一种海洋环境微塑料混合物成分定量分析方法与流程

：
1.本发明涉及微塑料(microplastics)分析技术领域，具体的是一种关于海洋环境中微塑料混合物成分的定量分析方法。


背景技术：

2.常用塑料种类主要包括聚丙烯(pp)，聚乙烯(pe)，聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，聚苯乙烯(ps)，聚氯乙烯(pvc)聚酰胺(pa，尼龙)和聚乙烯-醋酸乙烯酯(peva)等。由于质轻、耐用、价廉等优点，塑料制品应用非常广泛且呈逐年增长趋势，2018年全球塑料产量已达3.59亿吨。同时也产生大量废弃塑料，其中，相当部分未经正确及有效处理，每年有大约产量的10％的塑料进入了海洋。在外界条件(光降解、光氧化、生物裂解等)作用下逐步破碎形成粒径小于5mm的塑料碎片、颗粒、薄膜、纤维等，称之为微塑料。微塑料在海洋中分布范围十分广泛且高度持久，对海洋生态环境造成严重污染，同时，对海洋生物乃至人类健康存在潜在的伤害，引起了全球广泛关注。
3.有关微塑料分析技术的报道较多，主要包括热解-气相色谱-质谱法(pyr-gc-ms)、显微傅立叶变换红外光谱法(ftir)，显微拉曼光谱法等。由于微塑料混合物成分种类多、颗粒尺寸分布范围宽，py-gc-ms方法的进样量小(为0.5mg和尺寸小于1mm)使分析结果不具有代表性，而且热裂解过程引入很多干扰，使结果重现性差；样品前处理过程复杂，检测周期长；仪器昂贵等，因此，该方法仅限于研究用途，无法满足海洋微塑料的常规检测需求。
4.海洋微塑料红外光谱或拉曼光谱具有丰富的结构信息，常用于塑料种类鉴别。由于微塑料颗粒中有些尺度小且分布不均，须在显微镜下进行鉴别，即显微红外光谱或显微拉曼光谱方法，目前已成为海洋环境微塑料分析的主要手段。该方法首先将采集的样品经前处理去除杂质后，在显微镜下，逐粒采集其光谱。根据塑料光谱特征鉴定其种类，然后采用颗粒计数，对微塑料进行定量。但是，细微颗粒识别和计数都很困难，无法对其进行准确定量分析。另外，逐粒检测周期太长，工作量大，而且仪器昂贵，仅能在有条件的实验室进行，无法满足微塑料对海洋环境污染状况日常监控需求。因此，快速和准确的微塑料定量分析成为微塑料分析领域中亟待解决的难题。


技术实现要素：

5.本发明为针对显微分子光谱分析方法的不足，通过采集不同浓度的微塑料混合物标样的拉曼光谱，获得整体样品的组成信息，提出一种混合物拉曼光谱成分提取方法，将每种微塑料成分光谱分量从混合光谱中提取出来，实现了光谱分离，然后建立浓度和峰强的定量校正曲线。为实现混合物拉曼光谱的采集，本发明构建了一种大光斑激光拉曼光谱实验装置，最终实现了海洋环境微塑料成分含量的快速定量分析，解决了微塑料混合物成分定量分析难题。
6.本发明所述的一种海洋环境微塑料混合物成分定量分析方法，包括如下步骤：
7.s1、收集海洋环境中微塑料中常见种类塑料样品，将每种塑料分别制成粒径为250
μm-2mm的微塑料样品；收集海洋环境中常见的生物质样品，通过粉碎或冷冻或其它手段，制备成粒径小于3mm的生物质样品；将不同种类微塑料样品和不同种类生物质的细颗粒样品，分别按不同质量比进行混合，配制一系列微塑料混合物样品，使其中各种不同种类塑料浓度变化范围覆盖实际海洋微塑料混合物成分含量的变化范围；
8.s2、采用大光斑激光拉曼光谱采集装置，分别采集不同种类微塑料样品、生物质细颗粒样品和它们混合物样品的拉曼光谱；
9.s3、对s2中采集的拉曼光谱进行预处理；
10.s4、基于海洋微塑料混合物拉曼光谱是由混合物所包含的不同种类微塑料成分光谱和不同种类生物质成分光谱的线性组合构成，提出一种混合物拉曼光谱成分提取方法，将所含各种微塑料成分光谱分量从海洋微塑料混合物光谱中分离出来；
