一种放射损伤标志物BPIFA2的应用及其相关试剂盒及试剂

一种放射损伤标志物bpifa2的应用及其相关试剂盒及试剂
技术领域
1.本发明属于核辐射损伤检测技术领域，具体涉及一种放射损伤标志物bpifa2的应用及其相关试剂盒及试剂。


背景技术：

2.核辐射事故发生后，大批量放射伤员的快速伤情分类是核事故医学救援中的重要任务，是合理利用医疗资源，实现高效医学救治的关键。不同损伤程度急性放射病的救治方案不同，致死性放射损伤人员是核事故医学救援中第一优先级的需救治人员。故而，核事故早期现场医学救援的核心任务有两个：一是准确判断人员是否受照；二是在受照伤员中，识别致死性放射损伤人员。
3.针对事故后伤情评估主要依赖于物理剂量和生物剂量两种方法。由于核与辐射事故发生的突发性，大多数伤员不会随身佩戴物理剂量计，无法立即获得物理剂量。而且不同个体的放射敏感性存在明显的差异，物理剂量不能反映个体实际损伤情况。所以放射生物剂量计对于核事故后批量伤员的伤情分类更具有实际的应用价值。目前用于判断人员损伤程度的放射生物剂量计主要为以淋巴细胞计数分析，淋巴细胞染色体畸变分析和淋巴细胞γ-h2ax分析为代表的分子生物剂量计。作为金标准方法，染色体畸变、微核等细胞遗传学生物剂量估算技术，在0.5-6gy范围内具有较高的准确性和特异性。近年来，染色体分析技术实现了细胞收获、制片及分析的自动化，解决了标本制备和分析人工操作通量低的问题，但是仍然需要48小时细胞培养，剂量上限仍然未突破6gy(abe y,yoshidama,fujiokak,kurosuy,ujiie r,yanagia,et al.dose-response curves for analyzing ofdicentric chromosomes and chromosome translocations following doses of 1000mgy or less,based on irradiatedperipheral blood samples from five healthy individuals.j radiat res.2018；59(1):35-42.)(jang ma,han ea,lee jk,cho kh,shin hb,lee yk.dose estimation curves following in vitro x-ray irradiation using blood from four healthy korean individuals.ann lab med.2019；39(1):91-5.)。电离辐射引起外周血淋巴细胞数剂量依赖性下降，照射后12-48小时范围内的淋巴细胞计数分析用于放射损伤伤员的分类。该方法速度快、操作简单，但依然无法实现照射后12小时以内的伤情分类(thierens h,vrala.the micronucleus assay in radiation accidents.ann ist super sanita.2009；45(3):260-4.)(benderitter m,durand v,caux c,voisin p.clearance ofradiation-induced apoptotic lymphocytes:ex vivo studies and an in vitro co-culture model.radiat res.2002；158(4):464-74.)(pandey bn,kumara,ali m,mishrakp.bystander effect ofconditioned medium from low and high doses ofgamma-irradiated human leukemic cells on normal lymphocytes and cancer cells.j environ pathol toxicol oncol.2011；30(4):333-40.)。γ-h2ax是dna双链断裂标志分子，对电离辐射有较好的特异性反映，作为放射损伤标志物的研究较为系统。利用人外周血淋巴细胞和动物模型开展较为系统的时间效应和剂量效应研究，基本建立了淋巴细
