一种用于快速检测透明质酸的胶体金试纸条

1.本发明涉及免疫层析检测技术领域，尤其涉及一种用于快速检测透明质酸的胶体金试纸条。


背景技术：

2.透明质酸(hyaluronic acid，简称ha)是以葡萄糖、酵母粉、蛋白胨等为培养基，由马链球菌兽疫亚种(streptococcusequisubsp.zooepidemicus)经发酵生产而成，是由d-葡糖醛酸和n-乙酰基-d-氨基葡萄糖双糖单元构成的糖胺聚糖，是一种直链大分子多糖。由于透明质酸分子在空间结构上呈刚性螺旋柱形，柱内侧的羟基具有高度亲水性，同时，羟基的连续、定向排列，在透明质酸分子链上形成高度憎水区，即使在浓度很低时，透明质酸也可形成三维网状结构，所以透明质酸有很强的吸湿性、保水性和粘弹性，是良好的天然保湿因子，常用做化妆品成分。2021年1月7日，国家卫生健康委员会发文，批准透明质酸钠为“新食品原料”，可应用于普通食品添加。
3.结合蛋白是具有自主折叠和特异性识别复杂碳水化合物排列的蛋白，主要存在于识别多糖的蛋白质中。它以单个或多个域的形式存在于蛋白质的催化结构域的c端或者是n端，只具有结合能力不具有催化活性。多糖通常是较差的免疫原，相比于传统的抗体制备方法，多糖的特异性抗体获取困难。采用结合蛋白与ha结合，可以有效解决ha抗体缺乏的问题。
4.目前透明质酸常用的检测方法有hplc法、比色法、ctab比浊法和咔唑显色法。这类方法操作复杂，检测周期长，依赖专业设备和具有良好实验技能的检测人员，对于现场快速检测而言，这些方法就难以实现。
5.免疫学检测由于其特异性强、灵敏度高，近年来成为发展迅速的检测手段。胶体金试纸条因其检测周期短、易于储存，并且操作简便、结果简单清晰的优势，被广泛地应用于现场快速检测领域，目前市场上尚未出现可以用于ha快速检测的产品，故有必要研发一种适用于化妆品或食品中ha的胶体金检测试纸条以弥补空白，从而更好地指导企业进行生产质量控制与执法部门监管。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是目前透明质酸常用的检测方法有hplc法、比色法、ctab比浊法和咔唑显色法。这类方法操作复杂，检测周期长，依赖专业设备和具有良好实验技能的检测人员，对于样本量大的现场快速检测而言，这些方法就难以实现。
7.为解决上述问题，本发明提供一种检测透明质酸的胶体金免疫层析试纸条，使用了透明质酸特异性结合蛋白，使其应用于透明质酸检测时具备较高的特异性、重复性和准确性。
8.为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：一种快速检测透明质酸的胶体金免疫层析试纸条，其以seq id no：1所示序列的蛋白为检测抗原。
9.seq id no.1
10.eetttnlvkngdfttttktsgawsgqaakdwetwvpgnvkkengkvtvdngrlhisstdtyrvavhqtvdvdpskkyllgydvetkdlkgsgvrvrlhgltaegkdlepkefihtpfkngskkerveqvltvspqtrklkvelffensigqawldnvslvehiekvpetpeqkpepaqpes
11.进一步的，编码上述透明质酸结合蛋白的基因，其核苷酸序列为seq id no.2或可翻译出seq id no.1的所有基因。
12.seq id no.2
