来那度胺或其类似物在作为免疫调节剂中的应用

1.本发明属于生物医药领域，涉及来那度胺或其类似物在作为免疫调节剂中的应用，特别涉及来那度胺或其类似物在增强浸润cd28
‑ t细胞的肿瘤病人对免疫治疗的响应中的应用。


背景技术：

2.t细胞激活是肿瘤免疫循环中至关重要的一个环节，在t细胞被激活的过程中，首先需要t细胞受体(t cell receptor，tcr)识别抗原肽-mhc分子复合体(pmhc)产生抗原信号(signal1)，其次还需要t细胞表面的共刺激受体与其配体相互作用产生一系列共刺激信号(signal 2)，这些信号共同作用确保t细胞被充分活化。调控t细胞激活的共刺激信号主要由两类蛋白分子介导：免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)以及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，tnf)/肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，tnfr)超家族。cd28是t细胞表面关键的共刺激受体，属于免疫球蛋白超家族。cd28受体与其配体b7-1(cd80)或b7-2(cd86)相互作用，从多个层面共刺激t细胞。
3.cd28共刺激受体调控t细胞激活和效应细胞功能，但t细胞表面的cd28并不会持续表达。幼年时期人体内大部分t细胞表面持续表达cd28，但随着年龄增长，人体内t细胞(尤其是cd8
+ t细胞)表面cd28的表达会逐渐丢失，60岁以后，人体内50％以上的cd8
+ t细胞表面的cd28会丢失，这是免疫衰老的重要标志。除此以外，实体瘤患者肿瘤中也会累积大量cd28
‑ cd8
+ t细胞。在非小细胞肺癌和肾细胞癌中，约有50％肿瘤浸润的cd8
+ t细胞为cd28-，而在结直肠癌(colorectal cancer，crc)中，约有80％肿瘤浸润的cd8
+ t细胞为cd28-。综上所述，免疫衰老过程和实体瘤中会累积大量cd28
‑ cd8
+ t细胞。
4.cd28的缺失导致cd8
+ t细胞无法有效地响应抗原信号刺激。cd28
‑ cd8
+ t细胞比例上升直接导致多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)病人体内肿瘤抗原特异性的t细胞免疫反应下降。临床数据显示，在癌症患者肿瘤中，cd28
‑ cd8
+ t细胞比例的升高与较差的预后呈现正相关。综上所述，人体衰老过程和实体瘤中会大量累积cd28
‑ cd8
+ t细胞，削弱抗肿瘤免疫反应，可能是肿瘤进展的诱导因素之一。
5.免疫检查点pd-1与其配体结合后，会抑制cd3ζ、cd28、zap70、akt和erk等蛋白的磷酸化，进而抑制t细胞激活、增殖以及效应细胞功能。pd-1/pd-l1抗体能够解除pd-1对cd28共刺激信号的抑制效果，进而促进t细胞存活和增殖。这一机制提示pd-1/pd-l1免疫检查点抑制剂发挥抗肿瘤效果需要cd28共刺激信号的参与。ahmed rafi教授课题组通过小鼠模型证实了pd-1/pd-l1抗体抑制肿瘤生长依赖于cd28共刺激信号。此外，shin eui-cheol教授课题组发现，非小细胞肺癌病人肿瘤样本中的cd28
‑ cd8
+ t细胞无法响应pd-1抗体。综上所述，pd-1/pd-l1抗体通过增强cd28下游信号发挥一部分功能，因此cd8
+ t细胞表面cd28的缺失会导致pd-1/pd-l1抗体治疗失效。
6.来那度胺或其类似物、(lenalidomide)是沙利度胺(thalidomide)的类似物，是一种分子胶水降解剂(molecular glue degrader)。先后被批准用于治疗mm、5号染色体长臂
缺失(del(5q))的骨髓异常增生综合征(myelodysplastic syndromes，mds)和套细胞淋巴瘤(mantel cell lymphoma，mcl)等血液肿瘤。在t细胞仅受到抗原信号但缺少共刺激信号的情况下，来那度胺或其类似物、可以共刺激t细胞，使得t细胞达到充分激活的状态，这提示来那度胺或其类似物、可能以不依赖于cd28受体的方式共刺激t细胞。但是现有技术中采用来那度胺和pd-1抗体联合使用的治疗方案并没有取得较好的治疗效果。因此，刺激和激活缺少cd28受体的t细胞，仍然是本领域技术人员所面临的技术难题。


技术实现要素：

7.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种来那度胺或其类似物在作为浸润有大量cd28
‑ t细胞尤其是cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤的免疫调节剂中的应用，用于解决现有技术中t细胞表面cd28的缺失会导致免疫检查点抑制剂如pd-1/pd-l1抗体治疗失效的问题，提高来那度胺联合pd-1抗体的治疗疗效。
