1.本发明涉及肿瘤诊断领域，具体涉及用于检测免疫检查点空间分布的试剂在制备肿瘤治疗和预后诊断产品中的应用。
背景技术：2.目前临床上研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂包括针对ctla-4、pd-1和pd-l1的单抗。检查点免疫治疗在一些肿瘤如黑色素瘤中有显著疗效，然而目前免疫检查点抑制剂和细胞治疗对包括胰腺癌等实体肿瘤的疗效甚微。以胰腺癌为例，在胰腺癌免疫治疗当中免疫检查点抑制剂(pd-1、pd-l1、ctla-4)开展的临床试验最多，然而诸多临床试验的结果显示从免疫治疗成功获益的胰腺癌患者几乎无效。
3.目前对免疫治疗检测的标准是通过免疫组化方式分析pd-l1蛋白表达，很遗憾的是有近一半的pd-l1表达阳性病人对免疫检查点治疗依然无反应。有研究表明不同空间区域实体肿瘤表现为不同的肿瘤微环境，从而导致肿瘤发病机制及治疗反应的不同。因而，深入了解实体肿瘤空间区域免疫微环境的差异和共性，是目前亟待解决的重大科学问题。现有证据证实肿瘤免疫和机体对肿瘤免疫治疗的反应受多种因素影响，包括肿瘤抗原和肿瘤突变等。高基因突变负荷(tmb-high)实体瘤的免疫治疗设想是基于肿瘤突变可能产生免疫原性新抗原，新抗原增加和cd8
+
t细胞计数增加呈正相关，而cd8
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t浸润肿瘤是免疫治疗效果好的基础。目前普遍观点认为，依据肿瘤微环境中免疫细胞的浸润和基因突变负荷(tumor mutationburden,tmb)等可以将肿瘤分为三大类：冷肿瘤-免疫耐受型(cold tumor-immune resistant)，热肿瘤-免疫响应型(hot tumor-immune responsive)，和完全无反应型(excluded tumor-immuneresistant)。这类分型使得我们对肿瘤微环境有了进一步认识，并对免疫治疗疗效的监测有一定指导作用。然而在实际临床应用过程中，研究发现部分被认为是冷肿瘤的患者对免疫治疗响应较好，证实肿瘤微环境的复杂性和多样性。最近来自美国md安德森癌症中心最新发表的研究质疑fda加速审批的—免疫检查点抑制剂适应证之一的tmb-high泛癌种。该研究的回顾性分析发现，并非所有tmb-high癌种的cd8
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t细胞计数就会升高，因此tmb-high或不适合作为预测所有癌症的免疫治疗疗效生物标志物。同样今年发表在nejm上一篇 letter同样对tmb-high的免疫治疗疗效预测价值提出了质疑。研究发现tmb的预测价值仍然仅仅体现nsclc、头颈部鳞癌和黑色瘤上，其他癌种观察不到tmb-high的预测价值。进一步证实在包括消化系统肿瘤等实体肿瘤中tmb-high预测期免疫治疗疗效的证据尚不充分。缺乏准确预测肿瘤患者对免疫治疗疗效是导致免疫治疗效果不尽人意的重要原因，当前急需研发有临床指导价值的预测指标来帮助和指导临床医生对免疫治疗用药适应症、用药时机和患者预后做出准确判断。
技术实现要素：4.有鉴于此，本发明针对实体肿瘤免疫治疗适应症和疗效预测面临的难题和瓶颈，
过揭示实体肿瘤免疫微环境的空间区域免疫共性和特性，建立新型免疫微环境评分标准，研发了针对实体肿瘤治疗疗效和预后的新型监测模型，在生物医药特别是肿瘤免疫治疗领域有极大的应用前景和产业价值。
5.为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.用于检测免疫检查点空间分布的试剂在制备肿瘤治疗和预后诊断产品中的应用，所述免疫检测点包括免疫标志物和免疫细胞，所述免疫标志物为tim-3和pd-1；所述免疫细胞为 cd8
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t细胞。
7.本发明优选的，所述试剂包括tim-3、pd-1和cd8的免疫试剂。
8.本发明优选的，所述免疫试剂为用于免疫荧光/免疫组织化学抗体或免疫胶体金标记。
9.本发明优选的，所述试剂包括特异识别tim-3、pd-1和cd8的显色剂标记分子探针。
10.本发明优选的，所述显色剂标记分子探针为分别用不同荧光标记的tim-3分子探针、pd-1 分子探针和cd8分子探针。