11.s5、使用一组已知微塑料成分含量的海洋微塑料混合物样品作为定标样品，使用s3对其光谱进行预处理；使用s4将定标样品中各种微塑料成分拉曼光谱分量提取出来；采用各种微塑料成分拉曼光谱分量中任何一个特征峰或多个特征峰或全谱或峰面积，对其含量值进行线性回归拟合，分别建立各种微塑料成分含量的校准曲线；
12.s6、按照s2，采集待测实际海洋微塑料混合物的拉曼光谱，按照s4，将该混合物样品中各种微塑料成分的拉曼光谱分量提取出来，依据s5建立的校准曲线，预测其各种微塑料成分的含量。
13.进一步地，s1中所述的微塑料样品和生物质样品，其特征在于：常见种类塑料样品包括但不不限于pp、pe、pet、pa、ps、eva、pvc、peva、pmma、abs、pu、pc、pan；常见的生物质样品包括但不限于鱼、虾、海带、贝类。
14.进一步地，s1中所述制备的系列浓度混合物样品，其特征在于：将不同种类微塑料样品和不同种类生物质的细颗粒样品，分别按不同质量比进行混合，使微塑料混合物样品中每一种微塑料成分含量变化范围涵盖0-100％。
15.进一步地，s2中所述的大光斑激光拉曼光谱采集装置，其特征在于：激光拉曼光谱仪的激光光斑直径从几百微米至几厘米。
16.进一步地，s2中拉曼光谱的采集具体步骤为：将微塑料样品放入铝盒中，轻压表面使其平整，每个样品重复装样至少3次以上，每次随机采集至少5个区域的光谱，每个区域连续采集5～10张光谱。
17.进一步地，s3中预处理方法为平滑、微分、小波变换、迭代自适应加权惩罚最小二乘法消除荧光或平均光谱方法。
18.进一步地，s4中所述的混合物拉曼光谱成分提取方法如下：
19.a定标
20.(1)获得微塑料混合物定标样品拉曼光谱mi，混合物拉曼光谱mi是n种纯微塑料按不同质量比混合后的拉曼光谱；
21.定标样品中每种微塑料成分质量含量浓度梯度均为c1,c2,
…ci
…ck
；
22.(2)获得z个混合物定标样品的拉曼光谱m1,m2,
…
,mi,
…
,mz，
23.构筑混合物定标样品光谱张量空间，m＝[m1,m2,
…
,mi,
…
,mz]；m为构筑的混合光谱张量空间；
[0024]
(3)n种纯微塑料的拉曼光谱分别为s1,s2,
…
,si,
…
,sn；
[0025]
(4)构筑纯微塑料光谱张量空间，s＝[s1,s2,
…
,si,
…
,sn]；s为构筑的纯微塑料光谱张量空间；
[0026]
(5)正交化变换，s
or
＝f(s)；f()为正交化变换；
[0027]
(6)提取系列浓度微塑料成分正交光谱分量空间，s
cor(i)
＝s
or(i)
*m；s
cor(i)
为正交化后第i种微塑料的系列浓度光谱分量空间，s
or(i)
为正交化变换后第i列；
[0028]
(7)成分正交光谱分量空间反变换，s
ci
＝rf(s
cor(i)
)；rf()为成分正分量反变换；s
ci
＝[s
ci1
,s
ci2
,
…
,s
cik
]；s
ci1
～s
cik
分别为第i种微塑料的1～k个浓度梯度的光谱分量；
[0029]
(8)构筑定标样品中所有种类微塑料成分的系列浓度光谱分量空间，sc＝[s
c1
,s
c2
,
…
,s
ci
,
…
,s
cn
]；
[0030]
(9)分别寻找sc中每种微塑料的特征峰值及峰位，[pi,li]＝findpeaks(s
ci
)；findpeaks()为寻峰；第i种微塑料的光谱分量峰值pi＝[p
i1
,p
i2
,
…
,p
ik
]；p
i1
～p
ik
分别为第i种微塑料的1～k个浓度梯度的光谱分量的峰值；第i种微塑料的光谱分量峰位li；
[0031]
(10)构筑所有种类微塑料的光谱分量峰值空间p＝[p1,p2,
…
,pi,
…
,pn]；
[0032]
(11)分别计算p中每种微塑料成分的峰值与浓度的线性拟合，[ai,bi]＝polyfit(pi,c)polyfit()为一次线性拟合运算；其中，定标样品中每种微塑料成分浓度梯度空间均为c＝[c1,c2,