8.为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种来那度胺或其类似物在作为免疫调节剂中的应用。
9.本发明的目的之一是提供检测cd28
‑ t丰度细胞的物质在制备评估受试者对来那度胺或其类似物进行免疫治疗有效性的产品中的应用。所述物质通过细胞表面标志物对cd28
‑ t细胞丰度进行检测。
10.本发明的另一目的是提供一种体外诊断产品，所述体外诊断产品包括检测cd28
‑ t细胞的物质。
11.本发明的另一目的是提供一种来那度胺或其类似物在制备疾病免疫调节剂中的应用，所述疾病的患病组织中浸润高丰度cd28
‑ t细胞，所述免疫调节剂调节缺失cd28受体的cd28
‑ t细胞的功能。所述来那度胺或其类似物用于以下一项或几项：
12.1)共刺激cd28
‑ t细胞；
13.2)增强cd28-t细胞免疫反应；
14.3)促进cd28-t细胞的激活；
15.4)促进cd28-t细胞的增殖；
16.5)增强cd28
‑ t细胞的毒性；
17.6)增强疾病病灶对免疫检查点抑制剂的响应；
18.7)恢复免疫检查点抑制剂对疾病的治疗疗效；
19.8)预防和/或治疗疾病。
20.本发明的另一目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含来那度胺或其类似物，免疫检查点抑制剂，以及药学上可接受的辅料。
21.如上所述，本发明的来那度胺或其类似物在作为免疫调节剂中的应用，具有以下有益效果：本发明所述的来那度胺或其类似物能够用于共刺激缺失cd28的cd28
‑ t细胞，增强t细胞免疫反应，促进t细胞的激活或增殖，增强浸润cd28
‑ t细胞的疾病病灶如肿瘤对免疫检查点抑制剂的响应，恢复免疫检查点抑制剂对疾病的治疗疗效。
附图说明
22.图1.来那度胺或其类似物共刺激缺少cd28受体的crbn
i391v
小鼠t细胞的结果图。
23.图2.来那度胺或其类似物在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内增强抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长。(a)给药10天肿瘤体积变化(n≥5)。(b-e)给药第10天测定总免疫相关细胞(cd45
+
，b)、cd8
+ t细胞(cd45
+ cd8
+
，c)、cd4
+ t细胞(cd45
+ cd4
+
，d)和毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
，e)的占比。
24.图3.来那度胺或其类似物增强b16f10-ova小鼠黑色素瘤对pd-1抗体的响应。其中，(a)为肿瘤体积变化(n＝6)；(b)为药物处理的第6天的肿瘤重量；(c)为药物处理的第6天的肿瘤照片。
25.图4.来那度胺或其类似物、逆转cd28缺陷导致的pd-1抗体治疗失效。(a)给药9天内肿瘤体积变化(n≥5)。(b)在药物处理的第9天小鼠腋下肿瘤照片。(c-e)肿瘤浸润淋巴细胞占比，总免疫相关细胞(cd45
+
，c)、cd8
+ t细胞(cd45
+ cd8
+
，d)和毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
，e)。
26.图5.来那度胺或其类似物与αpd-1联合使用促进cd28
‑ cd8
+ t细胞增殖。流式细胞术检测被激活的(cd25
+
，a)和增殖中的(ki-67
+
，b)cd8
+ t细胞的比例；其中，a、b中左侧一组柱状图对应cd28-，右侧一组柱状图对应cd28
+
。
具体实施方式
27.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
28.本发明要解决的技术问题是提供来那度胺或其类似物增强肿瘤中浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤病人对免疫治疗的响应。本发明构建了crbn
i391v
基因敲入小鼠模型，在小鼠中模拟来那度胺或其类似物对人源t细胞的共刺激作用，用于探讨来那度胺或其类似物的共刺激作用对实体瘤免疫治疗的意义。本发明的研究结果表明，在cd28缺失的crbn
i391v
小鼠中，来那度胺或其类似物共刺激cd28
‑ cd8
+ t细胞，增强t细胞免疫反应，可以抑制肿瘤生长并弥补cd28缺失导致的pd-1抗体治疗失效。在结直肠癌病人的肿瘤样本中，来那度胺或其类似物可以共刺激cd28
‑ cd8
+ t细胞，并增强这群t细胞对pd-1抗体的响应。这些结果提示，来那度胺或其类似物、有望在肿瘤中浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤病人中增强pd-1抗体的疗效。