胞焦点分析、流式细胞分析等分析方法。同时，高通量检测技术的实现，可用于大批量伤员是否受照射的早期筛查技术。然而γ-h2ax焦点数目随着dna损伤修复呈现明显的时间动态变化，在照射后数分钟开始增加，1小时左右达到高峰，而后逐渐下降，检测窗口期很短，故而其应用受到很大限制(reitsema tj,banath jp,macphail sh,olive pl.hypertonic saline enhances expression ofphosphorylated histone h2ax after irradiation.radiat res.2004；161(4):402-8.)(andrievskia,wilkins rc.the response ofgamma-h2ax in human lymphocytes and lymphocytes subsets measured in whole blood cultures.int j radiat biol.2009；85(4):369-76.)(wang z,hu h,hu m,zhang x,wang q,qiao y,et al.ratio of gamma-h2ax level in lymphocytes to that in granulocytes detected using flow cytometry as a potential biodosimeter for radiation exposure.radiat environ biophys.2014；53(2):283-90.)。综合来看，现有技术均需要精密仪器才可实现大批量检测，无法实现事故现场的及时检测。最重要的一点，目前的检测均无法实现对致死性放射损伤的早期识别。
4.血清内含无机盐，氧，代谢产物，激素，酶和抗体等多种组分，是细胞间信息传递的重要介质，具有营养组织，调节器官活动，防御有害物质和维持内环境稳态的作用。各器官的生理和病理变化，往往引起血清成分的改变，故血清是机体健康状态的晴雨表，其检测在临床诊断上有重要意义。作为一种外源性刺激，电离辐射可以引起造血、免疫、肠道等放射敏感组织细胞发生细胞凋亡、坏死等，尤其是遭受大剂量照射后，会导致细胞质膜完整性的短暂改变甚至丧失。因此，通常仅在细胞内表达或发现的三磷酸腺苷(atp)、高迁移率组蛋白b1(hmgb1)、dna、rna尿酸分子等多种物质会从受损细胞中泄漏出来，进入体液循环(mavragani iv,laskaratou da,frey b,candeias sm,gaipl us,lumniczky k,et al.key mechanisms involved in ionizing radiation-induced systemic effects.a current review.toxicol res(camb).2016；5(1):12-33.)，造成血清组分的改变。现有文献报道参与干细胞分化和增殖的细胞因子flt3配体(fl)在受照后猕猴血清中剂量依赖性增加，可作为放射诱导骨髓再生障碍的指标(bertho j m,demarquay c,frick j et al.level of flt3-ligand inplasma:apossible new bio-indicator for radiation-induced aplasia.[j].int j radiat biol,2001,77:703-12.)；作为小肠上皮细胞的代谢终产物的瓜氨酸在8
–
12gy受照后84h内小鼠血浆中剂量依赖性减少，因此瓜氨酸检测可以用来量化单次放疗后急性小肠上皮放射性损伤(lutgens ludy c h w,deutznicolaas e p,gueulette john et al.citrulline:aphysiologic marker enabling quantitation and monitoring ofepithelial radiation-induced small bowel damage.[j].int jradiat oncol biol phys,2003,57:1067-74.)。上述报道进一步说明从血清中寻找放射损伤生物标志物的可行性。故而，能否从辐射诱导的血清变化中发现一种早期损伤和致死性损伤标志分子，并有效指导伤员的救治与愈后评估，非常值得探索。
[0005]
bpifa2是一种主要在唾液腺尤其是腮腺细胞外区域分泌的可溶性唾液蛋白，属plunc蛋白家族。其编码基因位于人20号染色体，包含9个外显子，cds区全长750bp，编码250个氨基酸蛋白序列。小鼠bpifa2编码基因位于2号染色体，包含9个内含子，cds区(蛋白编码区)全长708bp，编码236个氨基酸蛋白序列。bpifa2是一种唾液表面活性剂，维持小鼠唾液表面张力，并且可以与lps结合抑制细菌生长。此外，肾祖细胞分泌的bpifa2分子可以逆转
