电化学检测尿酸的试剂及电化学尿酸试条的制备方法与流程

1.本发明属于生化检测技术领域，具体涉及电化学检测尿酸的试剂及电化学尿酸试条的制备方法。


背景技术：

2.尿酸是人体内嘌呤代谢过程中的废弃物。人体内尿酸水平是由其合成与清除之间的平衡来决定的。血尿酸水平升高是高尿酸血症和痛风及其相关合并症发生、发展的根本原因。血尿酸长期达标，可明显减少痛风发作频率，预防痛风石形成，防止骨破坏，降低死亡风险及改善患者生活质量，是预防痛风及其相关合并症的关键。因而，建立一种简单、快速的方法来检测血样中尿酸的浓度，对于临床中相关疾病的预防、诊断以及监测具有重要的意义。
3.目前，已经报道的测定尿酸的方法主要有：高效液相色谱法、化学发光法、电化学法等。在这些方法中，电化学方法因具有灵敏度高、反应时间短、操作简便等优点而在体外快速检测产品中广泛应用。基于电化学方法的尿酸试条分为无酶反应法和酶反应法。其中，无酶反应法主要利用正电压下尿酸在工作电极表面的氧化反应来实现对尿酸的检测。采用该种方法无需尿酸氧化酶参与反应，反应不受酶活性大小的影响。然而使用该方法测定尿酸时，一些具有氧化还原性的物质在测试时都会有干扰，如抗坏血酸、多巴胺、对乙酰氨基酚等。尽管部分专利，如专利cn102507670a、专利cn108303454a等，通过引用抗坏血酸氧化酶来解决血样中抗坏血酸干扰的影响，但依然很难解决其它氧化还原性物质的影响，尤其是对乙酰氨基酚的影响。酶反应法主要利用尿酸氧化酶对尿酸的特异性催化来实现对尿酸的检测。为解决氧化还原性干扰物的影响问题，目前较常用的酶反应法是尿酸氧化酶和过氧化氢酶双酶催化法，即尿酸在尿酸氧化酶的作用下产生双氧水，双氧水继续在过氧化氢酶作用下氧化还原型催化剂，生成的氧化型催化剂在较负电压下产生相应的响应电流。该种方法由于催化反应电位较负，可以规避到大多数氧化还原性干扰物质的影响。但该方法产生的双氧水容易与血液中的抗坏血酸反应，影响测试结果的准确度。专利cn101349667a中发明的传感器通过在电极表面涂覆混合酶层来降低干扰物的影响，混合酶层中包含催化待测生理活性物质氧化的脱氢酶和消除干扰用的氧化酶。该方法引入了消除干扰的抗坏血酸氧化酶，一方面无疑提升了试条成本，另一方面多种活性酶引入也增加试条不稳定性问题，如试条精密度降低，响应电流灵敏度降低、检测线性范围变窄等。另外，基于尿酸氧化酶的酶反应法还受样品中氧分压的影响，进而还会影响试条的温度适用范围。


技术实现要素：

4.因此，为了解决上述技术问题，本发明提供一种电化学检测尿酸的试剂，所述试剂包括生物活性组分、抗坏血酸消除剂、电子介体、血红蛋白脱氧剂、高分子化合物、稳定剂、表面活性剂和缓冲液，所述血红蛋白脱氧剂为过硫酸钠。
5.在一种实施方式中，所述抗坏血酸消除剂为3-酰胺基-2,2,5,5-四甲基吡咯-氮氧
化物、2,2,6,6-四甲基哌啶-氮氧化物(tempo)及其衍生物，优选地为4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶-氮氧化物、4-羧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-氮氧化物，更优选地为4-羧基-2,2,6,6-四甲基哌啶-氮氧化物。