29.本发明数据表明，在这些浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤患者中，来那度胺的类似物包括上市药物泊马度胺(pomalidomide)，临床试验过程中的来那度胺或其类似物类似物(cc-122，cc-220)，以及其他早期在研的ikzf1和ikzf3蛋白的分子胶水降解剂，都可以增强pd-1和pd-l1抗体的治疗效果。
30.本发明提供了cd28
‑ t细胞作为靶标在评估受试者采用来那度胺或其类似物免疫治疗有效性中的应用。所述cd28
‑ t细胞作为靶标具体是指：将cd28
‑ t细胞作为测定对象，检测其水平，当cd28
‑ t细胞为高丰度时，则受试者采用来那度胺或其类似物免疫治疗相较于cd28-t细胞为低丰度时，更加有效，即实体瘤病人肿瘤中浸润cd28
‑ t细胞的高丰度可以作为提高来那度胺或其类似物免疫治疗有效性的一个分子标志物。所述cd28
‑ t细胞的高丰度是指实体瘤中浸润的t细胞中有超过一半的细胞为cd28-t细胞。
31.其中，所述t细胞选自cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、幼稚t细胞、干细胞中枢记忆t细胞、效应t细胞和调节性t细胞中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述t细胞为cd8
+
t和/或毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
)。
32.本发明还提供了检测cd28
‑ t细胞的物质在制备评估受试者采用来那度胺或其类似物免疫治疗有效性的产品中的应用。提供cd28
‑ t细胞的检测，获得所述cd28
‑ t细胞的丰度值；当所述cd28
‑ t细胞为高丰度时，评估受试者对来那度胺或其类似物进行免疫治疗是有效的。本发明中，对所述cd28
‑ t细胞丰度的检测方法不受限制，只要是能够实现对cd28
‑ t细胞丰度的检测即可。所述物质可以是任何能够获得cd28
‑ t细胞丰度的物质，例如是通过细胞表面标志物对cd28
‑ t细胞丰度进行检测的物质，如抗体，探针等。
33.本发明还提供了一种新的用于共刺激缺失cd28受体的cd28
‑ t细胞的免疫调节剂的活性成分。结合发明人对t细胞的多年研究，通过一系列体内、体外功能实验发现来那度胺或其类似物具有优异的免疫调节作用。基于此，本发明提供了来那度胺或其类似物在调节缺失cd28受体的cd28
‑ t细胞的免疫调节剂中的应用。
34.所述来那度胺化学名为3-(7-氨基-3-氧代-1h-异吲哚-2-基)哌啶-2,6-二酮，分子式为c
13h13
n3o3，结构如下式i所示：
[0035][0036]
所述来那度胺的类似物包括来那度胺衍生物、其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。所述药学上可接受的盐、酯包括所述来那度胺或其类似物、与如下酸形成的盐或酯：氢氯酸、氢溴酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。
[0037]
在一些优选实施方式中，所述来那度胺的类似物包括上市药物泊马度胺(pomalidomide)，临床试验过程中的来那度胺类似物(cc-122,cc-220)，以及其他早期在研的ikzf1和ikzf3蛋白的分子胶水降解剂。
[0038]
所述来那度胺或其类似物用于共刺激缺失cd28的cd28
‑ t细胞，增强t细胞免疫反应，促进t细胞的激活或增殖，增强浸润cd28
‑ t细胞的疾病病灶如肿瘤对免疫检查点抑制剂的响应，恢复免疫检查点抑制剂对疾病的治疗疗效。
[0039]
因此，本发明所述来那度胺或其类似物用于以下一项或几项：
[0040]
1)共刺激cd28
‑ t细胞；
[0041]
2)增强cd28
‑ t细胞免疫反应；
[0042]
3)促进cd28
‑ t细胞的激活；
[0043]
4)促进cd28
‑ t细胞的增殖；
[0044]
5)增强cd28-t细胞的毒性；
[0045]
6)增强疾病病灶对免疫检查点抑制剂的响应；
[0046]
7)恢复免疫检查点抑制剂对疾病的治疗疗效；
[0047]
8)预防和/或治疗疾病。
[0048]
其中，所述免疫检查点抑制剂选自pd-1、pd-l1、pd-l2、pd-l3、ctla4、tim-3、lag3、ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5、vista、vsir、btla、tigit、lair1、lmtk3、tight、ido、cd27l、cd40、cd47、cd137、cd160、cd244、cd270、gitr、b7-h1、b7-1、2b4和/或tgfrβ的抑制剂中的一种或几种；优选地，为pd-1和/或pd-l1。