lps诱发急性肾损伤过程中肾脏内皮细胞的emt(epithelial-mesenchymal transition，上皮细胞间充质转化)过程，促进内皮细胞功能恢复和肾脏组织修复，保护急性肾损伤中的内皮细胞功能。近年研究发现bpifa2可作为一些疾病的生物标志物。例如，在牙周炎患者唾液中bpifa2的表达水平低于正常人(wu ying,shu rong,liu hongwei,[comparison ofproteomic profiles ofwhole unstimulated saliva obtained from generalized aggressive periodontitis patients and healthy controls].[j].hua xi kou qiangyi xue za zhi,2011,29:519-21,525.)；在感染巨细胞病毒或分枝杆菌的免疫缺陷病毒患者中，bpifa2的表达增加(da silvaaa,bingle l,speight pm et al.plunc protein expression in major salivary glands ofhiv-infected patients.[j].oral dis,2011,17:258-64.)。2017年发现在急性肾损伤病人肾脏组织和血浆中bpifa2表达水平均增高，可作为急性肾损伤早期的生物标志物分子(kota sk,pernicone e,leafde,stillman ie,waikar ss,kota sb.bpi fold-containing family a member 2/parotid secretory protein is an earlybiomarker ofaki.jam soc nephrol,2017,28(12):3473-3478.)；在2019年发现bpifa2不仅是脓毒症诱导的急性肾损伤预后中有用的生物标志物，而且有助于阻止早期纤维化的进展和慢性肾脏疾病的发展(sallustio f,stasia,curci c,divella c,picernoa,franzin r,palma gd,rutigliano m,lucarelli g,battaglia m,staffieri f,crovace a,pertosa gb,castellano g,gallonea,gesualdo l.renal progenitor cells revert lps-induced endothelial-to-mesenchymal transitionby secreting cxcl6,saa4,and bpifa2 antiseptic peptides.faseb j,2019,33(10):10753-10766.)。故探究bpifa2是否可以作为事故早期预判致死性放射损伤的潜在生物标志物分子对于核辐射事故发生后，大批量放射伤员的快速伤情分类，合理利用医疗资源，实现高效医学救治具有重要意义。


技术实现要素：

[0006]
本发明为解决现有的生物剂量计基本可以实现6gy以下剂量照射后少数人群是否受照的早期诊断筛查，但不适于事故现场大批量人群的放射损伤的早期识别的问题，提供了一种用于放射损伤人员早期评价的标志物，所述标志物为bpifa2，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0007]
本发明还提供了一种用于致死性放射损伤预判的标志物，所述标志物为bpifa2，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
[0008]
本发明还提供了一种放射损伤标志物在如下1)-5)任一的应用，所述标志物为bpifa2，其氨基酸序列如seq id no.1所示；
[0009]
1)在放射损伤人员早期评价中的应用；
[0010]
2)在制备放射损伤人员早期评价的试剂盒中的应用；
[0011]
3)在致死性放射损伤预判中的应用；
[0012]
4)在制备致死性放射损伤预判的试剂盒中的应用；
[0013]
5)在构建致死性放射损伤预测模型中的应用。
[0014]
进一步地限定，所述应用为检测体内血清中bpifa2的表达水平。
[0015]
进一步地限定，所述应用早期为照射后6小时内，优选为1小时，2小时，4小时。