13.gaagagactacgactaatttggtaaaaaatggggattttacaaccacaacaaagacttcaggggcctggtcaggacaggcagctaaagactgggaaacttgggtgccgggtaatgtgaaaaaggaaaatggaaaggtaaccgttgataacgggcgactccatatctcttcaaccgatacataccgagtagcggttcaccaaactgtggatgttgatcctagtaaaaaatatctcttaggctatgatgtggaaactaaggatctgaaaggtagcggagtgcgcgttcggttacacggtttgacagcagaagggaaggatttggagccgaaagaatttatccataccccttttaaaaatggcagcaagaaagagcgtgtagagcaagtcttaactgtctcaccacaaactcgcaaactgaaggtcgaactattttttgaaaatagtatcggtcaggcttggcttgacaacgtttcgttggttgaacatattgaaaaagtgccagaaacaccggaacaaaaaccagaacctgctcagccagaatcg
14.所述透明质酸结合蛋白重组表达的方法如下：
15.将透明质酸结合蛋白基因插入载体pet28a-gst的ecori和xhoi酶切位点之间，保持pet28a-gst的其它序列不变，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌表达工程菌bl21，使其插入到大肠杆菌基因组中，稳定表达目的蛋白。
16.利用多糖微阵列对表达的透明质酸结合蛋白的特异性进行测试，对透明质酸、硫酸软骨素、肝素、果胶、褐藻胶等多糖进行交叉试验。结果显示，只有透明质酸样品呈阳性反应，表明所述透明质酸结合蛋白用于检测时具有高度的特异性。
17.基于上述试验结果，本发明提出了所述透明质酸结合蛋白在制备检测透明质酸的免疫层析产品中的应用。作为优选，所述免疫层析产品为胶体金免疫层析试纸条。
18.进一步的，所述试纸条包括背衬以及在背衬上依次粘贴的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上划有包被透明质酸的检测线以及包被gst小鼠单抗的质控线。
19.进一步的，所述透明质酸在检测线上的喷涂量为0.5-2μl/cm，所述gst小鼠单抗在质控线上的喷涂量为0.5-2μl/cm。
20.进一步的，所述金标垫喷涂有标记胶体金颗粒的透明质酸结合蛋白复合物，所述复合物在金标垫上的喷涂量为5-8μl/cm。在本发明具体实施方式中，所述胶体金的粒径为20nm，胶体金与透明质酸结合蛋白在标记过程中的标记比含量为1ml胶体金：10μg透明质酸结合蛋白。
21.进一步的，所述背衬为聚乙烯背衬，所述样品垫为vl98聚酯膜，所述金标垫为rb45玻纤膜，所述硝酸纤维素膜为cn140，所述吸水垫为ch27。
22.进一步的，所述层析液配方：20mmol/lph7.5 pbs、0.5-2％tween-20、1-3％bsa、10％蔗糖、0.9％nacl。
23.本发明的有益效果：
24.(1)本发明提供了一种新型的透明质酸结合蛋白，作为透明质酸的检测蛋白时，具
备良好的特异性、重复性和准确性，能够运用在相关的免疫层析检测产品中，结果直观可肉眼判断，能够快速特异地检出透明质酸，便于产品质量控制和监管，具有较高的实用价值。
25.(2)本发明的透明质酸免疫层析试纸条采用免疫竞争的原理，样品与检测线中的透明质酸共同竞争金标垫上的透明质酸结合蛋白，当样品中透明质酸含量逐渐增加时则会与更多的结合蛋白相结合，故可与t线上透明质酸结合的结合蛋白量则减少，使t线颜色减弱，c线为质控线，颜色不受透明质酸含量的变化影响。
26.(3)本发明的胶体金试纸条，具有便于携带、分析速度快、操作步骤简单等优点，打破了传统透明质酸检测方法的局限性，能在10分钟内完成层析反应，实现对样品中透明质酸的快速检测，对大样本量的现场快速检测提供了有利的技术支持，同时也对企业的生产质量控制带来了极大的便利。
附图说明
