触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条及其制备方法和检测卡、试剂盒与流程

1.本发明属于免疫检测领域，涉及一种触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条及其制备方法和检测卡、试剂盒。


背景技术：

2.消化道出血是临床常见症状之一，可以分为上消化道出血和下消化道出血。而部分消化道出血比较微量，粪便外观无异常改变，肉眼难以发现，导致绝大多数早期消化道恶性肿瘤患者无法及时发现并早期干预治疗，从而延误了治疗的最佳时机。粪便隐血试验是检测急、慢性消化道出血和消化道恶性肿瘤的重要方法之一，是目前唯一通过随机临床试验证实的、可以降低结肠癌和直肠癌所致死亡的检查项目，如何准确检测出消化道出血，对于结肠癌和直肠癌患者的早期诊治异常重要。
3.大便潜隐血，又称大便潜血，是指消化道少量出血，红细胞被破坏，粪便外观没有异常改变，肉眼和显微镜下均不能证实的出血。它的意义主要是检测各种原因所致的消化道出血、消化道恶性肿瘤，早期诊断的重要筛查指标，也是发现潜血变的有效方法。对于消化道肿瘤的患者，早期有20％的患者可出现潜血试验阳性，晚期病人的潜血试验阳性，甚至可达到90％以上，而且呈现可持续性的阳性。因此它可以作为消化道肿瘤筛查的一项指标。对于消化道出血，消化道溃疡的病人粪便潜血实验大多数是阳性的，或者出现阶段性的阳性。
4.便隐血即便潜血在目前临床上主要检测方法有化学法和免疫学方法。化学法由于特异性低，敏感度差，受饮食和药物的影响大，结果不易判别，所以采用率低。而免疫学中的胶体金法，将血红蛋白或转铁蛋白作为抗原、与试纸上预置的抗血红蛋白或转铁蛋白抗体发生免疫反应，检测粪便中的血红蛋白或转铁蛋白。在灵敏度、特异性方面都有了很大的提高，在临床上已得到广泛应用。前者可检出下消化道任何部位的出血，而后者能检出上消化道的出血，因上消化道的出血经消化酶作用后，其红细胞基质尽被消化，不再有免疫反应。因为转铁蛋白主要存在于血浆中，在健康人的粪便中几乎不存在，而在消化道出血时的粪便中大量存在。同时转铁蛋白稳定性明显高于血红蛋白。针对上消化道出血，在检测血红蛋白的同时检测转铁蛋白，其中一项检测出为阳性即为阳性，这样可以起到优势互补的作用，检出率较单项检测法更高，可有效降低假阴性结果。
5.触珠蛋白(hp)即结合珠蛋白是一种分子量为85000的酸性糖蛋白，主要在肝脏合成。主要功能是与游离血红蛋白(hb)结合成稳定的复合物，呈现出新的抗原决定簇，可被单核细胞、巨噬细胞表面的血红蛋白清除受体(cd163)所识别并结合，之后被吞噬降解，从而除去了血循环中游离的血红蛋白。临床上测定触珠蛋白主要用于诊断溶血性贫血。各种溶血性贫血触珠蛋白含量都明显减低，甚至低到测不出的程度。轻度溶血时，血浆中游离血红蛋白全部与触珠蛋白结合而被清除，此时血浆中测不出游离血红蛋白，仅见触珠蛋白减少。当游离血红蛋白量超过触珠蛋白结合能力时方被查出。因此，触珠蛋白可作为早期提示便
隐血出现的一项敏感指标。
6.临床上一般采用联合检测的检测方式，目前市场上已有血红蛋白-转铁蛋白联检试剂盒、血红蛋白-触珠蛋白联检试剂盒等。比如：发明专利cn101965515a提供了一种用于检测潜血的方法和装置，包括检测在gi样品中的转铁蛋白(tf)和血红蛋白(hb)，以及将检测到的转铁蛋白和血红蛋白的量与转铁蛋白和血红蛋白的各自的预定值相比较，并提供使用横向流动三明治免疫测定装置来实现对转铁蛋白和血红蛋白的检测，该技术方案缺少触珠蛋白检测。发明专利cn111879924a提供了一种快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法，该技术方案缺少转铁蛋白的检测，并且无法检测出游离的触珠蛋白。消化道出血时除了能在粪便中有血红蛋白、转铁蛋白、还有触珠蛋白。触珠蛋白只有在消化道出血时才会进入到消化道中，与血红蛋白结合时能形成结合珠蛋白-血红蛋白复合物。
7.而触珠蛋白的加入对于前两种检测方法都是一种不可忽视的助力：少量出血和大便中结合珠蛋白形成复合物，而抗血红蛋白抗体不能对这种复合物进行识别，检测结果呈阴性。检测触珠蛋白不仅能识别消化道中游离的触珠蛋白，而且能识别触珠蛋白-血红蛋白复合物，有效避免极微量隐血的漏检，大大提高便隐血检测的灵敏度。