[0049]
其中，所述t细胞选自cd4
+
t细胞、cd8
+
t细胞、中枢记忆t细胞、效应记忆t细胞、幼稚t细胞、干细胞中枢记忆t细胞、效应t细胞和调节性t细胞中的一种或几种；优选地，所述t细胞为cd8
+
t细胞和/或毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
)；更优选地，所述t细胞为cd8
+
t细胞。
[0050]
其中，所述疾病选自肿瘤、自身免疫性疾病或传染性疾病中的一种或几种；优选地，所述疾病为浸润有cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤。
[0051]
所述肿瘤选自淋巴瘤、血液瘤或实体瘤，选自肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、宫颈内腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤、弥散性大b细胞淋巴瘤、食管癌、多形性成胶质细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低度胶质瘤、肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮细胞癌、卵巢癌、胰腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺癌、直肠癌、恶性肉瘤、黑色素瘤、胃癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、葡萄膜黑色素瘤、多发性骨髓瘤、急性淋系白血病、慢性淋系白血病、慢性髓性白血病、t细胞淋巴瘤、b细胞淋巴瘤肿瘤细胞中的一种或多种的组合；优选地，所述肿瘤为结直肠癌和/或黑色素细胞瘤；
[0052]
所述自身免疫性疾病自身免疫选自系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性硬化症、口眼干燥综合征、多发性肌炎中的一种或多种。
[0053]
在一些优选实施方式中，所述疾病为浸润有cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤。
[0054]
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上所述应用中所述的来那度胺或其类似物，免疫检查点抑制剂，以及药学上可接受的辅料。所述药物组合物为多成分物质，有效成分之一为来那度胺或其类似物。
[0055]
所述免疫检查点抑制剂选自pd-1、pd-l1、pd-l2、pd-l3、ctla4、tim-3、lag3、ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5、vista、vsir、btla、tigit、lair1、lmtk3、tight、ido、cd27l、cd40、cd47、cd137、cd160、cd244、cd270、gitr、b7-h1、b7-1、2b4和/或tgfrβ的抑制剂中的一种或几种。在一些优选实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为pd-1。在一些优选实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为pd-l1抗体。在一些优选实施方式中，所述免疫检查点抑制剂为pd-1和/或pd-l1抗体，所述来那度胺或其类似物可以增强pd-1和pd-l1抗体的治疗效果。
[0056]
所述可接受的辅料包括载体、介质，例如无菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、抗氧化剂(抗坏血酸等)、缓冲剂(磷酸、枸橼酸、其它的有机酸等)、防腐剂、表面活性剂(peg、tween等)、螯合剂(edta等)、粘合剂等。而且，也可含有其它低分子量的多肽；血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；甘氨酸、谷酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；多糖和单糖等糖类或碳水化物；甘露糖醇或山梨糖醇等糖醇。当制备用于注射的水溶液时，例如生理盐水、含有葡萄糖或其它的辅助药物的等渗溶液，如d-山梨糖醇、d-甘露糖、d-甘露糖醇、氯化钠，可并用适当的增溶剂例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇，peg等)、非离子表面活性剂(吐温80，hco-50)等。