[0016]
进一步地限定，所述应用血清中bpifa2水平的二次增加指示致死性放射损伤。
[0017]
进一步地限定，所述应用二次增加是指在待测个体受到放射后24小时血清bpifa2水平下降，于放射后3天再次增加。
[0018]
本发明还提供了一种放射损伤人员早期评价或致死性放射损伤预判的试剂盒或试剂，包括用于特异性检测bpifa2的抗体。
[0019]
进一步地限定，所述试剂盒或试剂能够识别的放射剂量范围为0.5gy-10 gy，时间范围为放射后的1h-12h。
[0020]
本发明的有益效果：
[0021]
本发明对照射后小鼠血清中bpifa2水平的动态监测研究发现，在0-10gy剂量范围内，小鼠血清中bpifa2水平在照射后1h均有升高，并持续至12h，在受照后1d时不同程度的回落。尤其在10gy致死剂量照射后1h，血清中bpifa2的水平即达到峰值。局部照射实验证实了bpifa2在血清中的表达升高与是否受照和受照面积有关，照射部位对其无明显影响。所以受照后小鼠血清bpifa2对电离辐射具有较强的敏感性，其在血清中浓度的变化与机体是否受照密切相关，可作为事故早期尤其是12h以内判断伤员是否受照的重要生物指标。血清bpifa2对辐射的响应与传统的淋巴细胞计数和γ-h2ax foci检测相当，均在受照后1h显著变化，但，bpifa2作为血清蛋白更容易实现事故现场批量快检，且检测时间窗口比γ-h2ax更广泛，在大规模核辐射事故后的医疗救援中更具有应用价值。
[0022]
本发明持续监测了致死和亚致死剂量照射后7d内bpifa2的动态变化，发现在照射后第一天致死和亚致死剂量组小鼠血清bpifa2水平均先升高后降低，而后亚致死组bpifa2水平持续降低至检测不到，而致死剂量组小鼠血清中bpifa2水平在受照后3d呈现显著的再次升高。提示我们受照后血清bpifa2二次升高可作为致死性放射损伤的早期生物标志物。这一指标比mirna更易于检测；比血清saa1二次升高更早、更灵敏，为辐射后伤员的诊断与治疗争得了宝贵的时间。
[0023]
总之，本研究通过构建全身与局部照射小鼠模型探索了照射后7d内小鼠血清bpifa2浓度的变化，发现在照射后早期12h内小鼠血清中bpifa2水平显著升高与损伤程度密切相关，说明血清bpifa2升高可在大规模核事故后第一时间批量准确识别受照人员。致死剂量照射后3天小鼠血清中bpifa2水平出现明显的二次升高与小鼠死亡密切相关，说明事故后伤员血清bpifa2二次升高作为准确识别致死性放射损伤伤员的早期生物标志物。受照后血清bpifa2的动态变化可有效指导急性放射损伤的诊断与伤情分类，合理利用医疗资源，更好的实现高效医学救治，将人员伤亡降至最低。
附图说明：
[0024]
图1为目的基因扩增琼脂糖凝胶电泳图；
[0025]
图2为重组质粒序列对比结果图；
[0026]
图3为western blot检测0.8mm iptg诱导的重组bpifa2的表达情况图；
[0027]
图4为重组蛋白的鉴定和纯化结果图；其中，图4中的a为0.8mm iptg诱导的大肠杆菌裂解后通过westernblot检测重组bpifa2的表达结果图，样品装载顺序为:bsa、pgex-4t-ab1、marker、上清、2m尿素裂解包涵体、包涵体-1(8m尿素裂解包涵体，2倍稀释)、包涵体-1(8m尿素裂解包涵体，10倍稀释)；图4中的b为亲和层析柱纯化包涵体蛋白western blot检
测结果图，样品装入顺序为：bsa、标记物、包涵体、洗脱液、基质、洗脱液-1(150mm咪唑洗脱液2倍稀释)、洗脱液-2(300mm咪唑洗脱液2倍稀释)；
[0028]
图5为采用elisa法检测血清抗体效价的结果图，稀释后的兔血清分别为1:1000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000；
[0029]
图6为抗体特异性检测结果图；
[0030]
图7为western blot检测小鼠腮腺、胸腺、肝、肾组织中bpifa2的表达水平图；
[0031]
图8为不同剂量tbi照射后小鼠体重变化及存活率图；其中，图8中的a为不同剂量tbi照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d小鼠体重变化图；图8中的b为不同剂量bti照射后小鼠的存活率图；
[0032]
图9为不同剂量tbi照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d后的淋巴细胞计数结果图，数据为n≥5只小鼠的均值