8.cn111879924a采用了结合珠蛋白-血红蛋白复合物作为消化道出血的一个指标，复合物结构如图1所示。由于形成复合物之后原先的抗原表位c和d被覆盖，抗原表位b也有很大一部分被覆盖，只有抗原表位a完全露在外面供抗体识别。因此，针对该复合物的抗体识别的抗原表位是以a为主，b为辅的，与游离的结合珠蛋白(触珠蛋白)的抗原表位差别很大，无法识别游离的结合珠蛋白。该发明对于该指标(结合珠蛋白-血红蛋白复合物)的检测是采用抗触珠抗体和抗复合物抗体进行夹心捕获，辅助作为消化道出血检测，选用的是特异性识别结合珠蛋白和识别复合物的抗体对，对于游离的结合珠蛋白无法识别。当血红蛋白被破坏或者含量极低时，即使有出血导致粪便中有触珠蛋白也无法被检测出，即使与血红蛋白、转铁蛋白联合检测也会造成一定程度的漏检。
9.以上专利所涉及的产品均非共线混合抗体划线，而是分别划线。


技术实现要素：

10.为了尽早发现消化道病变，高敏感性地检测大便潜隐血，需要一种既能能够检测人粪便样本中游离触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白，又能够检测相关复合物的检测试剂和检测方法，本发明解决这样的问题。
11.一方面，本发明公开了一种触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条，包括金标垫和与金标垫端部重叠连接的检测垫；检测垫上设置有检测线和质控线；检测线上包被有混和抗体；混和抗体包括第一抗人触珠蛋白单克隆抗体、第一抗人血红蛋白单克隆抗体和第一抗人转铁蛋白单克隆抗体；质控线上包被有质控抗体；金标垫上包被有胶体金标记的抗体；胶体金标记的抗体包括胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体；
12.第一抗人触珠蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体分别与触珠蛋白的不同抗原表位结合；第一抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体分别与血红蛋白的不同抗原表位结合；第一抗人转铁蛋白单克隆抗
体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体分别与转铁蛋白的不同抗原表位结合；
13.胶体金标记的抗体还能够与质控抗体结合。
14.在一些实施方案中，质控抗体为抗鼠igg；胶体金标记的抗体均属于鼠抗人单克隆抗体。进一步地，混和抗体均属于鼠抗人单克隆抗体。进一步地，所述抗鼠igg选自羊抗鼠igg、兔抗鼠igg和马抗鼠igg中的一种或多种。
15.在一些实施方案中，检测垫通过如下方法制备获得：将硝酸纤维素膜浸入4％-6％bsa溶液中，干后，在其上包被混和抗体形成检测线，在其上包被质控抗体形成质控线；检测线与质控线间存在间隔。
16.进一步地，检测垫通过如下方法制备获得：将硝酸纤维素膜浸入5％bsa溶液中，干后，在其上包被混和抗体形成检测线，在其上包被质控抗体形成质控线；检测线与质控线间存在间隔。
17.在一些实施方案中，混合抗体需用磷酸盐包被稀释液4号稀释到设定的浓度后再包被到检测垫上形成检测线；
18.磷酸盐包被稀释液4号制备1l量时的配方为：na2hpo
4 0.23g、nah2po
4 1.15g、nacl 9g、蔗糖30g、proclin300 0.4ml、bsa 1g、s9 1.041g，调ph至7.45，加水至1l。
19.进一步地，通过盐酸和naoh调ph。
20.在一些实施方案中，第一抗人血红蛋白单克隆抗体、第一抗人转铁蛋白单克隆抗体和第一抗人触珠蛋白单克隆抗体的浓度各自独立地为0.1-0.17mg/ml。
21.在一些实施方案中，通过如下方法得到混合抗体：
22.将第一抗人血红蛋白单克隆抗体、第一抗人转铁蛋白单克隆抗体和第一抗人触珠蛋白单克隆抗体的浓度分别稀释到0.5mg/ml、0.3mg/ml和0.3mg/ml；然后等体积混合第一抗人血红蛋白单克隆抗体、第一抗人转铁蛋白单克隆抗体和第一抗人触珠蛋白单克隆抗体得到混合抗体。
23.在一些实施方案中，还包括样品垫、吸水垫和底板；样品垫、金标垫、检测垫和吸水垫依次端部重叠连接设置在底板上；检测线相对于质控线更靠近金标垫。其检测样本为粪便或粪便稀释液。
24.第二方面，本发明公开了一种如上所述的触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：
25.步骤一、将硝酸纤维素膜浸入5％bsa溶液中，干后，得到预处理的nc膜；
26.步骤二、在预处理的nc膜上划线，即将混和抗体包被到预处理的nc膜上形成检测线，将质控抗体包被到预处理的nc膜上形成质控线，得到检测垫。检测线与质控线间存在间隔。