[0057]
本发明中，所述药物组合物还包括共刺激分子的激动剂；所述共刺激分子的激动
剂选自ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3或cd83配体的激动剂中的一种或几种。
[0058]
本发明药物组合物中，活性组分来那度胺或其类似物的含量通常为安全有效量，所述安全有效量对于本领域技术人员来说应该是可以调整的，例如，所述活性组分的施用量通常依赖于患者的体重、应用的类型、疾病的病情和严重程度，例如，作为活性成分的施用量通常可以为1～1000mg/kg/day、20～200mg/kg/day、1～3mg/kg/day、3～5mg/kg/day、5～10mg/kg/day、10～25mg/kg/day、25～30mg/kg/day、30～40mg/kg/day、40～60mg/kg/day、60～80mg/kg/day、80～100mg/kg/day、100～150 mg/kg/day、150～200mg/kg/day、200～300mg/kg/day、300～500mg/kg/day、或500～1000mg/kg/day。
[0059]
本领域技术人员可以根据病症的严重程度和受试者的健康情况及年龄的不同考虑施用的有效量。有效量通常可在0.05ng/kg体重-约100mg/kg体重之间变动。
[0060]
本发明中，所述药物组合物可以适应于任何形式的给药方式，可以是经口、鼻、直肠、静脉、胃肠外给药等。药物组合物可以制成注射剂、注射用无菌粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂、或栓剂。
[0061]
所述药物组合物中，所述来那度胺或其类似物与免疫检查点抑制剂共同给予。“共同给予”表示在同一制剂中或在两种不同制剂中经由相同或不同途径同时给予，或通过相同或不同途径顺次给予。“顺次”给予表示在来那度胺或其类似物与免疫检查点抑制剂之间具有以秒、分钟、小时或天计的时间差异。
[0062]
本发明所述来那度胺或其类似物、药物组合物还可与其他治疗手段结合使用，所述其他手段包括手术、放疗、化疗、靶向治疗。
[0063]
本发明所述来那度胺或其类似物、药物组合物主要针对的对象为哺乳动物或其离体癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
[0064]
本发明所述来那度胺的类似物包括来那度胺衍生物、其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。所述药学上可接受的盐、酯包括所述来那度胺或其类似物、与如下酸形成的盐或酯：氢氯酸、氢溴酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富马酸、马来酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、苯磺酸、或羟乙磺酸。
[0065]
所述“前药”指当用适当的方法服用后，该“前药”在人体内进行代谢或化学反应而转变成所述具有活性的来那度胺或其类似物、或其药学上可接受的盐、酯、异构体、前药、多晶型物或溶剂化物。
[0066]
本发明还提供了一种调节缺失cd28受体的cd28
‑ t细胞的方法，向有需要的个体或对象施用所述来那度胺或其类似物，或上述药物组合物。
[0067]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0068]
本文述及“包含”、“含有”等应理解为是包括性的意思，而没有排他性或穷尽的意思；即“包括但不限于”的意思。
[0069]
本文述及“治疗有效量”通常指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗如
上所列出的疾病的效果。
[0070]
本文述及“治疗性”和“预防性”应理解为其最宽的意义。术语“治疗性”不一定暗示哺乳动物接受治疗直至完全恢复。类似地，“预防性”不一定表示对象最终不会发病。因此，治疗和预防包括缓解具体病症的症状或防止或降低具体病症产生的风险。术语“预防”可理解为降低具体病症发作的严重程度。治疗也可降低已有病症的严重程度或急性发作的频率。
[0071]
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0072]
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0073]
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。
[0074]
本发明构建了crbn
i391v