±
sd；
[0033]
图10为采用western blot检测不同剂量tbi照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d后血清中bpifa2表达结果图，对照组为考马斯亮蓝染色；
[0034]
图11为图10中western blot条带密度分析结果图，n≥5，p＜0.05：*，p＜0.01：**，p＜；0.001：***；
[0035]
图12为亚致死和致死辐射后小鼠体重和存活率统计结果图；其中，图12中的a为0gy、6.5gy、10gy照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d或小鼠体重的变化图；图12中的b为0gy、6.5gy、10gy照射4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d后小鼠的存活率统计结果图；
[0036]
图13为0gy、6.5gy、10gy照射后-4d、12h、1d、3d、5d、7d淋巴细胞计数结果图，数据为n≥5只小鼠的mean
±
sd；
[0037]
图14为0gy、6.5gy、10gy照射后-4d、12h、1d、3d、5d、7d后western blot检测血清中bpifa2的表达结果图，对照为考马斯亮蓝染色；
[0038]
图15为图14中western blot条带密度分析结果图，n≥5，p＜0.05：*，p＜0.01：**，p＜0.001：***；
[0039]
图16为局部照射的小鼠模型示意图；
[0040]
图17为pbi照射后小鼠体重及存活率统计结果图；其中，图17中的a为pbi照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d小鼠体重的变化图；图17中的b为pbi照射后-4d、1h、2h、4h、6h、8h、12h、1d小鼠的存活率统计结果图；
[0041]
图18为pbi照射后-4d、3h、6h、12h和1d的淋巴细胞计数分析图；
[0042]
图19为pbi照射后-4d、3h、6h、12h、1dwestern blot检测血清中bpifa2表达结果图，对照为考马斯亮蓝染色；
[0043]
图20为图19中western blot条带密度分析图，n≥5，p＜0.05：*，p＜0.01：**，p＜0.001：***。
具体实施方式
[0044]
以下结合具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。本发明所使用的药品、试剂、仪器、设备等如无特殊说明，均可通过商业化途径购买获得，涉及的pcr扩增等分子生物学实验操作如无特殊说明，均为本领域常规实验操作或依照相应试剂的产品说明书进行。
[0045]
下述实施例中所用的实验动物为：
[0046]
spf级6月龄雌性日本大耳兔及8周龄c57bl/6j小鼠，均购买自斯贝福(北京)生物技术有限公司并饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心。饲养环境按照动物保健机构和北京市《实验动物管理条例》规定标准执行，光照周期为12小时/12小时；温度保持18-23℃；湿度为40-60％。所有动物实验均经北京放射医学研究所动物护理和使用委员会批准，编号为iacuc-dwzx-2020-548。
[0047]
实施例1：动物实验检测照射后不同时间点血清中bpifa2表达的动态变化。
[0048]
1、全身照射、局部照射及样本处理
[0049]
(1)全身照射实验：小鼠随机分为7组，每组8只置于有机玻璃固定盒内，于距离钴源3米处分别接受0gy、0.5gy、1gy、2gy、4gy、6.5gy、10gy的
60
co-γ全身照射，剂量率为63.88cgy/min。在照射前-4d、照射后1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h、1d、3d、5d及7d采集尾静脉血。
[0050]
(2)局部照射实验：所有小鼠按照200μl/20g剂量标准腹腔注射1％水合氯醛麻醉后随机分为3组：全身照射组(tbi)10只、头部照射组(pbi-1)10只及屏蔽头部照射组(pbi-2)10只；于距离钴源3米处暴露于10gy 60
co-γ照射，剂量率为63.88cgy/min。在照射前-4d、照射后3h、6h、12h及1d采集尾静脉血。
