(hr2.16，95％ci 1.27-3.67；p＝0.008；图2b)和总生存率(表1)均较差。
[0033]
(2)将外部验证组的316例患者分为高风险组(162例)和低风险组(154例)，由表1和图1、图2可知，与低风险组患者相比，高风险组患者的无远处转移生存率(hr3.20，95％ci 2.00-5.13；p《0.001；图1c)、无病生存率(hr1.62，95％ci 1.11-2.36；p＝0.014；图2c)和总生存率(表1)均较差。
[0034]
实施例4
[0035]
本实施例采用roc曲线评价采用该直肠癌患者术后远处转移风险预测模型对直肠癌患者术后远处转移风险预测的敏感性和特异性。结果如图3所示。由图3可知，采用本预测模型对直肠癌患者术后远处转移风险预测的roc曲线下面积auc值最高，说明采用本预测模型对直肠癌患者术后远处转移风险预测效能要优于其他现有预测方法。
[0036]
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。