基因敲入小鼠模型，在小鼠中模拟来那度胺或其类似物对人源t细胞的共刺激作用。接着本发明将该小鼠和cd28-/-小鼠进行杂交，获得了cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠。然后本发明在构建好的小鼠模型中建立了mc38-ova小鼠结肠癌肿瘤模型，该肿瘤模型可以很好地模拟临床上浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤。具体来说，本发明在小鼠结肠癌细胞系mc38中利用慢病毒载体plenti 6.1稳定表达ovalbumin蛋白，得到了mc38-ova细胞系。之后本发明将mc38-ova细胞系接种到crbn
i391v
基因敲入小鼠皮下，每只小鼠接种100μl细胞pbs悬液(含有两百万个细胞)。本发明在该肿瘤模型中尝试了来那度胺或其类似物、和anti-pd-1抗体的联合治疗，用于测试来那度胺或其类似物、能否在浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞地实体瘤中恢复pd-1抗体的疗效。此外，本发明还利用结肠癌临床样品，测试了来那度胺或其类似物、和anti-pd-1抗体联合使用对结肠癌肿瘤中浸润cd28
‑ cd8
+ t细胞激活和增殖的影响。
[0075]
实验结果显示，来那度胺或其类似物可以共刺激cd28
‑ cd8
+ t细胞(见图1)，在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内弥补cd28缺陷导致的抗肿瘤免疫反应不足(见图2)。在对anti-pd-1抗体不响应的b16f10-ova小鼠黑色素瘤模型中，来那度胺或其类似物、可以增强肿瘤对pd-1抗体的响应(见图3)。更加重要的是，来那度胺或其类似物、可以在mc38-ova小鼠结肠癌模型中逆转cd28缺陷导致的pd-1抗体失效(见图4)。在临床样本中，来那度胺或其类似物、可以共刺激结直肠癌病人肿瘤来源的cd28
‑ cd8
+ t细胞，与anti-pd-1抗体联合使用会进一步促进病人肿瘤来源cd28
‑ cd8
+ t细胞的增殖(见图5)。这些结果提示来那度胺或其类似物、与pd-1抗体联合使用有望治疗肿瘤中浸润有大量cd28
‑ cd8
+ t细胞的实体瘤病人，如结直肠癌病人。
[0076]
实施例1来那度胺或其类似物、共刺激缺少cd28受体的crbn
i391v
小鼠t细胞
[0077]
1、小鼠模型构建
[0078]
(1)cd28
+/+ crbn
+/+
小鼠模型构建
[0079]
cd28
+/+ crbn
+/+
小鼠为含cd28的且含野生型crbn基因的小鼠。本发明中，可采用任何已知的cd28
+/+
crbn
+/+
小鼠。
[0080]
(2)cd28-/
‑ crbn
+/+
小鼠模型构建
[0081]
cd28-/
‑ crbn
+/+
小鼠为cd28缺失的含野生型crbn基因的小鼠。本发明中，可采用任何已知的cd28-/
‑ crbn
+/+
小鼠，本发明采用的cd28-/
‑ crbn
+/+
小鼠由中科院许琛琦老师组提供。
[0082]
(3)cd
28+/+ crbn
i391v
和cd
28-/
‑ crbn
i391v
模型构建
[0083]
人源化小鼠cd
28+/+ crbn
i391v
和cd
28-/
‑ crbn
i391v
模型的构建，参见本课题组的专利文献202110302848.x。
[0084]
2、测定指标及测定方法
[0085]
以cd69作为t细胞激活的标志物。
[0086]
3、分选t细胞
[0087]
从各模型小鼠体内分选得到cd8
+
(a)和cd4
+
(b)t细胞，然后对这些t细胞进行t细胞激活实验，以cd69作为t细胞激活的标志物。
[0088]
具体包括：
[0089]
分别从cd28
+/+ crbn
i391v
，cd28-/
‑ crbn
+/+
和cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠脾脏中提取脾脏细胞，通过cd8+t细胞分离试剂盒(stem cell，cat#19853a)分选得到cd8
+ t细胞，通过0.2μg/ml固定于细胞培养板上的αcd3e抗体(bd biosciences，cat#550275)刺激t细胞，同时按照图1中的标注，加入响应浓度的来那度胺(selleck，s1029)或者dmso(yeasen，cat#60313es60)对照，处理24小时后，通过流式细胞术检测cd69
+
细胞在cd8
+ t细胞中所占比例。在分析流式细胞检测结果时，本发明先通过细胞死活染料(fixable viability dye efluor450，invitrogen，cat#65-0863-14)，区分出活着的细胞，然后通过cd8抗体(bd biosciences，cat#563068)和cd4抗体(bd biosciences，cat#550954)，区分出cd8+ t细胞。然后通过cd69抗体(bd biosciences，cat#557745)染色，计算出这些t细胞中被激活的t细胞比例。