6.在一种实施方式中，所述生物活性组分为尿酸氧化酶和过氧化氢酶，所述电子介体为亚铁氰化钾、二茂铁或二茂铁衍生物、锇类或锇类衍生物、硫堇、吩噻嗪、导电石墨、碳纳米管中的一种或几种，优选地为亚铁氰化钾和石墨；所述稳定剂为蛋白质分子和/或糖醇类物质中的一种或者多种组合，优选地所述蛋白质分子为牛血清白蛋白、胶原蛋白分子中的一种，所述糖醇类物质为甘露醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇中的一种或几种；所述高分子化合物至少包含一种可溶性纤维类高聚物，优选羟乙基纤维素；所述表面活性剂为曲拉通x-100，所述缓冲溶液为pbs溶液。
7.在一种实施方式中，所述尿酸氧化酶浓度为0.5-2.0iu，所述hrp为0.01-0.1iu，所述tempo-oh质量浓度为0.05-0.15g/ml、亚铁氰化钾质量浓度为0.1-30.3g/ml、过硫酸钠质量浓度为0.05-0.15g/ml、海藻糖质量浓度为0.05-0.15g/ml、石墨质量浓度为0.05-0.15g/ml、牛血清白蛋白质量浓度为0.01-0.1g/ml、羟乙基纤维素质量浓度为0.01～0.05g/ml，曲拉通x-100质量浓度为0.02-0.12g/ml-和pbs缓冲液质量浓度0.07-0.21g/ml。
8.在一种实施方式中，所述尿酸氧化酶浓度为1.0iu，所述hrp浓度为0.05iu，所述tempo-oh质量浓度为0.01g/ml、亚铁氰化钾质量浓度为0.02g/ml、过硫酸钠质量浓度为0.01g/ml、海藻糖质量浓度为0.01g/ml、石墨质量浓度为0.15g/ml、牛血清白蛋白0.05g/ml、羟乙基纤维素质量浓度为0.03g/ml、曲拉通x-100质量浓度为0.06g/ml和pbs缓冲液质量浓度为0.14g/ml。
9.在一种实施方式中，提供一种电化学尿酸试条的制备方法，所述方法包括：
10.步骤1：在绝缘基底一侧制作工作电极和对电极，所述工作电极和所述对电极的一侧分别向绝缘基底的另一侧引出工作电极的导线部分和对电极的导线部分，在两个导线部分的末端再分别引出连接外接仪器的工作电极接触垫和对电极接触垫；
11.步骤2：在上述制备有电极的基底上制备电绝缘层，所述电绝缘层覆盖除所述工作电极接触垫、所述对电极接触垫、所述工作电极和所述对电极外的其余部分；
12.步骤3：在上述制备有电极的基底上制备电绝缘层，所述电绝缘层覆盖除所述工作电极接触垫、所述对电极接触垫、所述工作电极和所述对电极外的其余部分；
13.步骤4：在所述制备好的所述工作电极上制备试剂层，所述试剂层包括权利要求1-5任一所述的电化学检测尿酸的试剂。试剂层可以通过喷涂或者丝网印刷方法固定在工作电极反应区，优选为丝网印刷法。
14.在一种实施方式中，在所述工作电极的两侧的电绝缘层上分别粘贴粘合片一和粘合片二，粘合片一和粘合片二的内侧分别粘齐两侧的电绝缘层的内侧；亲水盖片整体覆盖所述粘合片一和所述粘合片二，所述亲水盖片的左右两侧分别与所述粘合片一和所述粘合片二外侧齐平，使得绝缘基底、粘合片一和粘合片二以及所述亲水盖片之间共同形成进样通道。粘合片一和粘合片二形成有对应于电极反应区域的开孔，使该反应区域不被粘合片覆盖。亲水盖片目的在于提高虹吸进样速度和使血液充满整个反应区域。
15.在一种实施方式中，采用丝网印刷技术在塑料绝缘基底的一侧上制作所述工作电极和所述对电极，所述对电极采用u型结构围绕着所述工作电极。
16.在一种实施方式中，各电极的导线和接触垫部分材料是碳、银、金、铂或者任意两种的混合物，优选地是导电碳油墨。
17.在一种实施方式中，采用丝网印刷技术在印好电极的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘层，绝缘漆是采用热或者光固化绝缘油漆，优选光固化绝缘油漆。