…ck
]；得到的所有种类微塑料的拟合方程斜率空间a＝[a1,a2,
…
,ai,
…
,an]；截距空间b＝[b1,b2,
…
,bi,
…
,bn]；
[0033]
(12)校准方程，yi＝ai*xi+b
i yi为第i种微塑料的光谱分量特征峰值即pi；ai和bi为斜率和截距，通过(11)拟合得到；xi为第i种微塑料的浓度即c；
[0034]
b预测
[0035]
(1)提取系列浓度微塑料成分正交光谱分量空间，s
cor(j)
＝s
or(j)
*h；h为待预测的微塑料混合物光谱空间，h＝[h1,h2,
…
,hj,
…
,hz]；
[0036]
(2)成分正交光谱分量空间反变换，s
cj
＝rf(s
cor(j)
)；
[0037]
(3)构筑预测样品中所有种类微塑料成分的系列浓度光谱分量空间sc＝[s
c1
,s
c2
,
…
,s
cj
,
…
,s
cn
]；
[0038]
(4)分别寻找sc中每种微塑料的特征峰值及峰位，[pj,lj]＝findpeaks(s
cj
)；
[0039]
(5)pj代入校准方程预测第j种微塑料的质量含量xj，yj＝a*xj+b。
[0040]
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
[0041]
本发明为采集到样品混合光谱构建了一种大光斑激光拉曼实验装置，与常规拉曼光谱仪照射光斑尺寸为微米级相比，激光照射面积提升至毫米级，可同时照射不同尺寸不同种类的微塑料颗粒，所采集到的光谱能反映整体样品的组成信息，而且采集光谱时间周期很短，实现了快速测定；使用混合物拉曼光谱成分提取方法将待测种类微塑料成分的光谱信号提取出来，用其建立校准曲线，克服了不同种类微塑料光谱特征峰相互重叠而不能使用单元分析建立校准曲线的难题，从而实现了海洋微塑料混合物成分的定量分析。与显微分子光谱法仅能实现塑料成分颗粒的计数相比，本发明提出的方法实现了微塑料成分含量的准确、快速和方便测定，将单个微塑料样品检测时间由几天降至约15分钟，对海洋环境微塑料污染状况监测及风险评估具有重要的实际意义。
附图说明
[0042]
为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例所需要使用的附图作简单地介绍。
[0043]
图1激光拉曼光谱实验装置。
[0044]
其中，1壳体，2后板，3视窗，4底板，5探头罩，6检测平台，7激光器开关锁，8光纤安装架，9激光器电源卡箍，10支杆，11控制板安装架，12usb集成器支架，13检测器安装平台，14光谱采集探头，15减震橡胶垫，16过滤网压板，17激光器电源，18控制板，19风扇，20风扇罩，21电源开关及插座，22usb集成器，23激光器，24检测器，25入射光纤，26回收光纤
[0045]
图2为eva、pa、pe、pp、ps、pet 6种微塑料原始拉曼光谱；
[0046]
图3为eva、pa、pe、pp、pet、ps 6种微塑料经预处理后拉曼光谱；
[0047]
图4为不同种类微塑料连续采集的多张原始光谱的相对标准偏差和预处理后的相对标准偏差对比图；
[0048]
图5为pe系列浓度微塑料混合物样品经预处理后拉曼光谱；
[0049]
图6为从pe系列浓度微塑料混合物标样中提取的pe光谱分量及其特征峰强与质量浓度的线性定量曲线；
[0050]
图7为从pa系列浓度含生物质的微塑料混合物标样中提取的pa光谱分量及其特征峰强与质量浓度的线性定量曲线；
[0051]
图8为本发明实施例的定量分析方法流程图，以pe为例。
具体实施方式:
[0052]
下面将结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0053]
本发明提供了一种海洋环境微塑料混合物成分定量分析的方法，使用两组试验样品定量分析案例为研究对象，如图1～图7所示，具体步骤包括：