27.在一些实施方案中，步骤二中，混合抗体需用磷酸盐包被稀释液4号稀释到设定的浓度后再包被到检测线处；
28.磷酸盐包被稀释液4号制备1l量时的配方为：na2hpo
4 0.23g、nah2po
4 1.15g、nacl 9g、蔗糖30g、proclin300 0.4ml、bsa 1g、s9 1.041g，调ph至7.45，加水至1l。
29.进一步地，通过盐酸和naoh调ph。
30.第三方面，本发明公开了一种检测卡，包括如上所述的触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条和卡盒，用于盛放触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条；
31.卡盒上设置有观察窗和加样孔；观察窗的位置与检测线和质控线的位置对应；加样孔的位置与触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条的样品垫的位置对应。
32.在一些实施方案中，卡盒上还设置有二维码，用于追踪、防伪和/或采样示范视频链接。
33.在一些实施方案中，卡盒上还设置了信息录入区，用于录入信息，比如编号(id)和日期(date)。
34.第四方面，本发明公开了一种试剂盒，包括如上所述的触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条。
35.本发明的试纸条、检测卡、试剂盒采用免疫层析技术原理，通过反复试验以一定的比例在nc膜上的检测线(t线)位置混合包被了不同浓度的第一抗人血红蛋白单克隆抗体、第一抗人转铁蛋白单克隆抗体、第一抗人触珠蛋白单克隆抗体，通过不断的试验以一定的比例在金垫上用胶体金溶液标记了第二抗人血红蛋白单克隆抗体、第二抗人转铁蛋白单克隆抗体、第二抗人触珠蛋白单克隆抗体，采用双抗体夹心法检测粪便中的出血标志物，无论是血红蛋白、转铁蛋白还是触珠蛋白，任意一种标志物为阳性时，出血标志物(血红蛋白、转铁蛋白或者触珠蛋白)与胶体金标记的相应单克隆抗体结合，由于层析作用沿纸条向前移动，经过预固定在硝酸纤维素膜上的混合抗体，从而在检测线处显示红色条带，游离胶体金标记抗体则于质控线处与羊抗鼠igg结合，从而在质控线处显示红色条带。3种标志物均为阴性的标本则仅在质控线处显示红色条带。
36.发明人通过对nc膜的多种处理方式，包被溶液的配方，标记溶液的配方等多方面调试改进工艺参数最终完成了三合一(血红蛋白、转铁蛋白或者触珠蛋白)检测试纸条、检测卡、试剂盒的研发，突破性的实现了三种蛋白对应的单抗共同包被在胶体金结合垫上，共同涂覆在同一条检测线上的方法来辅助消化道出血的诊断，有效提高结直肠癌的检出率，从而提高结直肠癌患者的五年生存率。
37.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
38.图1是结合珠蛋白-血红蛋白复合物结构示意图。
39.图2是本发明所涉及的试纸条的一个具体实施方式的结构示意图。
40.图3是本发明所涉及的检测卡的一个具体实施方式的结构示意图。
41.图4是本发明所涉及的试纸条的另一个具体实施方式的结构示意图。
42.图5是本发明所涉及的检测卡的另一个具体实施方式的结构示意图。
具体实施方式
43.为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
44.须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明
所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
45.实施例1
46.图2示出了本发明所述的触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条中的一种具体实施方式。在该实施例中，触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条包括底板7、样品垫1、金标垫2、检测垫5和吸水垫6。样品垫1、金标垫2、检测垫5和吸水垫6依次端部重叠连接设置在底板7上。如图2所示，样品垫1的一端压在金标垫2的一端上，金标垫2的另一端压在检测垫5的一端上；吸水垫的一端压在检测垫5的另一端上。检测垫5上设置有检测线(t)3和质控线(c)4。相对于质控线(c)4来说，检测线(t)3更靠近金标垫2。
47.底板7为pvc或ps材料；检测垫5的材料为硝酸纤维素膜。
