一种可在全自动生化分析仪上进行人血清中农药检测的试剂盒的制作方法

1.本发明涉及农药检测技术领域，尤其涉及一种可在全自动生化分析仪上进行人血清中农药检测的试剂盒。


背景技术：

2.目前，农药的主要检测方法为胆碱酯酶抑制法和气相色谱-质谱法，其中胆碱酯酶抑制法主要用于果蔬农残检测，通过对果蔬叶片残留农药进行提取，加入到配制好的反应液中进行显色反应，通过紫外分光光度计进行吸光度测定，判断农药含量；人血清中农药检测主要是气相色谱-质谱法，通过对血清进行沉淀离心、萃取、提纯浓缩、复溶最后注入气相色谱-质谱进行检测。两种方法操作步骤多为手动操作处理，过程较繁琐。
3.鉴于农药的剧毒性及其对环境和人类健康的巨大威胁，发展高效率和高准确性的农药残留检测方法尤为重要。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少克服上述现有技术的缺点与不足其中之一，提供一种可在全自动生化分析仪上进行人血清中农药检测的试剂盒。本发明目的基于以下技术方案实现：
5.本发明提供了一种可在全自动生化分析仪上进行人血清中农药检测的试剂盒，包括试剂1、试剂2和试剂3，所述试剂1包括胆碱酯酶、铁氰化钾，所述试剂2包括丁酰硫代胆碱，所述试剂3包括可使人血清中胆碱酯酶失活的物质。
6.本发明的反应原理及设计思路如下：
7.1)反应原理
8.丁酰硫代胆碱+胆碱酯酶——硫代胆碱
9.硫代胆碱+铁氰化钾——亚铁氰化钾(铁氰化钾在405nm有吸光度，随着铁氰化钾消耗，吸光度降低)
10.农药可抑制胆碱酯酶的活性，减弱后面的反应。
11.2)设计思路
12.该试剂盒校准品以灭活的血清为基质，加入不同浓度梯度的农药作为校准品，进行定标，检测时血清样本同样进行灭活处理，除去血清中的胆碱酯酶干扰，然后进行检测。
13.优选地，所述试剂1中胆碱酯酶的浓度为5～15ku/l，铁氰化钾的浓度为1～3g/l，所述试剂2中丁酰硫代胆碱的浓度为1～3g/l。
14.优选地，所述试剂1中胆碱酯酶的浓度为10ku/l，铁氰化钾的浓度为2g/l，所述试剂2中丁酰硫代胆碱的浓度为2g/l。
15.优选地，所述试剂3包括丙酮或0.3～0.6g/l的叠氮钠的丙酮溶液。叠氮钠具有优良的防腐杀菌性能，可用于防酶，血清防腐。
16.优选地，所述试剂1与试剂2的体积比例为3.5～4.5：1。
17.优选地，本发明的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
18.s1、在人血清中加入试剂3，混匀后静置一段时间使血清中胆碱酯酶失活，离心取上清；
19.s2、在上清中加入试剂1和试剂2反应一段时间，其中，试剂1、试剂2与上清的体积比例为3.5～4.5：1：0.1～0.2；
20.s3、反应结束后，读取反应液的吸光度，与定标曲线对比得到农药含量。
21.优选地，所述定标曲线的绘制方法包括：
22.1)取不同浓度梯度的农药，分别加入正常血清中，配制得到一系列标准品，加入试剂3，混匀后静置一段时间，离心取上清；
23.2)在上清中加入试剂1和试剂2反应一段时间，其中，试剂1、试剂2与上清的体积比例为3.5～4.5：1：0.1～0.2；
24.3)反应结束后，读取反应液的吸光度，绘制吸光度关于农药浓度的定标曲线。
25.优选地，所述定标曲线的定标方式为5点定标法。
26.优选地，所述农药包括敌敌畏、氧乐果、甲胺磷、丙溴磷、克百威、甲萘威中的一种或多种。
27.优选地，本发明对敌敌畏的检测范围为10-160ug/l，对氧乐果的检测范围为25-800ug/l，对甲胺磷的检测范围为0.2-3.2mg/l，对丙溴磷的检测范围为6.25-400ug/l，对克百威的检测范围为20-160ug/l。
28.本发明可至少取得如下有益效果其中之一：
29.本发明以胆碱酯酶抑制法为原理，通过前处理将血清中胆碱酯酶灭活处理，从而实现在全自动生化分析仪上进行血清中农药的检测，大大缩短检测时间，提高检测效率及降低检测成本，同时精准度高，试剂稳定性好。
30.本发明可对人血清中敌敌畏、氧乐果、甲胺磷、丙溴磷、克百威、甲萘威等农药进行检测，检测范围广，结果稳定可靠。
附图说明
31.图1为本发明优选实施例中6种农药的定标曲线图：(1)敌敌畏，(2)氧乐果，(3)甲胺磷，(4)丙溴磷，(5)克百威，(6)甲萘威；
32.图2为本发明优选实施例中敌敌畏浓度检测值与理论值的线性关系图；
33.图3为本发明优选实施例中氧乐果浓度检测值与理论值的线性关系图；
34.图4为本发明优选实施例中甲胺磷浓度检测值与理论值的线性关系图；
35.图5为本发明优选实施例中丙溴磷浓度检测值与理论值的线性关系图；
36.图6为本发明优选实施例中克百威浓度检测值与理论值的线性关系图；
37.图7为本发明优选实施例中甲萘威浓度检测值与理论值的线性关系图。
具体实施方式