[0054]
实施例1
[0055]
本实例说明了6种不同种类微塑料混合物成分定量分析过程。
[0056]
1、不同浓度微塑料混合物样品的制备
[0057]
收集海洋环境中微塑料中常见的种类塑料样品：pp、pe、pet、pa、ps、eva，通过粉碎分别制备成粒径为250μm-2mm的微塑料样品；将不同种类微塑料样品按不同质量比进行混合，配制出一系列不同浓度的微塑料混合物样品20个，将其放入干净的铝盒中，用不锈钢药匙彻底搅拌，盖好盖子后混匀；其中每种微塑料的质量含量均为1wt％、5wt％、10wt％、30wt％、50wt％、70wt％、90wt％。
[0058]
2、采集大光斑拉曼光谱
[0059]
使用搭建的peri 1000型拉曼光谱仪，激光波长为532nm，激光功率为3w，激光光斑直径为2mm，光谱范围50～3500cm-1
，由西派特(北京)科技有限公司生产。拉曼光谱仪开机预热约10分钟，待仪器温度稳定在7℃时开始采集光谱。如图1所示。
[0060]
光谱采集条件设置：电流强度为8.6ev，激光探头截面与样品表面间距约3mm，积分
时间为1s，平均次数为8次。
[0061]
将6种微塑料样品分别放入6个同样大小的铝盒(40*20mm)中，使用金属压块轻压表面使其较为平整。每个样品重复装样3次，每次随机采集5个区域的光谱，每个区域连续采集6张光谱。按同样方法采集6种微塑料混合物样品。
[0062]
每个样品采集完毕后，用镊子夹住脱脂棉蘸取乙醇将实验台及药匙擦拭干净，避免样品间污染。
[0063]
3、光谱数据预处理
[0064]
见图2塑料拉曼光谱中，塑料光谱均含有荧光背景信号，不同种类塑料拉曼光谱的荧光背景轮廓不同，其中，pp的最弱，pet的最强。另外，光谱曲线中含有很多毛刺，即高频噪声较为严重，也会影响光谱定性和定量分析精度。因此，在定性和定量分析前对其光谱进行预处理，以期消除噪声和荧光背景的干扰。
[0065]
将采集的拉曼光谱数据先经过平滑、微分与小波变换(wt)去除光谱高频噪声，其中，选择小波基函数类型为“db4”，最大分解层数为11，将前两层高频小波信号舍弃，由剩余频率小波信号重构光谱；再通过迭代自适应加权惩罚最小二乘法(air-pls)消除荧光背景，选择参数105控制平滑度、拟合次数2次，不对称性为0.001；最后采用平均光谱(mean)作为样品的拉曼光谱，提高光谱精度，反映样品整体的成分信息。见图3预处理后的塑料光谱，曲线更为平滑，基线平直，不同时间采集光谱的拉曼特征信号基本重合。
[0066]
分别取pe特征峰(1293cm-1
)、pet特征峰(1613cm-1
)、pp特征峰(1458cm-1
)、pa特征峰(1443cm-1
)、ps特征峰(999cm-1
)、eva特征峰(1437cm-1
)信号强度，计算多次采集光谱的相对标准偏差(rsd)，用于评价光谱精度，见图4，预处理后不同种类微塑料各自特征峰处相对标准偏差rsd均小于1.5％，显著地提高了光谱精度。
[0067]
4、微塑料混合物标样中成分光谱分量的提取
[0068]
根据图3和图5可以看出不同种类微塑料特征谱峰之间存在着互相重叠，无法直接使用单元分析方法建立定量校准曲线。因此为消除共存组分光谱对被测组分光谱的干扰，使用上述配制的已知微塑料成分及含量的系列浓度微塑料混合物标样，采集其拉曼光谱；在已知微塑料待测成分拉曼光谱下，使用混合物拉曼光谱成分提取方法提取出每一种待测微塑料成分的光谱分量，见图6。以pe为例，可以看出，从pe系列浓度微塑料混合物标样中提取的pe光谱分量的强度变化与其在化合物中的浓度变化具有显著的相关性。其余种类微塑料采取相同方法提取光谱分量。
[0069]
5、建立定标曲线
[0070]