48.检测线(t)3上包被有混合抗体；质控线(c)4上包被有羊抗鼠igg抗体；金标垫2上包被有胶体金标记的抗体。
49.混和抗体包括第一抗人触珠蛋白单克隆抗体、第一抗人血红蛋白单克隆抗体和第一抗人转铁蛋白单克隆抗体；胶体金标记的抗体包括胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体。第一抗人触珠蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体分别与触珠蛋白的不同抗原表位结合；第一抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体分别与血红蛋白的不同抗原表位结合；第一抗人转铁蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体分别与转铁蛋白的不同抗原表位结合。胶体金标记的抗体均属于鼠抗人单克隆抗体，能够与羊抗鼠igg结合。
50.实施例2
51.试纸条的制备方法，具体包括以下步骤：
52.1)预处理nc膜：将硝酸纤维素膜(nc膜)浸入5％bsa溶液中，取出烘干后待用。
53.2)制备检测线t和质控线c：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体1(即第一抗人血红蛋白单克隆抗体)、鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体1(即第一抗人转铁蛋白单克隆抗体)、鼠抗人触珠蛋白单克隆抗体1(即第一抗人触珠蛋白单克隆抗体)(3种抗体均购自nordic life，货号分别为10081、10079和10077)分别用磷酸盐包被稀释液4号(配方见表1)稀释到0.3-0.5mg/ml，混合后以1.5ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为检测线t；羊抗鼠igg抗体(购自杭州博茵生物，货号p200201)溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为质控线c，置于36℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线t包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体1、鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体1、鼠抗人触珠蛋白单克隆抗体1浓度均为0.5mg/ml，羊抗鼠igg抗体浓度为1.0mg/ml。
54.表1、磷酸盐包被稀释液4号配方
55.[0056][0057]
3)金标垫的制备：将纯化的胶体金标记的抗体按1:5进行稀释，包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫。
[0058]
所述纯化的胶体金标记的抗体的制备过程：
[0059]
a、获得胶体金：取一定量的超纯水加入到玻璃容器中，搅拌并加热。待超纯水烧开后，再加入一定量的1％四氯金酸，待重新沸腾后，加入一定量的2％柠檬酸三钠。约3分钟后将火候调至微沸。从加入四氯金酸开始计时，共煮沸约15分钟。到时间后，置于室温下冷却，液体呈澄清透明酒红色即可，胶体金颗粒在522nm波长有最大吸收峰，颗粒大小为40nm。
[0060]
b1、胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体：用0.1mol/l的k2co3溶液调节上述胶体金的ph至8.2，将浓度为2mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体2(购自nordic life，货号10082)加入到调整ph后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体2与调整ph后的胶体金的体积比1:1，标记30min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体2-胶体金偶联物(即胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体)。
[0061]