38.下面将结合本发明的实施例中的附图，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有
其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本发明提供了一种可在全自动生化分析仪上进行人血清中农药检测的试剂盒，包括试剂1、试剂2和试剂3，试剂1包括胆碱酯酶、铁氰化钾，试剂2包括丁酰硫代胆碱，试剂3包括可使人血清中胆碱酯酶失活的物质，例如丙酮或0.3～0.6g/l的叠氮钠的丙酮溶液。其中，试剂1中胆碱酯酶的浓度为5～15ku/l，铁氰化钾的浓度为1～3g/l，试剂2中丁酰硫代胆碱的浓度为1～3g/l；试剂1与试剂2的体积比例为3.5～4.5：1。优选地，试剂1中胆碱酯酶的浓度为10ku/l，铁氰化钾的浓度为2g/l，试剂2中丁酰硫代胆碱的浓度为2g/l。
40.本发明的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
41.s1、在人血清中加入等体积的试剂3，混匀后静置10分钟，使血清中胆碱酯酶失活，离心取上清；
42.s2、在上清中加入试剂1和试剂2反应一段时间，其中，试剂1、试剂2与上清的体积比例为3.5～4.5：1：0.1～0.2；
43.s3、反应结束后，读取反应液的吸光度，与定标曲线对比得到农药含量。
44.其中，定标曲线的绘制方法包括：
45.配制含有一定浓度梯度的农药的一系列正常血清标准品，加入等体积的试剂3，混匀后静置10分钟，离心取上清；按照试剂盒的使用方法相同的操作，在上清中加入试剂1和试剂2反应一段时间，反应结束后，读取反应液的吸光度，采用5点定标法绘制吸光度关于农药浓度的定标曲线。本发明所述正常血清指不含农药成分的血清。
46.本发明以胆碱酯酶抑制法为原理，通过前处理将血清中胆碱酯酶灭活处理，从而实现在全自动生化分析仪上进行血清中农药的检测，大大缩短检测时间，提高检测效率及降低检测成本，同时精准度高，试剂稳定性好。
47.本发明可对人血清中敌敌畏、氧乐果、甲胺磷、丙溴磷、克百威、甲萘威等农药进行检测，检测范围广，结果稳定可靠。
48.具体实施过程如下。
49.一、本发明的反应原理及设计思路
50.1)反应原理
51.丁酰硫代胆碱+胆碱酯酶——硫代胆碱
52.硫代胆碱+铁氰化钾——亚铁氰化钾(铁氰化钾在405nm有吸光度，随着铁氰化钾消耗，吸光度降低)
53.农药可抑制胆碱酯酶的活性，减弱后面的反应。
54.2)设计思路
55.该试剂盒校准品以灭活的血清为基质，加入不同浓度梯度的农药作为校准品，进行定标，检测时血清样本同样进行灭活处理，除去血清中的胆碱酯酶干扰，然后进行检测。
56.二、实验仪器、试剂及样品准备
57.农药样品：敌敌畏样品20mg/l，氧乐果样品50mg/l，甲胺磷样品50mg/l，丙溴磷样品50mg/l，克百威样品20mg/l，甲萘威样品30mg/l。
58.血清样本：正常血清样本40例。
59.试剂1(r1)：10ku/l胆碱酯酶；2g/l铁氰化钾；
60.试剂2(r2)：2g/l丁酰硫代胆碱；
61.试剂3(r3)：丙酮。
62.实验仪器：奥林巴斯au400生化仪。
63.实施例1：定标曲线的配制
64.1、校准品准备：
65.取5
×
6支1.5ml ep管，按以下方法配制：
66.敌敌畏校准品的配制方法如表1：
67.表1
68.编号12345血清体积/ul500499498496492敌敌畏标准品/ul01248敌敌畏终浓度040ug/l80ug/l160ug/l320ug/l
69.氧乐果校准品的配制方法如表2：
70.表2
71.编号12345血清体积/ul500498496492484氧乐果标准品/ul024816氧乐果终浓度0200ug/l400ug/l800ug/l1600ug/l
72.甲胺磷校准品的配制方法如表3：
73.表3
74.编号12345血清体积/ul500490480460420甲胺磷标准品/ul010204080甲胺磷终浓度01000ug/l2000ug/l4000ug/l8000ug/l
75.丙溴磷校准品的配制方法如表4：
76.表4
77.编号12345血清体积/ul500499.5499498496丙溴磷标准品/ul00.5124丙溴磷终浓度050ug/l100ug/l200ug/l400ug/l
78.克百威校准品的配制方法如表5：
79.表5
[0080][0081][0082]
甲萘威校准品的配制方法如表6：
[0083]
表6
[0084]
编号12345血清体积/ul600598596592584甲萘威标准品/ul024816甲萘威终浓度0100ug/l200ug/l400ug/l800ug/l
[0085]
将处理好的1-5号校准品分别加入等体积试剂3(r3)，混匀后静置10分钟，离心取上清(此步骤为血清灭活，目的为去除血清中胆碱酯酶的活力，防止对反应造成干扰)，此时5支校准品敌敌畏浓度分别为(如表7)：