将得到的每一种微塑料的光谱分量特征峰强与其相应的质量浓度进行一次线性拟合，建立每一种微塑料光谱分量特征峰与质量含量的定量曲线。根据拟合相关系数r2越接近于1，定量的准确度越高，见表1，每种微塑料的线性拟合相关系数接近于1，定量的准确度越高，见表1，每种微塑料的线性拟合相关系数均大于0.96，定量效果好。
[0071]
表1微塑料混合物样品成分光谱分量特征峰及其定量校准曲线方程
[0072][0073]
6、预测
[0074]
从预测样品组中随机选取一组不同种类不同浓度的微塑料混合物样品，使用与建立校准曲线所使用的光谱采集条件采集光谱，使用同样的信号处理方法提取各种待测种类微塑料的光谱分量，依据上述建立的系列校准曲线，预测得到了待测种类微塑料在其混合物中的浓度值，如下表2所示。可以看出，预测值与配制值偏差范围为-1.48wt％～2.72wt％。
[0075]
表2微塑料各组分含量配制值与预测值的比对
[0076][0077][0078]
实施例2
[0079]
本实例说明了含生物质的不同种类微塑料混合物成分定量分析过程。
[0080]
1、不同浓度含生物质的微塑料混合物样品的制备
[0081]
收集海洋环境中常见的生物质：鱼、虾、贝类、海带，将贝类壳与贝肉分离，将贝肉和海带放入使用无水乙醇擦拭过的玻璃样品盘中，放入电热鼓风干燥箱中，在50℃下烘干20h。然后使用破壁机将烘干的海鱼、海虾、贝肉及海带放入破壁机中打碎，再次烘干约3h左右，待用。
[0082]
用石臼将贝壳捣碎并研磨成粉末状，使用孔径为2mm的不锈钢标准检验筛除去大
颗粒，放入带盖的不锈钢盒中，作为制备的生物质样品。
[0083]
使用上述配制的生物质样品与6种微塑料样品按不同质量比进行混合，配制出一系列不同浓度的含生物质的微塑料混合物样品11个，其中，每种微塑料的质量含量均为1wt％、5wt％、10wt％、30wt％、50wt％，生物质样品的添加量为1wt％～20wt％。
[0084]
2、采集大光斑拉曼光谱
[0085]
按照与实例1中相同的光谱仪和光谱测量条件，采集生物质样品及含生物质的微塑料混合物样品的拉曼光谱。
[0086]
3、光谱数据预处理
[0087]
按照与实例1中相同的预处理方法和条件处理原始光谱数据。
[0088]
4、含生物质的微塑料混合物标样中成分光谱分量的提取
[0089]
为模拟海洋环境的微塑料样品，在使用上述6种微塑料的基础上添加不同种类不同含量的生物质(包括鱼、虾、海带、贝类)配制了不同浓度系列的混合物。同理，从含生物质的微塑料混合物标样中提取待测微塑料光谱分量方法与实施例1相同，见图7，以pa为例，可以看出，从pa系列浓度含生物质的微塑料混合物标样中提取的pa光谱分量的强度变化与其在化合物中的浓度变化具有显著的相关性。
[0090]
5、建立定标曲线
[0091]
按实施例1中的方法建立有无生物质成分下微塑料光谱分量特征峰与质量含量的定量曲线。根据拟合相关系数r2越接近于1，定量的准确度越高，见表3，其中拟合系数近于1，定量的准确度越高，见表3，其中拟合系数均大于0.94，线性关系良好。
[0092]
表3含生物质微塑料样品成分光谱分量特征峰及其定量校准曲线方程
[0093][0094]
6、预测
[0095]
随机选取几个不同浓度的含生物质的微塑料混合物样品，使用与建立校准曲线使用的相同的光谱采集条件采集光谱，以及使用相同的方法提取待测成分光谱分量，依据建立的校准曲线，预测各种待测成分含量，评估其偏差范围，获得结果如下表4所示。可以看出，与配制值的偏差范围为-2.66wt％～3.99wt％。可以实现拉曼光谱快速定量测定海洋微塑料中各组分含量的准确测定。
[0096]
表4海洋微塑料各组分含量配制值与预测值的比对
[0097][0098]
以上所述均为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本发明的范围由权利要求限定，不脱离本发明的精神和原理而做出的等同替换和修改，均应涵盖在本发明的范围内。