b2、胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体：用0.1mol/l的k2co3溶液调节上述胶体金的ph至8.2，将浓度为4mg/ml的标记用鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体2(购自nordic life，货号10080)加入到调整ph后的胶体金中，标记用鼠抗人转铁蛋白抗体2与调整ph后的胶体金的体积比1:1，标记30min，得到鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体2-胶体金偶联物(即胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体)。
[0062]
b3、胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体：用0.1mol/l的k 2co3溶液调节上述胶体金的ph至8.2，将浓度为2mg/ml的标记用鼠抗人触珠蛋白单克隆抗体2(购自nordic life，货号10078)加入到调整ph后的胶体金中，标记用鼠抗人触珠蛋白抗体2与调整ph后的胶体金的体积比1:1，标记30min，得到鼠抗人触珠蛋白单克隆抗体2-胶体金偶联物(即胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体)。
[0063]
c、纯化的胶体金标记的3种抗体：向步骤b1-b3得到的胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体的溶液中分别加入质量分数10％的牛血清白蛋白(bsa)水溶液，至bsa的终浓度为0.5％，后停止加入，继续搅拌25min，14000rpm离心30min，弃上清液，加入占标记(离心后的沉淀)总体积的25％的酪蛋白钠溶液，即得纯化的胶体金标记的3种抗体。
[0064]
d、将纯化的胶体金标记的3种抗体以当量比1:1:1进行混合后使用。
[0065]
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜(即检测垫)及底板按顺序进行连接组装，即得本发明所涉及的试纸条。
[0066]
实施例3
[0067]
为了实现3种检测线能划在一条上，需要对工艺进行摸索，既要保证灵敏度又不能影响特异性，主要通过研究包被稀释液配方、3种抗体浓度和相互配比，膜处理等实现。
[0068]
1.通过调整检测线上3种单抗的不同包被条件(1-4)，观察对于不同样本(1#-8#)检测效果，吸光度反应了标志物的含量，数值越高则与之结合的目标物越多。详细过程见试验例1。
[0069]
2.通过对nc膜使用不同的封闭条件进行预处理，观察对于不同样本(1#-8#)检测效果。详细过程见试验例2。
[0070]
3.通过研究包被稀释液配方，观察对于不同样本(1#-8#)检测效果。详细过程见试验例3。
[0071]
序号1-序号8(即1#-8#)分别表示粪便中血红蛋白(hb)、转铁蛋白(tf)、触珠蛋白(hp)的不同含量的样本，这3种标志物的阳性表示样本中含量分别为(200ng/ml、40ng/ml和4ng/ml)；阴性则表示含量为0，如1#样本表示这3种标志物的阳性表示样本中含量分别为(200ng/ml、40ng/ml和4ng/ml)，8#样本为表示其中不含有任何标志物的阴性样本；3种标志物任意一个检测到阳性则该样本为阳性。
[0072]
试验例1
[0073]
检测线上3种单抗的不同包被条件分别为hb：tf：hp＝0.3:0.3:0.3mg/ml、hb：tf：hp＝0.5:0.3:0.3mg/ml、hb：tf：hp＝0.5:0.5:0.3mg/ml、hb：tf：hp＝0.5:0.5:0.5mg/ml，观察对于不同样本(1#-8#)检测结果如表2，吸光度反应了标志物的含量，数值越高则与之结合的目标物越多，以1#样本检测结果应该尽可能高，而8#样本检测结果应该尽可能低，以1#样本与8#样本的检测结果的比值作为评价标准，4种方法比值分别为(7.8、7.5、3.7、3.1)，第一种方法中2#和5#样本的检测值有明显降低，可能存在hb漏检的情况，选择的第2种包被条件为hb：tf：hp＝0.5:0.3:0.3mg/ml作为该试剂盒包被条件。试验例1中将3种单抗的比值(hb单抗：tf单抗：hp单抗)直接用其对应的抗原蛋白来表示，即hb：tf：hp。
[0074]
表2、检测线上3种单抗的不同包被条件检测结果
[0075][0076]
试验例2
[0077]