18.本发明提供了一种具有去抗坏血酸、对乙酰氨基酚及多巴胺干扰影响且不受氧分压影响的基于尿酸氧化酶法的电化学检测尿酸的试剂及试条。本发明方法制备的试条不需要抗坏血酸氧化酶的参与，仅通过试剂层添加一定量的抗坏血酸消除剂就可以实现去抗坏血酸干扰影响的效果。同时，由于尿酸氧化酶和过氧化氢酶的双酶催化电位较负的特点，使得尿酸试条抗对乙酰氨基酚、多巴胺干扰效果显著。另外，该试条通过在反应试剂层添加一定量的血红蛋白脱氧剂，使得该基于尿酸氧化酶体系的试条受氧分压影响小且使用温度范围宽泛。最后该试条的制备方法简单，容易实现批量化的生产。
附图说明
19.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
20.图1是本发明尿酸试条的结构示意图，其中图1a是本发明的尿酸试条的展开示意图，图1b是本发明尿酸试条的组合图；
21.图2是本发明的工作电极试剂层含不含有抗坏血酸消除剂测试不同浓度抗坏血酸的对比示意图；
22.图3是工作电极含有本发明的试剂测试不同浓度对乙酰氨基酚的电流响应示意图；
23.图4是工作电极含有本发明的试剂测试不同浓度多巴胺的电流响应示意图。
具体实施方式
24.实施例一：电化学尿酸试条的制备
25.本实施例提供了一种电化学尿酸试条的制备实例。参见图1a和1b，该电化学尿酸试条包括绝缘基底1、工作电极2、对电极3、绝缘层41和42、试剂层5、粘合片61和62和亲水盖片7。
26.首先采用丝网印刷技术在0.3mm厚的pet塑料绝缘基底1一侧上制作工作电极2和对电极3，对电极可采用u型结构围绕着工作电极2。工作电极和对电极的一侧分别向绝缘基底的另一侧引出工作电极的导线部分22和对电极的导线部分32，在两个导线部分的末端再分别引出连接外接仪器的工作电极接触垫21和对电极接触垫31。其中电极部分的制作顺序不做限定，但各个接点处需保持交叠，以防止电极断路现象出现。各电极的导线和接触垫部分材料可以使用常用的导电材料制作，如碳、银、金、铂或者任意两种的混合物。优选导电碳油墨。
27.工作电极2的材料为碳、金、铂，优选导电碳油墨。对电极3的材料为银或者氯化银或者银和氯化银的混合物，优选银和氯化银的混合物。电极的各部分除采用丝网印刷技术
制作外，也可以采用磁控溅射、电镀、气相沉积等任意一种方法制备。
28.接着，采用丝网印刷技术在印好电极的基片上印刷绝缘漆作为电绝缘层4，绝缘层覆盖除接触垫21/22和工作电极2及对电极3外的其余部分。绝缘漆可以采用热或者光固化绝缘油漆，优选光固化绝缘油漆。印好的绝缘层放在紫外烘干机上烘干1分钟。
29.接着，在制备好的工作电极2上丝网印刷一层试剂层5，该试剂层包括生物活性组分、抗坏血酸消除剂、电子介体、血红蛋白脱氧剂、高分子化合物、稳定剂、表面活性剂和缓冲液。优选地，生物活性组分为尿酸氧化酶和过氧化氢酶，抗坏血酸消除剂为tempo-oh，电子介体为亚铁氰化钾和石墨，血红蛋白脱氧剂为过硫酸钠，高分子化合物为羟乙基纤维素，稳定剂为bsa和海藻糖，表面活性剂为曲拉通x-100，缓冲溶液为0.1m的pbs溶液，ph为7.4。
30.该试剂层通过印刷方式涂覆在工作电极2的表面，50℃烘干20分钟。试剂层各组分即其重量百分比见表1：
31.表1
32.组分浓度uao(尿酸氧化酶)1.0iuhrp0.05iutempo-oh0.1g/ml亚铁氰化钾0.2g/ml过硫酸钠0.1g/ml海藻糖0.1g/ml石墨0.15g/ml牛血清白蛋白0.05g/ml羟乙基纤维素0.03g/ml曲拉通x-1000.06g/mlpbs缓冲液(ph7.4)0.14g/ml
