鼻分泌物中tPA在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用

鼻分泌物中tpa在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种伴鼻息肉的慢性鼻窦炎检测剂，属于鼻息肉及其预后检测领域，具体地涉及一种鼻分泌物中tpa在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用。


背景技术：

2.crswnp：慢性鼻窦炎伴鼻息肉是一种复杂且异质性的鼻窦粘膜炎症，其特征是鼻息肉的存在，估计发生在全世界1％至4％的人群中。在欧洲人和美国人中，crswnp的免疫学特征主要是以th2炎症为主；而在亚洲国家，如中国和韩国，至少有一半的crswnp患者表现为th1/th17的炎症反应。炎症分型是基于组织浸润的炎症细胞比例，嗜酸粒细胞增多是最关键的特征之一。th2炎症与鼻息肉复发有关。而嗜酸性粒细胞是预测鼻息肉复发的最有效的标志物。
3.既往有研究认为术前ct评分、鼻息肉评分、嗜酸性粒细胞、合并哮喘或过敏状态、白介素-5的表达、粘附分子表达可以预测术后鼻息肉的复发，其中，组织嗜酸性粒细胞百分比是这些指标中最有效的标志物。但是这些指标在预测鼻息肉复发方面存在一定的局限性。多数指标是在鼻息肉组织样本中检测，而鼻息肉的获得是一种有创的方法，不仅可以增加鼻腔出血，引起患者恐惧，而且会有增加感染的风险。更重要的是，这些通过鼻息肉样本检测的指标多是在鼻内镜术后被用于预测疗效，而对术前药物治疗和手术方案的选择指导意义不大。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明公开了一种鼻分泌物中tpa在制备鼻息肉及其预后检测剂中的应用。该检测剂可在对鼻腔无直接创伤的前提下，对鼻分泌物中tpa蛋白表达水平进行监控，进而判断鼻息肉是否会复发，为早期药物干预提供了重要依据。
5.为实现上述技术目的，本发明公开了一种鼻分泌物中tpa在制备鼻息肉检测剂中的应用。
6.本发明的目的之二是提供一种鼻分泌物中tpa在制备鼻息肉预后检测剂中的应用。
7.本发明的目的之三是提供一种鼻分泌物中tpa在制备伴鼻息肉的慢性鼻窦炎预后检测剂中的应用。
8.进一步地，所述检测剂包括样本预处理剂，所述样本为鼻分泌物。
9.进一步地，所述检测剂包括用于检测鼻分泌物中tpa蛋白浓度的定量检测剂。
10.进一步地，所述检测鼻分泌物中tpa蛋白浓度的定量检测剂为elisa试剂。且elisa试剂为常用商品化用于检测tpa蛋白的试剂盒。
11.进一步地，复发性鼻息肉中的tpa蛋白浓度低于非复发性鼻息肉。
12.有益效果：
13.本发明通过对鼻腔分泌物中41种指标进行检测、分析，得出tpa的表达水平对预测
鼻息肉是否复发具有重要意义，这对术前药物治疗和手术方案的选择具备指导意义。
附图说明
14.图1为复发性鼻息肉和无复发性鼻息肉的鼻分泌物中tpa表达水平示意图。
15.图2为单因素回归分析中有统计学意义的指标进行roc分析示意图。
具体实施方式
16.下面将结合附图，对本发明的具体实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明保护的范围内。
17.下述实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本文定义优先。
18.实施例1
19.实验对象及材料：
20.1、实验对象
21.华中科技大学同济医学院附属同济医院病房在2012.01至2020.01期间经临床诊断明确为双侧伴鼻息肉的慢性鼻窦炎患者。
22.其中，上述双侧伴鼻息肉的慢性鼻窦炎患者的临床诊断如下：
23.1)症状表现为鼻塞或流脓涕，伴或不伴面部疼痛/压力、嗅觉丧失；
24.2)ct显示鼻窦内黏膜增厚，中鼻道软组织影；或鼻内镜下见中鼻道荔枝样物；
25.3)病理结果显示为炎性组织。
26.2、样本收集