27.图1为根据本发明的透明质酸胶体金快速检测试纸条的二维结构示意图；其中，1、底板；2、样品垫；3、金标垫；4、硝酸纤维素膜；5、检测线；6、质控线；7、吸水垫；
28.图2为根据本发明的透明质酸胶体金快速检测试纸条的胶体金的粒径分布图；
29.图3为根据本发明的其中透明质酸胶体金快速检测试纸条的检测透明质酸样品的检测限结果图；其中1、0.2μg/ml透明质酸；2、2μg/ml透明质酸；3、20μg/ml透明质酸；4、200μg/ml透明质酸；
30.图4为根据本发明的透明质酸胶体金快速检测试纸条的检测其他8种多糖的交叉反应结果图；其中，1、透明质酸；2、果胶；3、硫酸软骨素a；4、硫酸软骨素b；5、硫酸软骨素c；6、肝素；7、褐藻胶；上述多糖溶液浓度均为20μg/ml。
具体实施方式
31.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.实施例1：
33.参照图1，一种用于快速检测食品中透明质酸的胶体金试纸条包括：背衬1、设置于所述背衬上的样品垫2、与所述样品垫2相邻设置的金标垫3及吸水垫7；
34.所述金标垫3与背衬1之间设置有硝酸纤维素膜4；
35.所述硝酸纤维素膜4上设置有检测线5与质控线6。
36.所述检测线5及质控线6设置于所述硝酸纤维素膜4上，且检测线5靠近样品垫2，质控线6靠近吸水垫7。
37.所述检测线上喷涂有2mg/ml的透明质酸，所述质控线喷涂有gst小鼠单抗，金标垫中喷涂有胶体金颗粒标记的透明质酸结合蛋白。
38.所述的胶体金粒径为20nm。
39.本发明的透明质酸胶体金试纸条采用免疫竞争的原理：当样品滴加到样品垫2上时，随着层析作用，样品沿着样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫7的方向层析。若样
品不含透明质酸，当样品流经金标垫3时，胶体金-透明质酸结合蛋白复合物随样品层析，与检测线5上的透明质酸结合，未结合的复合物继续运动到质控线6上，因透明质酸结合蛋白含gst标签而被gst小鼠单抗捕获，此时，检测线和质控线均显示出肉眼可见的红色。若样品中含有透明质酸，样品与检测线中的透明质酸共同竞争金标垫3上的胶体金-透明质酸结合蛋白复合物，故可与检测线5上的透明质酸结合的复合物量减少，使检测线5颜色减弱直至消失，未与检测线5上透明质酸结合的复合物继续运动到质控6线上被gst小鼠单抗捕获，此时检测线5不显色而质控线6显示出肉眼可见的红色。结果判读为：检测线5和质控线6都显红色，检测样品为阴性；质控线6显红色，检测线5为浅红色或不显色，检测样品为阳性；若质控线6不显色则说明试纸条失效。
40.本实施例中，所述一种用于快速检测食品中透明质酸的胶体金试纸条的制备方法，步骤如下：
41.1.透明质酸结合蛋白hbp-sr的获取与纯化
42.将携带hbp-sr目的基因的大肠杆菌于lb液体培养基(抗性为卡那霉素)中传代培养，在37℃、160r/min培养至od600约为0.4，并添加iptg至终浓度为0.5mmol/l，于17℃诱导12h。菌体于20mm/l pbs(ph 7.5)中重悬并超声破碎，获得hbp-sr粗蛋白。粗蛋白用histraptm hp色谱柱进行亲和层析纯化，在含0.3mol/lnacl的20mm pbs(ph 7.5)流动相中，用0-0.5mol/l的咪唑进行梯度洗脱，收集有紫外吸收信号的组分。将收集的组分用hipreptm 26/10desalting色谱柱，以水为流动相进行脱盐处理，最终得到纯化后的hbp-sr。
43.2.胶体金的制备过程
44.1)1％氯金酸的配制：取1g氯金酸粉末，加入100ml灭菌后的超纯水，配成1％氯金酸溶液，放4℃备用。
45.2)1％柠檬酸三钠配制：取0.5679g二水合柠檬酸三钠，溶解到50ml超纯水中，配成1％柠檬酸三钠溶液，现配现用。