[0051]
(3)样本处理：小鼠尾静脉血20μl加入含480μl稀释液(m-52d稀释液，迈瑞，中国)的1.5ml离心管中，混合均匀后利用全自动血细胞分析仪(bc-5000，迈瑞，中国)对血细胞计数；另取40μl尾静脉血采集到1.5ml离心管中后4℃静置1小时，5000rpm离心10min后取上清(血清)至另一离心管中，-80℃条件保存。
[0052]
2、bpifa2表达量检测与分析
[0053]
(1)重组质粒构建
[0054]
参考ncbi数据库中bpifa2基因序列(seq id no.2)设计目的条带pcr扩增引物：获得的上游引物bpifa2-f1的核苷酸序列如seq id no.3所示(gagaacctatacttccaaggaccctctgaagctgtccctcagaacctg)，下游引物bpifa2-r的核苷酸序列如seq id no.4所示(atgatgcggccgctcgag-gagggcaagttgtacctgtcctgc)。利用gloria nova hs 2x hf master mix(rk20715，abclonal)进行目的条带扩增：94℃4min；94℃40s，58℃30s，72℃1min，共35个循环。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，纯化回收(aftspin multifunction dnapurification kit，rk30100，abclonal)。利用同源臂连接到pgex-4t-ab1载体(购自abclonal)上(2x multif seamless assembly mix，rk21020，abclonal)。连接产物转化dh5α感受态细胞加入无抗生素的lb培养基复苏后涂布于含有卡那霉素的lb固体培养基37℃恒温培养过夜。挑取菌落于含有卡那霉素的lb培养基在37℃，220rpm摇床过夜培养后进行质粒提取。重组质粒送金开瑞生物工程有限公司测序确定。
[0055]
(2)原核蛋白的诱导表达
[0056]
pgex-4t-ab1重组质粒转化后的e.coli rosetta在含有卡那霉素的lb液体培养基中培养至对数生长期，加入0.8mm iptg 37℃诱导4h。将诱导后菌液超声破碎，分别收集上清液与沉淀通过sds-page电泳及考马斯亮蓝染色检测重组蛋白。
[0057]
(3)动物免疫
[0058]
将亲和层析柱纯化的重组蛋白作为免疫原皮下注射到实验兔子体内进行免疫，首
次使用完全弗式佐剂，免疫剂量为0.3mg，接下来在第一次免疫后第12、26、40及54天使用不完全弗式佐剂对实验兔进行再次免疫原注射，免疫原剂量为0.15mg，在第66天进行心脏取血并分离血清测试抗体效价。具体过程见表1。
[0059]
表1动物免疫操作
[0060][0061]
(4)酶联免疫吸附测定
[0062]
将蛋白样品用尿素稀释至2ug/ml并包被于酶标板，每孔100μl，4℃过夜。次日用pbst洗涤3次后30℃封闭2h。pbst再次洗涤3次后加入梯度稀释的兔子血清，在37℃封闭2h，同时设计阴、阳性对照及空白孔。pbst洗涤3次后加入100μl兔二抗(1∶8000稀释，111-035-045，jackson immunoresearch，美国)，37℃反应45min；pbst洗涤3次后加入tmb显色液(p0209-100ml，碧云天，中国)，室温避光反应10min。每孔加入100μl终止液终止反应，酶标仪读取各孔的od
450 nm处吸光值。
[0063]
(5)蛋白提取及western blot检测
[0064]
c57bl/6j雌性小鼠摘除眼球采集外周血至1.5ml离心管中，4℃静置1h后5000rpm离心10分钟分离小鼠血清；同时颈部脱臼法处死小鼠，采集小鼠腮腺、胸腺、肝脏及肾脏组织。ripa裂解液裂解小鼠组织，用bca蛋白定量检测试剂盒(p0010，碧云天，中国)测定蛋白浓度。
[0065]
蛋白样品中加入上样蛋白缓冲液高温变性(水浴100℃，10min)。变性后的蛋白样品经sds-page电泳，80v电泳30min后再120v电泳60min，90v转膜25min，5％脱脂牛奶室温封闭2h；4℃一抗(制备的bpifa2抗体，1:1000)孵育过夜后1x tbst洗膜，加相应二抗(anti-mouse igg(h+l)antibody，5220-0341；anti-rabbit igg(h+l)antibody，5220-0337，美国kpl公司)室温孵育2h后tbst洗膜10min