27.在患者进入全身麻醉后及在手术进行之前，收集患者的鼻分泌物。简单而言，棉片放入病人的双侧鼻腔，放置5分钟，之后取出棉片放于5ml ep管中，并向其中加入2ml无菌生理盐水，放置5分钟。用镊子取出棉片放于10ml注射器中，将液体挤压到另一ep管。将ep管以1500g的转速离心10分钟，然后将上清液转移到另一ep管并存于-80℃冰箱内。
28.3、鼻腔分泌物中tpa以及其他40种指标含量的检测
29.(1)tpa和charcot-leyden晶体蛋白(clc)的水平采用商用酶联免疫吸附测定试剂盒测定。本发明优选tpa的商用试剂盒型号为bosterbiotechnology,wuhan,china；clc的商用试剂盒型号为cloud-clonecorp.wuhan,china。
30.操作步骤如下：取出试剂盒中elisa检测板及试剂置于室温平衡至少30分钟；用超纯水制备1
×
洗液缓冲液，充分震荡混匀后备用。
31.蛋白标准品及检测样品的制备：蛋白标准品用样本稀释液进行梯度稀释，浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml；待测样本用样本稀释液稀释10倍并充分混匀。其中，这里的样本稀释液均指代商品化试剂盒内的
成分，其一般为包含3％bsa的pbs溶液。
32.分别设置标准品孔、待测样本孔及空白孔，其中空白孔加样本稀释液，其余步骤都相同。将待测样本及其它对照小心加至各反应孔中，避免接触孔底部，每孔加入100μl，轻轻晃动混匀并尽量避免有气泡。用封板膜封板后于37℃反应90分钟；反应后甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗；将准备好的生物素抗人tpa或clc抗体工作液每孔按100μl加入(tmb空白显色孔除外)；酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟；1
×
洗液缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μl)；按每孔90μl依次加入tmb显色液，37℃避光反应3～10分钟；按每孔100μl依次加入终止液，此时蓝色立转为黄色。用酶标仪在450nm测定o.d.值。根据标准品绘制标准曲线并计算出样品浓度。
33.(2)使用bio-plex悬浮芯片方法测量鼻腔分泌物中其他39种生物介质的蛋白质水平。
34.操作步骤如下：取出试剂盒中检测板及试剂置于室温平衡至少30分钟；用超纯水制备1
×
洗液缓冲液，充分震荡混匀后备用。
35.蛋白标准品及检测样品的制备：蛋白标准品用样本稀释液进行梯度稀释；待测样本用样本稀释液稀释10或者100倍并充分混匀。分别设置标准品孔、待测样本孔及空白孔，其中空白孔加入样本稀释液，其余步骤都相同。将待测样本及对照小心加至各反应孔中，避免接触孔底部，每孔加入100μl，轻轻晃动混匀并尽量避免有气泡。用封板膜封板后于37℃反应90分钟；反应后甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗；将准备好的生物素抗人的抗体工作液按每孔100μl加入(tmb空白显色孔除外)；酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟；1
×
洗液缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μl)；按每孔90μl依次加入tmb显色液，37℃避光反3～10分钟；按每孔100μl依次加入终止液，此时蓝色立转为黄色。用高分辨率相机拍摄，然后进行图片处理，导入q-view软件，测定斑点反应强度并生成原始数据。根据标准品绘制标准曲线并计算出样品浓度。
36.具体得到如下表1，其中，检测水平以下的细胞因子值被代表检测限1/10的值所取代。
37.表1 各指标的检查下限列表