46.3)采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在烧杯中加入99ml超纯水，接着加入1ml的1％氯金酸溶液，搅拌均匀后获得100ml质量浓度为0.01％的氯金酸溶液。将此100ml的0.01％氯金酸溶液在500rpm转速搅拌下水浴加热至沸腾。准确量取3ml 1％柠檬酸钠溶液，迅速加入到氯金酸溶液中，保持500rpm转速不变，继续加热12min，待溶液颜色呈现透明紫红色并保持不变时终止加热。室温下冷却后置于4℃下避光储存。
47.3.制备胶体金-透明质酸结合蛋白复合物
48.取20nm胶体金溶液1ml，添加5μl 0.1mol/l碳酸钾调节溶液调节至最佳ph，加入10μg透明质酸结合蛋白，快速混匀并在摇床上室温混匀30min，然后加入bsa至终浓度为1％继续混匀30min，将金标液于4℃12000r/min离心10min，小心吸去上清液，沉淀用1％bsa溶液以原胶体金溶液1/10体积的量重悬，混匀后4℃保存备用。
49.4.硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂及金标垫制备
50.用xyz三维喷金划线仪将0.2mg/ml透明质酸溶液以1μl/cm的速度均匀地划在硝酸纤维素膜的t线位置。将gst小鼠单抗用稀释成1mg/ml以1μl/cm的速度均匀地划在硝酸纤维素膜的c线位置，置于37℃烘干2h备用。将胶体金-透明质酸结合蛋白复合物以8μl/cm均匀喷涂在金标垫上，37℃烘干2h备用。
51.5.试纸条的组装
52.将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬上。其组装结构如图1所示，硝酸纤维素膜4置于聚乙烯背衬1的上面,样品垫2平贴于硝酸纤维素膜4左侧，吸水垫7平贴于硝酸纤维素膜4右侧，金标垫3平贴于样品垫2与硝酸纤维素膜4之间，使其一端压于样品垫2之下，另一端覆于硝酸纤维素膜4之上。彼此之间叠加长度为1mm左右。贴合完毕以后用裁切机裁切为宽度3mm的试纸条。组装成的试纸条置于塑料卡内真空封装，常温保存。
53.6.快速检测透明质酸的胶体金试纸条的应用
54.取1μl待测样品与99μl层析液充分混合后滴在本发明试纸样品垫上，10min后观察结果，同时分别取已知阳性和阴性样品分别作为阳性和阴性对照。结果判定：若检测线和质控线均显红色，为阴性结果；若检测线不显色而质控线显红色，为阳性结果；若质控线不显色，则试纸无效。层析液为含有1％bsa、1％吐温20、10％蔗糖、0.9％nacl的0.02m磷酸缓冲液，使用该层析液可充分释放金标垫中的胶体金-透明质酸结合蛋白复合物。
55.7.试纸条灵敏度实验
56.称取化学纯的透明质酸溶于ph8的20mm磷酸缓冲液，制备不同浓度的透明质酸标准溶液，重复上述6所述操作进行测试，并做三次平行。结果见图2。
57.图2是本发明实例中透明质酸胶体金试纸条对于透明质酸的检测限测试结果，由图2可知，滴加终浓度为200、20、2μg/ml透明质酸溶液后，试纸条t线不显色，滴加终浓度为0.2μg/ml透明质酸溶液后t线显色，说明试纸条检测限可达2μg/ml，三次重复结果相同，说明试纸条稳定性良好。
58.8.试纸条特异性实验
59.选取了2mg/ml的透明质酸、果胶、硫酸软骨素a，b，c、肝素、褐藻胶溶液进行交叉实验。重复上述6所述操作进行测试，即终浓度均为20μg/ml，并做三次平行。结果见图3。
60.图3是本发明实例中透明质酸胶体金试纸条检测不同多糖的交叉反应结果。由图3可知，20μg/ml的6种其他含糖醛酸多糖添加到样品垫后，检测线均显色，显示为阴性结果。结果表明，该试纸条与其他含糖醛酸多糖无交叉反应。
61.以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
62.63.64.