[0090]
结果如图1所示，由图1可知，来那度胺或其类似物可以在体外共刺激这些缺少cd28受体的crbn
i391v
小鼠t细胞，可以有潜力用于在体内弥补cd28缺失所导致的抗肿瘤免疫不足和pd-1抗体失效。
[0091]
实施例2来那度胺或其类似物在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内增强抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长
[0092]
一、mc38-ova细胞系构建
[0093]
为了构建合适的肿瘤模型，本发明首先在小鼠结肠癌细胞系mc38的基础上构建了免疫原性更高的mc38-ova细胞系。具体实施过程如下：
[0094]
1.构建重组载体plenti 6.3-ova
[0095]
1.1设计鸡卵白蛋白ova(ovalbumin)序列
[0096]
先通过苏州金唯智生物技术有限公司合成ova，序列如seq id no.1，具体如下所
示：
[0097][0098]
其中，__代表最终表达在肿瘤细胞中的片段。
[0099]
1.2慢性病毒载体dlenti6.3-cmv-mcs和voa片段的连接
[0100]
用bamhi-hf/xhoi酶对慢性病毒载体plenti6.3-cmv-mcs(from wuxi apptec.)进行酶切，酶切体系如表1所示；37℃孵育4小时，利用zymoclean gel dna recovery kit(zymo d4002)回收切割产物；其中，bamhi-hf/xhoi酶选自neb公司。然后将voa基因克隆入经酶切后的慢性病毒载体plenti6.3-cmv-mcs中，在quick ligase的连接下，于25℃中恒温孵育连接30min。
[0101]
表1 酶切反应体系
[0102]
2μgplenti6.3-cmv-mcs0.5μlbanhi-hf(neb)(20000u/ml)0.5μlxhoi(neb)(20000u/ml)5μlcutsmart buffer(neb)(10
×
)50μltotal
[0103]
表2 连接反应体系
[0104]
[0105]
1.3转化至感受态细胞
[0106]
将连接产物转入endura感受态细胞中，经测序无误后，即获得正确的重组载体plenti 6.3-ova。
[0107]
2.包装病毒
[0108]
将88.4μl lipofectamine 2000(invitrogen，cat#11668019)和2.5ml opti-mem(gbico)混合均匀，5min后加入重组载体plenti6.3-ova 15μg、pvsvg质粒7.5μg、pspax2质粒11.25μg和2.5ml opti-mem(gbico)，25℃孵育25min，得到混合物。在t150 flask中接种2.8
×
107/ml的人胚肾细胞293ft中，孵育25min。然后将混合物加入到t150 flask中与293ft细胞混匀，充分混匀孵育。12h后更换为含有10％fbs的dmem新鲜培养基(gibco，1x anti-anti)。继续培养，在48h～72h之间收集细胞培养上清，获得含有慢病毒的上清。
[0109]
3.病毒感染获得mc38-ova克隆细胞
[0110]
在浓度为0.5
×
106/ml的mc38细胞中加入1ml步骤2中制备获得的含有慢病毒的上清液以及1mldmem新鲜培养基，然后加入6μg/ml polybrene(购买自sigma)。培养24h后，更换为2ml含有10％fbs的dmem新鲜培养基(gibco，1x anti-anti)。之后利用无限稀释法得到稳定表达ova蛋白的mc38单克隆细胞，即mc38-ova克隆细胞。
[0111]
二、荷瘤小鼠构建
[0112]
分别选用6至12周的cd28
+/+ crbn
i391v
、cd28-/
‑ crbn
+/+
和cd28-/-crbn
i391v
雌鼠用于肿瘤模型构建。接种肿瘤前一天将小鼠一侧的毛剃除。接种当天将用于接种的mc38-ova肿瘤细胞消化收集，然后重悬至预冷的pbs中，密度为2x10^7/ml。将mc38-ova小鼠结肠癌细胞经皮下注射至小鼠前肢腋下，接种细胞时，每只小鼠接种100μl细胞悬液(2x10^6cells/mouse)。接种细胞后5天肿瘤会长至80mm3左右，构建得到荷瘤小鼠。
[0113]
三、来那度胺或其类似物对cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠抗肿瘤免疫以及肿瘤生长的影响
[0114]
将上述构建的荷瘤小鼠随机分组，保证每组小鼠肿瘤的平均体积一致，即将小鼠共分为以下6组，每组6只：