×
3次；加入显影液(supersignal
tm
west pico plus化学发光底物，34580，thermo scientific)利用imagequant 800超敏化学发光成像仪显影。
[0066]
考马斯亮蓝染色，将sds-page凝胶置于蒸馏水中，加热清洗后，考马斯亮蓝染液(p0017，碧云天，中国)室温染色30分钟。蒸馏水中洗涤3次，利用imagequant 800超敏化学发光成像仪显影。
[0067]
(6)灰度值及统计学分析
[0068]
使用image j软件测定蛋白条带灰度值。spss18.0软件进行双样本异方差t检验分析组间差异，各组样品量n≥5，p《0.05提示组间差异具有统计学意义，p《0.01表明差异高度显著，p＜0.001表明差异极其显著。
[0069]
实验结果如下：
[0070]
1、成功制备bpifa2多克隆抗体
[0071]
为了准确检测bpifa2在小鼠各组织的表达水平，我们制备了针对小鼠的多克隆抗体。我们根据ncbi数据库中小鼠bpifa2基因序列设计了特异性引物，进行基因扩增并进行琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的大小。结果显示在600bp左右位置有一条清晰且特异的条带(见图1)，与ncbi数据库显示的bpifa2(38-235aa)序列长度594bp相一致。证明成功扩增出了目的条带。随后将其同源重组至pgex-4t-ab1载体上构建重组质粒并在大肠杆菌dh5α中扩增。随后提取质粒进行测序验证。测序以及比对结果显示所构建质粒序列与目标序列完全一致，证明重组质粒构建成功。利用ncbi的blast工具对重组质粒序列进行了两两序列比对，验证了重组质粒序列正确(见图2)。
[0072]
随后我们开始抗原蛋白的制备。在e.coli rosetta中的小规模诱导bpifa2表达结果显示重组质粒成功表达出了目的蛋白，其大小在48kd(图3)。随后将诱导表达后的菌液进行超声破菌，分离出上清液和包涵体，并经过sds-page电泳确定重组蛋白表达位置。根据电泳结果显示，pgex-4t-ab1-bpifa2主要在包涵体中表达(见图4中的a)。进一步，我们对bpifa2蛋白进行复性并纯化(见图4中的b)，得到浓度为1mg/ml的纯化蛋白，用于动物免疫实验。按照首次0.3mg，后续每次0.15mg剂量对实验兔进行5次免疫。采集实验兔血清并进行1：1000至1：512000的梯度稀释后通过elisa实验分别对两份血清内抗体效价进行监测，结果显示在(1：1000)-(1：64000)稀释范围内，e15846样品od值均大于0.4，证明包被200ng抗原，稀释度为1：64000时血清效价合格，而e15847抗体在(1：1000)-(1：32000)稀释范围内抗体od值均大于0.4，在1：32000时血清效价合格，要比e15846效价低一些。具体检测结果见(表1和图5)。
[0073]
最后，我们分别以c57bl/6j雌性小鼠腮腺、胸腺、肝脏及肾脏作为样品对抗体特异性进行检测。首先，通过pcr检测发现bpifa2仅在腮腺中特异性表达(见图6)；随后的wb结果显示，制备的抗体在小鼠腮腺样品中成功检测到了bpifa2表达(见图7)，且条带在25kd附近，与文献中bpifa2分子约22kd相一致；其余组织中并未检测到该目标条带，符合bpifa2在腮腺高特异性表达。至此，我们成功制备出了可用于western blot实验的兔抗小鼠bpifa2多克隆抗体。为后续bpifa2的作为放射损伤生物标志物的研究创造了有利条件。
[0074]
2、血清bpifa2是一种敏感可靠的放射损伤早期指标
[0075]
我们构建了0gy(对照组)、0.5gy、1gy、2gy、4gy、6.5gy(亚致死剂量)及10gy(致死剂量)不同剂量单次全身照射小鼠模型。并检测其照射后基本生理指标结果(见图8)，照射后存活率分析发现，所有暴露于10gy致死剂量照射的小鼠在11天内死亡，其余剂量组小鼠均无死亡。照射后小鼠体重和血象分析发现，致死剂量照射后小鼠体重急剧下降并持续下降直至死亡，其他剂量组小鼠体重也均有所下降但在照射后7d开始有所恢复。随后我们比较分析不同剂量照射后1d之内小鼠淋巴细胞计数与血清bpifa2水平动态变化。分析结果如图9所示，小鼠的淋巴细胞数目变化折线图。显示与对照组小鼠相比，受照后小鼠淋巴细胞绝对数呈现剂量依赖性下降。照射后早期血清bpiha2的wb检测结果显示(见图10)，对照组小鼠血清中的bpifa2表达量较少，显影时没有明显的条带，而其余剂量组在照射后1h-12h均检测到清晰且特异的条带；说明全身照射后诱导血清bpifa2水平迅速升高，而后下降，在照射后1d所有剂量组bpifa2均显著下降。检测结果的灰度值分析(图11)进一步显示，所有受照小鼠血清bpifa2水平均在照射后1h显著升高，照后1d显著回落；2gy及以下剂量组在照射后4h-6h达到峰值；4gy与6gy剂量组在照射1h-12h持续保持高水平波动，没有显著回落；