11.本发明优选的，所述荧光标记的tim-3分子探针为包括一抗和二抗，一抗为抗人tim-3 单克隆抗体，二抗为opal多标荧光二抗，hrp polymer或hrp ap polymer；所述荧光标记的 pd-1分子探针包括一抗和二抗，一抗为抗人pd-1单克隆抗体，二抗为opal多标荧光二抗， hrp polymer或者hrp ap polymer；所述cd8分子探针包括一抗和二抗，一抗为抗人cd8 单克隆抗体，二抗为opal多标荧光二抗，hrp polymer或者hrp ap polymer。
12.本发明优选的，所述试剂还包括肿瘤标记试剂。
13.本发明优选的，所述肿瘤标记为pan-ck。检测pan-ck的试剂可以为免疫试剂，包括免疫荧光/免疫组织化学抗体或免疫胶体金标记。优选的，特异识别pan-ck的显色剂标记分子探针；更优选的，pan-ck分子探针包括一抗和二抗，一抗为鼠抗人pan-ck单克隆抗体 (cell signaling technology,#4545)。
14.本发明优选的，所述试剂还包括脱腊剂、梯度乙醇溶液、封闭液、染料、dapi染色剂和 tbst缓冲液。
15.本发明优选的，所述试剂的检测指标空间分布预测模型为lasso-cox模型和列线图 (nomogram)。
16.本发明的有益效果在于：本发明公开了用于检测免疫检查点空间分布的试剂在制备肿瘤治疗和预后诊断产品中的应用，本发明采用state-of-the-art空间蛋白质组学分析技术和机器学习，分析实体肿瘤组织在免疫治疗前后肿瘤微环境中的免疫检查点tim-3和其他免疫检查点 pd-1、pan-ck和cd8的空间分布，进一步深入分析微环境中tim-3分子与免疫细胞/胞外基质的空间互作，应用机器学习等建立精准预测模型并应用到泛癌种的临床治疗疗效和患者预后的监测中，在生物领域和医药转化研究中具有极大的应用前景。
附图说明
17.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
18.图1为切片全景扫描成像(a：组织多指标染色全景扫描；b：对组织进行单细胞分类； c：分析单个标记物在组织内的空间位置)。
19.图2为肿瘤微环境中tim-3与其他免疫检查点pd-1微环境中细胞外基质和免疫细胞等的分布互作(a：定义免疫细胞与肿瘤细胞之间的空间状态；b：组织多指标荧光染色标记细胞群的空间分布；c：组织内浸润细胞亚型分布)。
20.图3为肿瘤患者预后的预测模型(a：训练队列；b：验证队列)。
21.图4为不同亚群细胞对直肠癌病人手术后生存预测模型。
具体实施方式
22.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
23.本发明通过探究免疫检查点tim-3的空间关系以及与其他免疫检查点(pd-1、pan-ck 等)、免疫细胞(cd8+t细胞等)有助于深入了解实体肿瘤微环境的组成与差异，并准确预测患者的免疫治疗疗效和患者预后，进一步为临床个体化精准治疗提供理论依据。
24.实施例1
25.分别取包括i-iv期肿瘤病灶、癌旁组织以及免疫治疗前后组织样本，采用组织he染色，初步确定组织空间区域特征，分组编号，同时开展随访队列研究。
26.然后应用多重荧光染色，对肿瘤组织和癌旁组织样本进行分子标记物tim-3,pd-1，cd8, pan-ck,dapi染色(opal assay kit,perkinelmer)，并应用vectra polaris(perkinelmer)进行切片全景扫描成像，具体步骤如下：
27.1)脱腊，60℃烤箱烤片1小时，二甲苯浸洗3分钟3次；
28.2)复水，分别在体积分数为100％，95％，70％，50％的梯度乙醇溶液中复水；
29.3)抗原修复，根据一抗要求选择抗原修复液(柠檬酸或者edta)，应用微波炉加热，冷却至室温；
30.4)封闭，首先用组化笔在组织周围画圈，然后加入封闭液室温孵育10分钟；
31.5)一抗，滴加一抗并在37℃孵育30分钟；
32.6)二抗，弃残液后，1
×
tbst浸洗3分钟3次，滴加二抗(perkinelmer opal polymer hrp ms plus rb)，室温孵育10分钟；
33.7)信号放大，弃残液后，1
×
tbst浸洗3分钟3次，滴加染料室温孵育10分钟；
