时间分辨荧光免疫层析法定量检测TK1的试剂盒及其应用的制作方法

本技术涉及生物医学检验，尤其涉及时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒及其应用。

背景技术：

1、胸苷激酶(tk)可催化胸苷磷酸化生成胸苷一磷酸。有研究发现，tk以多种同工酶形式存在于各种不同的原核和真核生物中。这两种同工酶原命名为“胚胎”tk和“成体”tk，胚胎tk大量存在于胚胎中。胚胎tk是与细胞分裂相关，存在于细胞质中，成体tk存在于线粒体中，它的表达与细胞周期无关。胚胎tk被称为tk1(细胞质胸苷激酶)，成体tk被称为tk2(线粒体胸苷激酶)。tk的表达和调控哺乳动物细胞中染色体dna的复制是限制在细胞周期中的s期。在细胞进入s期后，许多酶的酶活性会提高，这是dna前体合成和dna复制过程中所需要的，但在dna合成后酶活性会降低。在s期的特殊酶中，就包括了tk、胸苷酸合成酶、二磷酸核糖核苷还原酶、二氢叶酸还原酶。借助清除血清的方法，当细胞处于静止期时，仅检测到低浓度的tk，但加入新鲜血清后，静止期细胞被诱发重新进入细胞周期。

2、由于tk1与细胞增殖密切相关，因此tk1在临床常用于评估各类增殖类疾病恶变的风险，如肺癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、乳腺癌和宫颈癌等。tk1是国际公认的细胞异常增殖标记物，可通过比较肿瘤患者手术前后肿瘤细胞的增殖情况，为手术效果评价提供参考，同时也可评估肿瘤复发风险，此外也适用于健康人群的肿瘤预防检测。

3、tk1的检测需求日益增加，这使得像体外诊断试剂这种方便快捷的检测方法的开发显得至关重要。目前，tk1检测试剂盒所涉及的方法主要为化学发光分析法、酶联免疫法两种。

4、化学发光分析法主要是依据化学发光检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈现线性定量关系的原理，利用仪器对体系化学发光强度进行检测，从而确定待测物含量的一种分析方法。化学发光分析法检测tk1具有检测周期短、灵敏度和自动化程度高等优点。但是该方法成本较高，且需要特定的化学发光仪，这导致其在tk1的临床检测中应用范围较小。

5、酶联免疫法试讲抗原和抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的检测方法。酶联免疫分析可分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法，一般采用竞争法原理对样本中的tk1进行定量检测。酶联免疫法由于重复性不好，易出现假阳性，且操作繁琐，受干扰因素多等原因，而应用较少。

技术实现思路

1、本技术实施例的目的在于提出一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒及其应用，能够快速准确的测定tk1的含量。

2、为了解决上述技术问题，本技术实施例提供一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的方法，采用了如下所述的技术方案：

3、一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒，包括检测卡和检测芯片，所述检测芯片中存储有检测tk1含量的标准曲线数据；所述检测卡包括卡壳及收纳于卡壳内的试纸条，所述试纸条包括pvc底板，所述pvc底板上设置有依次搭接的样品垫、结合垫、反应板以及吸收垫；

4、其中，所述结合垫上固定有抗tk1荧光标记抗体和羊抗鸡igy荧光标记抗体，基于从所述结合垫至所述吸收垫的方向，所述反应板上依次设有包被tk1抗体的检测线和包被鸡igy抗体的质控线。

5、进一步的，所述样品垫采用如下步骤制得：

6、配制处理液，将处理液浸润玻璃纤维棉材质制备的初始样品垫，将浸润后的初始样品垫干燥处理，获得所述样品垫，其中，所述处理液包括牛血清白蛋白、tween-20以及硼酸硼砂缓冲液。

7、进一步的，按照质量分数，所述处理液包括1％的牛血清白蛋白、0.5％的吐温-20以及0.2m的硼酸硼砂缓冲液。

8、进一步的，所述结合垫采用如下步骤制得：

9、裁切玻璃纤维，制得玻璃纤维材质的初始结合垫；

10、制备检测线标记抗体溶液和质控线标记抗体溶液，并等比例混合所述检测线标记抗体溶液和所述质控线标记抗体溶液，获得标记抗体溶液；

11、将所述标记抗体溶液按照4.2μl/cm的喷量，从喷金机中喷到初始结合垫上，获得所述结合垫。

12、进一步的，所述制备检测线标记抗体溶液和质控线标记抗体溶液的步骤包括：

13、将称取的荧光微球加入标记缓冲液中，加入标记活化液，混合均匀，其中，所述荧光微球上存在镧系元素螯合物荧光标记；

14、离心，去除上清液，加入标记缓冲液，超声粉碎，加入目标抗体，混合均匀；

15、加入标记封闭液，超声粉碎，离心，去除上清液，加入标记保存液，超声粉碎，混合均匀，获得目标溶液；

16、其中，在加入的目标抗体为抗tk1标记抗体时，获得的目标溶液为所述检测线标记抗体溶液；

17、在加入的目标抗体为羊抗鸡igy标记抗体时，获得的目标溶液为所述质控线标记抗体溶液。

18、进一步的，所述标记缓冲液包括1.067％的2-吗啉乙磺酸；所述标记活化液包括2％的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺；所述标记封闭液包括10％的血清白蛋白；所述标记保存液包括牛血清白蛋白2％、蔗糖2％、酪蛋白钠盐0.5％、海藻糖5％、抑菌防腐剂0.05％以及0.2m ph值为8.0的tris缓冲液。

19、进一步的，所述反应板采用如下步骤制得：

20、制备抗体包被稀释液，通过抗体包被稀释液分别将tk1抗体和鸡i gy稀释至1.0mg/ml，获得检测液和质控液；

21、按照1μl/cm的划膜量，300mm的划膜长度，将所述检测液和质控液分别通过划膜仪在所述初始反应板上划线，获得所述反应板。

22、进一步的，所述抗体包被稀释液包括蔗糖1％以及0.01m ph7.4 pbs缓冲液，其中，所述0.01m ph7.4 pbs缓冲液包括氯化钠0.8％、氯化钾0.02％、磷酸氢二钠0.114％、磷酸二氢钾0.027％以及纯化水。

23、进一步的，所述样品垫的宽度在22～24mm之间，长度在290～310mm之间；

24、所述结合垫的宽度在9.5～10.5mm之间，长度在290～310mm之间；

25、所述反应板的宽度为25mm，长度在295～305mm之间；

26、所述吸收垫的宽度在22～24mm之间，长度在290～310mm之间；

27、所述试纸条的宽度在3.80～3.90mm之间。

28、为了解决上述技术问题，本技术实施例还提供一种时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒的应用，采用了如下所述的技术方案：

29、一种如上所述的时间分辨荧光免疫层析法定量检测tk1的试剂盒的应用，包括如下步骤：

30、在仪器中插入与试剂批号相同的所述检测芯片；

31、将待测样本加入所述检测卡的加样孔中；

32、并将加样后的检测卡放入仪器卡槽内进行测试，获得检测结果。

33、与现有技术相比，本技术实施例主要有以下有益效果：

34、本技术属于即时检测或床旁检测(poct)类检测产品，采用时间分辨荧光免疫层系法。该方法是一种非同位素免疫分析技术，通过镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可以有效降低血清和血浆中的背景荧光信号干扰，极大的提高了分析灵敏度。时间分辨荧光免疫层析法既有普通荧光免疫层析法的有点，又解决了灵敏度低的问题，兼具方便、快捷、综合成本低等优点，在临床上得到广泛应用。