33.作为对比例1，在制备好的工作电极2上丝网印刷一层试剂层5’，该试剂层包括生物活性组分、抗坏血酸消除剂、电子介体、高分子化合物、稳定剂、表面活性剂和缓冲液。优选地，生物活性组分为尿酸氧化酶和过氧化氢酶，抗坏血酸消除剂为tempo-oh，电子介体为亚铁氰化钾和石墨，高分子化合物为羟乙基纤维素，稳定剂为bsa和海藻糖，表面活性剂为曲拉通x-100，缓冲溶液为0.1m的pbs溶液，ph为7.4。
34.该试剂层5’通过印刷方式涂覆在工作电极2的表面，50℃烘干20分钟。试剂层各组分即其重量百分比见表2：
35.表2
36.组分浓度uao1.1iuhrp0.06iutempo-oh0.111g/ml亚铁氰化钾0.222g/ml海藻糖0.111g/ml石墨粉0.167g/ml
牛血清白蛋白0.056g/ml羟乙基纤维素0.033g/ml曲拉通x-1000.067g/mlpbs缓冲液(ph7.4)0.156g/ml
37.作为对比例2，在制备好的工作电极2上丝网印刷一层试剂层5”，该试剂层包括生物活性组分、电子介体、血红蛋白脱氧剂、高分子化合物、稳定剂、表面活性剂和缓冲液。优选地，生物活性组分为尿酸氧化酶和过氧化氢酶，电子介体为亚铁氰化钾和石墨，血红蛋白脱氧剂为过硫酸钠，高分子化合物为羟乙基纤维素，稳定剂为bsa和海藻糖，表面活性剂为曲拉通x-100，缓冲溶液为0.1m的pbs溶液，ph为7.4。
38.该试剂层5”通过印刷方式涂覆在工作电极2的表面，50℃烘干20分钟。试剂层各组分即其重量百分比见表3：
39.表3
40.组分浓度uao1.1iuhrp0.06iu亚铁氰化钾0.222g/ml过硫酸钠0.111g/ml海藻糖0.111g/ml石墨0.167g/ml牛血清白蛋白0.056g/ml羟乙基纤维素0.033g/ml曲拉通x-1000.067g/mlpbs缓冲液(ph7.4)0.156g/ml
41.接着，在绝缘层41上粘贴粘合片61，粘合片61的内侧粘齐绝缘层41的内侧，粘合片62的内侧粘齐绝缘层42的内侧。最后，亲水盖片7整体覆盖粘合片61和62，亲水盖片7的左右两侧需分别与粘合片61和62外侧齐平。这样，绝缘基底、粘合片以及亲水盖片之间共同形成进样通道8。
42.实施例二：含有血红蛋白脱氧剂过硫酸钠组分的尿酸试条结果
43.本实施例举例说明试剂层含不含有血红蛋白脱氧剂过硫酸钠组分的尿酸试条对血样中尿酸检测性能的影响，对比例1尿酸试条除试剂层不含过硫酸钠外，其它制备过程同实施例1相同。
44.采集新鲜静脉血样，调整红细胞压积比为40％
±
2％，配制尿酸浓度分别为165μmol/l，360μmol/l，482μmol/l，665μmol/l，898μmol/l，1105μmol/l血样。分别在10℃、16℃、22℃、32℃以及40℃的温度下进行如下实验：将实施例1制备的尿酸试条置于配套的测试仪器中并在工作电极和对电极两端施加-300mv工作电压。取不同尿酸浓度的血样，加到试条虹吸通道口，血样通过虹吸进样通道自动吸取血样样品，进入工作电极及对电极区域反应形成电流，在对应测试仪器上可检测出与尿酸浓度对应的电流响应值。同样将实施例1中的试剂层不含血红蛋白脱氧剂过硫酸钠的对比例1制备的尿酸试条也采用同样的方式检测，在对应测试仪器上也可检测出与尿酸浓度对应的电流响应值。不同温度下，试剂层加不加