34.8)脱洗抗体，脱洗后重复4)～7)；
35.9)细胞核染色，弃残液后，1
×
tbst浸洗3分钟3次，滴加dapi室温孵育5分钟；
36.10)封片，弃残液后，滴加抗淬灭封片剂，加盖玻片，指甲油封片；
37.11)全景扫片，根据实验需求选择显微镜放大倍数，应用vectra polaris(perkin elmer)进行切片全景扫描成像，结果如图1中a所示。
38.本实施例中对标记物tim-3,pd-1，cd8,pan-ck标记的抗体分别如下：
39.对tim-3标记的一抗为兔抗人或鼠tim-3单克隆抗体(abcam,ab241332)，二抗为opal 7-color荧光二抗(opal 7-colar automation ihc,perkineimer)。
40.对pd-1标记的一抗为兔抗人pd-1单克隆抗体(abcam,ab237728)，二抗为opal 7-color 荧光二抗(opal 7-colar automation ihc,perkineimer)。
41.对cd8标记的一抗为鼠抗人pan-ck单克隆抗体(cell signaling technology,#4545)，二抗为opal 7-color荧光二抗(opal 7-colar automation ihc,perkineimer)。
42.对cd8标记的一抗为兔抗人cd8单克隆抗体(cell signaling technology,#85336)，二抗为opal 7-color荧光二抗(opal 7-colar automation ihc,perkineimer)。
43.应用数字病理分析软件qupath对组织进行单细胞分类，结果如图1中b所示；选取组织切片上特定区域，即肿瘤、间质、切缘、免疫细胞群等进行空间蛋白组学分析，获取各癌种微环境中tim-3的表达情况以及空间分布，结果如图1中c所示。
44.实施例2
45.应用人工智能、机器学习等生物信息学技术探索肿瘤微环境中tim-3与其他免疫检查点 pd-1等、微环境中细胞外基质和免疫细胞等的分布互作，分析肿瘤亚型分型，建立空间定位 (图2)。
46.为了建立新型免疫检查点空间互作的预测模型(图3)，首先将肿瘤病人随机分为两组：训练队列和验证队列，根据免疫检查点和免疫细胞的空间状态我们得到了21类免疫细胞状态，然后根据这21种空间状态和临床tnm分期我们建立了lasso-cox模型(图3，a)，并定义了具有21种空间状态中的6种(intratumoral cd8+tim3+,intratumoral cd8+pd1+, proximity tim3+,intratumoral pd1+,distal pd1+,and primary tumor stage)作为肿瘤患者预后的风险评分，具体评分公式为risk score＝(0.95
×
cd8+tim3+intratumoral status)+(-0.20
×ꢀ
tim3+proximity status)+(-1.11
×
cd8+pd1+intratumoral status)+(0.08
×
pd1+intratumoralstatus)+(0.27
×
pd1+stromal status)+(1.56
×
tnm stage status*)。应用r语言包“survivalroc”，并定义0.85作为风险值，将病人分为高危人群(high risk)和低危人群)(low risk)。随后我们应用时间依赖性roc曲线来进一步验证分型评分的准确率(图3，b)，结果显示模型成功预测高风险人群预后较差。我们进一步证实，本发明的预测模型显著优于传统的肿瘤tnm分期对患者预后的预测准确率(图3，c)。
47.实施例3
48.以人直肠癌病人为例，应用列线图(nomogram)作为定量工具(图4，a)，通过建立空间免疫检查点tim-3,pd-1互作建立预测患者3年和五年死亡率的预测模型，成功预测直肠癌患者预后情况，结果如图4，b所示，预测的可能性与实际观察到的可能性一致。
49.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，比如免疫检查点的增减、替换，或者免疫细胞的变换或者临床治疗方案改变等，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。