致死剂量照射后小鼠血清bpifa2浓度在1h即剧烈升高达到峰值，随后缓慢回落直至照射后1d。这一结果显示血清bpifa2对电离辐射具有极高的灵敏度，在受照后1h即可检测到其水平的显著上调，提示我们血清bpifa2具有成为电离辐射早期生物标志物的潜力。
[0076]
3、bpifa2二次升高可作为致死性放射损伤早期预判指标
[0077]
为进一步探索小鼠血清bpifa2在致死性放射损伤中的指示作用，我们构建了亚致死6.5gy和致死剂量10gy放射损伤小鼠模型。并对其照射前后生存率、体重、淋巴细胞计数等基本生理指标进行检测。结果显示，10只致死剂量照射组小鼠在10天内死亡，亚致死剂量与对照组小鼠存活率为100％(见图12中的b)。照射后小鼠体重和血象分析发现，致死剂量照射后小鼠体重持续性显著下降直至死亡，亚致死剂量组小鼠体重下降程度显著低于致死剂量组，并在照射后7d开始停止下降(见图12中的a)。随后我们分析致死与亚致死剂量照射后小鼠淋巴细胞计数与血清bpifa2水平动态变化。照射后7d内小鼠淋巴细胞计数分析显示6.5gy和10gy照射后小鼠淋巴细胞数量均急剧减少，且两组之间淋巴细胞数量无显著差异(见图13)。提示淋巴细胞计数分析无法在受照后早期区分致死性与亚致死放射损伤。
[0078]
随后我们分析了致死与亚致死剂量照射后7d内小鼠血清bpifa2水平动态变化。wb检测结果如图14所示，暴露于6.5gy和10gy电离辐射后小鼠血清bpifa2在1d内均呈现出先增加后减少的变化趋势；然而后期变化呈现出不同趋势。6.5gy照射组小鼠血清bpifa2浓度在照射后1d开始持续下降，直至照射后7d已经无法通过wb检测到。而10gy照射后小鼠bpifa2则在受照后3d呈现出显著的二次增加，之后再开始回落。wb检测结果的灰度值分析(见图15)进一步显示了照射后血清bpifa2二次增加可以有效区分致死剂量与亚致死剂量放射损伤。上述结果充分体现了照射后血清bpifa2水平二次升高作为小鼠致死性放射损伤早期生物标志物的可行性。
[0079]
4、辐射后小鼠血清bpifa2浓度升高反应整体损伤水平与受照部位无关
[0080]
由于bpifa2在唾液腺中特异性表达，我们考虑在小鼠受到照射时唾液腺是否受照可能会直接影响到bpifa2在血清中的浓度变化。为了确认这一问题，我们建立了局部照射的小鼠模型(见图16)，包括10gy全身照射组(tbi)、10gy局部照射头部组(pbi-1)及10gy局部屏蔽头部照射组(pbi-2)。照射后体重与存活率分析显示10gy全身照射组小鼠在照射后体重持续显著下降，在照射后7d-18d内所有小鼠全部死亡(见图17中的b)；局部照射组小鼠在受照后第一天体重下降，随后不在继续下降，照射后5d-7d已经开始恢复，所有小鼠均存活(见图17中的a)。外周血淋巴细胞绝对数量动态分析结果显示全身照射与局部照射小鼠淋巴细胞在照射后均显著下降；其中pbi-1组由于受照面积小，其照射后淋巴细胞数量较其他两组略高一点(见图18)。western blot检测照射后1d内小鼠血清bpifa2水平显示所有小鼠血清bpifa2在照射后3h、6h和12h均显著升高，在照射后1d回落(见图19)。进一步对检测结果进行灰度值分析，结果如图20所示，所有小鼠血清bpifa2在照射后均迅速升高，并于照射后6h达到峰值(具体灰度值)，其中由于pbi-1组由于受照面积小，照射后6h与12h血清bpifa2水平显著低于其他两组。屏蔽唾液腺的pbi-2组与tbi组则无显著差异。该结果进一步证实，小鼠血清bpifa2水平具有很强的辐射敏感性，受照后12h内均有显著升高。更重要的是，照射后小鼠血清bpifa2水平的升高与小鼠受照面积，即电离辐射损伤程度密切相关，而不受唾液腺受照与否的影响。这是血清bpifa2能否作为电离辐射早期与致死性放射损伤生物标志物的重要因素。
[0081]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。