38.指标检测下限指标检测下限指标检测下限tpa2.0pg/mlclc0.116ng/mlil-1β3.2pg/mlip-1018.8pg/mlil-1ra81.1pg/mlmcp-12.1pg/mlil-20.5pg/mlmip-1α1.4pg/mlil-42.2pg/mlmip-1β2.0pg/mlil-53.1pg/mlpdgf-bb7.0pg/mlil-62.3pg/mlrantes2.2pg/mlil-73.1pg/mltnf-α5.8pg/mlil-81.9pg/mlvegf5.5pg/mlil-92.1pg/mlil-223.88pg/mlil-102.2pg/mlil-251.0pg/mlil-123.3pg/mlil-334.18pg/mlil-133.7pg/mligg10.13pg/mlil-152.1pg/mligg22.74pg/mlil-17a4.9pg/mligg30.07pg/mleotaxin40.9pg/mligg40.02pg/mlbfgf27.2pg/mliga0.13pg/mlg-csf2.4pg/mligm0.78pg/ml
ifn-γ92.6pg/mlige0.02pg/mlgm-csf63.3pg/mlccl171.7pg/mltslp3.0pg/ml
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39.实施例2
40.鼻腔分泌物中tpa浓度和鼻息肉复发的关系
41.其中，复发方面的研究包括所有鼻息肉样本。
42.1、预后分组；
43.对上述实施例1纳入的患者进行鼻息肉切除手术，手术后采用常规丙酸氟替卡松鼻喷雾剂200μg每次，每天两次处理，与此同时，鼻腔盐水冲洗每天两次。
44.随访时间设为在患者术后第2周，第1、3、6、12个月。
45.分组：将随访者分为预后好组及预后差组，其中，预后好组也可定义为不复发鼻息肉患者，预后差组定义为复发鼻息肉患者。
46.预后好组：随访中同时符合以下条件者；
47.(1)随访1年的时间内，鼻内镜下未见息肉出现和黏膜水肿；
48.(2)随访1年的时间内，未出现脓性鼻分泌物。
49.预后差组：随访1年时间内，鼻内镜下出现鼻息肉形成，即使给予短期的口服糖皮质激素和抗生素治疗，仍有鼻息肉的形成或者粘膜的水肿，且至少出现伴有一周的令人不舒服的症状之一，如鼻塞，鼻漏，面部胀痛/压痛，以及嗅觉丧失。
50.2、鼻腔分泌物中tpa浓度可以预测鼻息肉复发；
51.运用bca法检测每份样本的总蛋白浓度，用以校正指标。其中tpa在复发组、不复发组鼻息肉中的表达见图1。结合图1可知，复发性鼻息肉中的tpa蛋白浓度低于非复发性鼻息肉。
52.实施例3
53.从41个检测指标中筛选出预测复发的方法
54.1、对41个检测指标进行单因素回归分析；
55.对实施例1表1所示的41个检测指标进行单因素回归分析，得到表2；
56.表2 单因素回归分析结果列表
57.[0058][0059]
结合表2可知，上调的clc、mip-1α、mip-1β、ccl17和ige水平以及下调的tpa水平与鼻息肉的复发相关。
[0060]
进一步的对clc、mip-1α、mip-1β、ccl17、ige及tpa这6个指标进行roc分析，得到图2；
[0061]
结合图2可知，clc预测鼻息肉复发的auc为0.710，mip-1α预测鼻息肉复发的auc为0.672，mip-1β预测鼻息肉复发的auc为0.762，ccl17预测鼻息肉复发的auc为0.740，ige预
测鼻息肉复发的auc为0.637，tpa预测鼻息肉复发的auc为0.881，由此可知，tpa的曲线下面积最大，即tpa的显著下调可以增加鼻息肉复发的预测价值(auc＝0.881)。
[0062]
进一步的结合图2所示的roc曲线，计算预测鼻息肉复发的最佳截断值，得到表3。
[0063]
表3 roc曲线的评价列表
[0064][0065]
结合表3可知，采用本发明设计的roc曲线得到的预测因子准确度较高，即鼻分泌物中tpa含量能够较准确的预测鼻息肉复发性。
[0066]
以上实施例仅为最佳举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。除上述实施例外，本发明还有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。