过硫酸钠组分的工作电极上检测的血样中不同尿酸浓度的对应电流值及线性相关系数r2值分别见表4和表5所示。实施例1试剂层中含有过硫酸钠组分的尿酸试条在10℃到40℃的温度范围内尿酸浓度和电流响应线性相关系数r2均大于0.98，相比之下，试剂层不含有过硫酸钠组分的对比例1尿酸试条在低温下尿酸浓度和电流响应线性相关系数r2明显变差，10℃下r2甚至低于0.90。结果表明，试剂层含有过硫酸钠组分的试条在10℃条件下，试尿酸检测时不受氧分压的影响。相比之下，试剂层不含有过硫酸钠组分的试条在10℃条件下，尿酸检测时受氧分压的影响明显，存在高浓度尿酸检测电流显著偏低的现象。该结果主要是血红蛋白脱氧剂过硫酸钠能够促进红细胞中血红蛋白所携带大量氧气的迅速释放，使得血样中氧气总浓度远高于溶解氧浓度。该脱氧剂对于解决低温环境下血样中氧不足问题尤为显著。另外，试剂层含有过硫酸钠组分的尿酸试条，无论是在尿酸检测灵敏度还是在温度对检测电流影响的变化率方面都明显优于试剂层不加过硫酸钠组分的尿酸试条。
45.表4：实施例1试剂层中含有过硫酸钠组分的尿酸试条在不同温度下血样尿酸测试结果
[0046][0047]
表5：实施例1试剂层不含有过硫酸钠组分的对比例1尿酸试条在不同温度下血样尿酸测试结果
[0048][0049]
实施例三含有抗坏血酸消除剂tempo-oh组分的尿酸试条结果
[0050]
本实施例举例说明工作电极试剂层含不含有抗坏血酸消除剂tempo-oh组分对降低抗坏血酸干扰的影响。对比例2尿酸试条工作电极试剂层除不含tempo-oh组分，其它制备过程同实施例1相同。
[0051]
采集新鲜静脉血样，调整红细胞压积比为40％
±
2％，配制尿酸浓度为350μmol/l血样。尿酸浓度的血样分装配制为含抗坏血酸浓度为0mmol/l(本底)，0.05mmol/l，
0.1mmol/l，0.2mmol/l以及0.3mmol/l的血样。测试过程同实施例2的测试过程，测试温度为22℃。实施例1和对比例2的尿酸试条工作电极上检测的抗坏血酸浓度和电流的线性关系分别见图2中的
■
含tempo-oh和
▲
不含tempo-oh所示。结果展示，试剂层中是否含tempo-oh对抗坏血酸的测试响应影响较大。实施例1中试剂层中含0.1g/ml的tempo-oh组分时，尿酸试条在实验血样中含有的抗坏血酸浓度下检测受抗坏血酸的影响不显著，而不添加tempo-oh组分的试条测试电流值随抗坏血酸浓度升高明显降低。因而该尿酸试条在不使用抗坏血酸氧化酶的条件下，通过在试剂层添加tempo-oh，可以显著增加去抗坏血酸干扰的效果，具体参见表6。
[0052]
表6
[0053][0054]
实施例四本发明的尿酸试条对对乙酰氨基酚和多巴胺干扰测试结果
[0055]
本实施例举例说明工作电极上试剂层含有本发明的试剂对对乙酰氨基酚和多巴胺干扰的影响。
[0056]
采集新鲜静脉血样，调整红细胞压积比为40％
±
2％，配制两组尿酸浓度都为350μmol/l血样。一组尿酸浓度的血样分装配制为含对乙酰氨基酚浓度为0mg/l，10.0mg/l、20.0mg/l，50.0mg/l，100.0mg/l以及200.0mg/l的血样；另一组尿酸浓度的血样分装配制为含多巴胺浓度为0μg/dl，30.0μg/dl，50.0μg/dl、90.0μg/dl，120.0μg/dl的血样。测试过程同实施例2的测试过程，测试温度为22℃。实施例尿酸试条工作电极上检测的对乙酰氨基酚浓度和电流的线性关系见图3和表7所示，实施例尿酸试条工作电极上检测的多巴胺浓度和电流的线性关系见图4和表8所示。结果展示，工作电极上含有试剂层的尿酸试条对对乙酰氨基酚及多巴胺抗干扰能力显著。
[0057]
表7
[0058]
[0059]
表8
[0060][0061]
本领域的技术人员容易理解的是，在不冲突的前提下，上述各有利方式可以自由地组合、叠加。
[0062]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。