[0086]
表7
[0087]
编号12345敌敌畏终浓度020ug/l40ug/l80ug/l160ug/l氧乐果终浓度0100ug/l200ug/l400ug/l800ug/l甲胺磷终浓度0500ug/l1000ug/l2000ug/l4000ug/l丙溴磷终浓度025ug/l50ug/l100ug/l200ug/l克百威终浓度020ug/l40ug/l80ug/l160ug/l甲萘威终浓度050ug/l100ug/l200ug/l400ug/l
[0088]
2、定标
[0089]
au400生化仪检测参数：
[0090]
样本比例(体积比)：r1：r2：样本＝200：50：8，处理过程：r1+样本在37℃孵育5min后，加入r2；
[0091]
波长：410nm；
[0092]
读点：14/27，fixed；
[0093]
定标方式：5点定标，poly。具体方法见表8。
[0094]
表8
[0095][0096]
6种农药的定标曲线见图1中(1)～(6)。
[0097]
实施例2：临床测试
[0098]
1.样本准备
[0099]
灭活血清准备：准备50ml混合人血清，加入等体积的试剂3，混匀后静置10分钟，离心取上清。
[0100]
阳性样本准备：取多只1.5ml ep管，每支加入1ml灭活血清，然后按表9加入不同农药达到所需浓度，作为阳性样本。
[0101]
表9
[0102][0103][0104]
阴性样本准备：取40例正常人血清，分别加入等体积的试剂3，混匀后静置10分钟，离心取上清。
[0105]
2.正确度及精密度测试
[0106]
方法：每种农药取低中高三个浓度的阳性样本，按照体积比r1：r2：样本＝200：50：8处理后进行测试，分别重复测定10次，测试结果列于表10，计算与靶值偏差及cv值。
[0107]
表10
[0108]
[0109][0110]
分析：测试6种农药的阳性样本，各样本测试结果与靶值偏差及重复性cv值均在5％以内。以上结果表明，本发明提供的试剂盒具有准确度高、精密度高的优点，对含低中高浓度农药的血清均具有准确的检测结果，适合临床应用。
[0111]
3.正常血清样本测试
[0112]
方法：取40例灭活的正常人血清(即阴性样本)，按照体积比r1：r2：样本＝200：50：8处理后进行测试，测试结果列于表11，计算阳性率。
[0113]
表11
[0114][0115][0116]
分析：测试40例正常血清结果均为阴性。结果表明，本发明提供的试剂盒，能够正确区分正常人血清和含农药的血清，测量结果准确可靠。
[0117]
实施例3：试剂检测范围测试
[0118]
方法：取准备好的每种农药的阳性样本10支，按照体积比r1：r2：样本＝200：50：8处理后进行测试，每支重复测定3次，测试结果分别列于表12～17，计算线性范围。
[0119]
表12
[0120][0121]
分析：在10-160ug/l范围内线性较好，对敌敌畏的检测范围为10-160ug/l。线性关系图见图2。
[0122]
表13
[0123][0124]
分析：在25-800ug/l范围内线性较好，对氧乐果的检测范围为25-800ug/l。线性关
系图见图3。
[0125]
表14
[0126][0127]
分析：在0.2-3.2mg/l范围内线性较好，对甲胺磷的检测范围为0.2-3.2mg/l。线性关系图见图4。
[0128]
表15
[0129][0130]
分析：在6.25-400ug/l范围内线性较好，对丙溴磷的检测范围为6.25-400ug/l。线性关系图见图5。
[0131]
表16
[0132][0133][0134]
分析：在20-160ug/l范围内线性较好，对克百威的检测范围为20-160ug/l。线性关系图见图6。
[0135]
表17
[0136][0137]
分析：在6-400ug/l范围内线性较好，对甲萘威的检测范围为6-400ug/l。线性关系图见图7。
[0138]
以上结果表明，本发明提供的试剂盒的准确度高、线性范围广，有利于临床使用。
[0139]
实施例4：试剂稳定性检测
[0140]
方法：将试剂分成两份，分别放在4℃、37℃条件下，在第3天、第7天时将4℃、37℃试剂同时定标测样。选用敌敌畏校准品、加标样本(以正常血清为基质，加入对应不同浓度
的校准品)及正常样本(随机取5支正常血清样本)进行测试，即按照相同的方法对敌敌畏校准品进行定标，得到定标曲线，然后对加标样本中的农药浓度和正常样本进行测试。测试结果列于表18，比较结果差异。
[0141]
表18
[0142][0143]
分析：试剂在37℃加热7天后，定标及测样与4℃的数据无明显差异。结果表明，本发明提供的试剂盒具有较高的稳定性，有利于临床使用。
[0144]
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。