对nc膜进行预处理可以实现提高灵敏度降低非特异性的效果。观察不同的封闭条件处理过的nc膜制成的检测卡对于不同样本(1#-8#)检测结果，找到合适的膜处理方法。结果如表3，吸光度反应了标志物的含量，数值越高则与之结合的目标物越多，以1#样本检测结果应该尽可能高，而8#样本检测结果应该尽可能低，同时2#-7#样本的检测值不能过低，综合考虑选择5％的bsa作为预处理条件，将nc膜浸入5％bsa溶液中，取出烘干后使用，能有效提高检测效果。
[0078]
表3、nc膜的预处理结果比较
[0079][0080]
试验例3
[0081]
通过在基础的磷酸盐包被稀释液中添加不同的表面活性剂或高分子聚合物确定最优配方，观察制备成的检测卡对于不同样本(1#-8#)检测效果。选择吐温、曲拉通、s9、蔗糖作为添加物，检测结果如表4，吸光度反应了标志物的含量，数值越高则与之结合的目标物越多，以1#样本检测结果应该尽可能高，而8#样本检测结果应该尽可能低，同时2#-7#样本的检测值不能过低，优选在磷酸盐缓冲液中添加0.1％s9，能有效提高检测效果。
[0082]
表4、磷酸盐包被稀释液中不同表面活性剂或高分子聚合物对检测结果的影响
[0083][0084]
实施例4
[0085]
将实施例1所述的试纸条，或者实施例2得到的试纸条放入卡盒内，得到检测卡，如图3所示。该检测卡包括卡盒20和试纸条。卡盒20上设置有观察窗21和加样孔22。观察窗21的位置与检测线(t)和质控线(c)的位置对应。加样孔22的位置与触珠蛋白、血红蛋白、转铁蛋白共线检测试纸条的样品垫的位置对应。卡盒上还设置有二维码和信息录入区。信息录入区，用于录入信息，含有编号(id)和日期(date)。
[0086]
实施例5
[0087]
图4显示了本发明所涉及的试纸条的工作原理；图5显示了本发明所涉及的检测卡。
[0088]
如图4所示，本发明所涉及的试纸条包括底板7，这里为pvc或ps底板，用于支持4种功能垫的组装。这4种功能垫分别是样品垫1、金标垫2、检测垫5和吸水垫6。样品垫1用于接受样品。金标垫2用于吸附标记物，并均匀释放标记物。检测垫5上划有由3种单抗包被形成的检测线(t)3和由质控单抗包被形成的质控线(c)4。当样品30加入样品垫1后，其沿样品垫1层析依次经过金标垫2、检测垫5，最后到达吸水垫6，完成整个层析过程。若样品30中含有触珠蛋白、血红蛋白和/或转铁蛋白则在检测线3处发生胶体金聚集显色，同时在质控线4处也会发生胶体金聚集显色。若样品30中不含有触珠蛋白、血红蛋白和转铁蛋白则在检测线3处不发生胶体金聚集，检测线3不显色，但在质控线4处会发生胶体金聚集显色。若样品30检测层析完成后，质控线4处没有显色，那么表明该检测结果不可信。
[0089]
以硝酸纤维素膜为材料，在其上包被第一抗人触珠蛋白单克隆抗体、第一抗人血红蛋白单克隆抗体和第一抗人转铁蛋白单克隆抗体形成检测线；同时在其上包被质控抗体
羊抗鼠igg形成质控线，得到检测垫。第一抗人触珠蛋白单克隆抗体、第一抗人血红蛋白单克隆抗体和第一抗人转铁蛋白单克隆抗体均属于鼠抗人单克隆抗体。
[0090]
以玻璃纤维膜为材料，在其上均匀包被胶体金标记的第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、胶体金标记的第二抗人血红蛋白单克隆抗体和胶体金标记的第二抗人转铁蛋白单克隆抗体，得到金标垫。第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、第二抗人血红蛋白单克隆抗体和第二抗人转铁蛋白单克隆抗体均属于鼠抗人单克隆抗体。第二抗人触珠蛋白单克隆抗体与第一抗人触珠蛋白单克隆抗体可分别结合于触珠蛋白的不同抗原表位上；第二抗人血红蛋白单克隆抗体与第一抗人血红蛋白单克隆抗体可分别结合于血红蛋白的不同抗原表位上；第二抗人转铁蛋白单克隆抗体与第一抗人转铁蛋白单克隆抗体可分别结合于转铁蛋白的不同抗原表位上。第二抗人触珠蛋白单克隆抗体、第二抗人血红蛋白单克隆抗体和第二抗人转铁蛋白单克隆抗体均可与质控抗体羊抗鼠igg结合。
[0091]
图5示出的检测卡包括卡盒和试纸条。卡盒包括加样孔(s)22和观察窗21。透过观察窗21可见试纸条的检测线(t线)和质控线(c线)。其中检测线上包被有鼠抗hb(第一鼠抗人血红蛋白单克隆抗体)、鼠抗tf(第一鼠抗人转铁蛋白单克隆抗体)和鼠抗hp(第一鼠抗人触珠蛋白单克隆抗体)；质控线上包被有羊抗鼠(羊抗鼠igg)。
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以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。