[0115]
①
cd28
+/+ crbn
i391v
(对照组1)
[0116]
②
cd28
+/+ crbn
i391v
(实验组1)
[0117]
③
cd28-/
‑ crbn
+/+
(对照组2)
[0118]
④
cd28-/
‑ crbn
+/+
(实验组2)
[0119]
⑤
cd28-/-crbn
i391v
(对照组3)
[0120]
⑥
cd28-/-crbn
i391v
(实验组3)
[0121]
其中，对照组1～3给予药物溶剂(0.5％cmc，5μl/g，daily)，即给予质量百分比为0.5％的cmc，每天给药，每天每只小鼠的给药量为每g体重5μl。其中，cmc购自sigma，cat#419273-100g。
[0122]
实验组1～3给予来那度胺，其中，来那度胺用质量百分比为0.5％的cmc配制而成，每天给药，每天每只小鼠的给药量为50mpk。
[0123]
按上述方式对小鼠进行灌胃给药，连续给药10天，记录10天内肿瘤体积变化，如图2a所示(小鼠肿瘤体积计算公式为：volume＝length x width x width/2)。(b-e)在药物处理的第10天，安乐死(a)中荷瘤小鼠，分离肿瘤进行肿瘤浸润淋巴细胞分析，根据细胞表面标志物将这些细胞分为：总免疫相关细胞(cd45
+
，b)、cd8
+ t细胞(cd45
+ cd8
+
，c)、cd4
+ t细
胞(cd45
+ cd4
+
，d)和毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
，e)，n≥5。
[0124]
图2结果表明来那度胺可以cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内抑制肿瘤的过度生长，并增强t细胞抗肿瘤免疫。
[0125]
由图2a可知，不同基因型小鼠在给药后肿瘤体积的变化。
[0126]
由图2b可知，与对照组1的cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠相比，对照组3的cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠肿瘤中，以cd45为细胞表面标志物的总免疫细胞的浸润比例下降；在cd28
+/+ crbn
i391v
实验组1小鼠中来那度胺无法上调肿瘤中总免疫细胞的浸润比例；而cd28-/
‑ crbn
i391v
(实验组3)小鼠中，来那度胺可以显著地上调肿瘤中总免疫细胞的浸润比例。
[0127]
由图2c可知，与cd28
+/+ crbn
i391v
(对照组1)小鼠相比，cd28-/
‑ crbn
i391v
(对照组3)小鼠肿瘤中cd8
+ t细胞的浸润比例下降；在cd28
+/+ crbn
i391v
(实验组1)小鼠中来那度胺无法上调肿瘤中cd8
+ t细胞的浸润比例；而在cd28-/
‑ crbn
i391v
(实验组3)小鼠中，来那度胺可以显著地上调肿瘤中cd8
+ t细胞的浸润比例。
[0128]
由图2d可知，与cd28
+/+ crbn
i391v
(对照组1)小鼠相比，cd28-/
‑ crbn
i391v
(对照组3)小鼠肿瘤中cd4+ t细胞的浸润比例下降；在cd28
+/+ crbn
i391v
(实验组1)和cd28-/
‑ crbn
i391v
(实验组3)小鼠中，来那度胺都无法影响肿瘤中cd4+ t细胞的浸润比例。
[0129]
由图2e可知，与cd28
+/+ crbn
i391v
(对照组1)小鼠相比，cd28-/
‑ crbn
i391v
(对照组3)小鼠肿瘤中浸润的高细胞毒性(granzymeb
high
)的cd8
+ t细胞比例并没有发生变化；在cd28
+/+ crbn
i391v
(实验组1)和cd28-/
‑ crbn
i391v
(实验组3)小鼠中，来那度胺都可以显著上调肿瘤中浸润的高细胞毒性(granzymeb
high
)的cd8
+ t细胞比例。
[0130]
实施例3来那度胺或其类似物增强b16f10-ova小鼠黑色素瘤对pd-1抗体的响应
[0131]
本发明选择无法对pd-1抗体单药治疗产生响应的b16f10-ova小鼠黑色素瘤模型进行实验，测定在cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠体内测试来那度胺对pd-1抗体疗效的影响。
[0132]
本发明在b16f10的基础上构建了b16f10-ova细胞系，构建的流程和方法参见实施例2mc38-ova细胞系构建。在得到b16f10-ova细胞系之后，本发明利用该细胞系构建了b16f10-ova小鼠黑色素瘤皮下肿瘤模型，并尝试了来那度胺和pd-1抗体(bio x cell，cat#be0146)的联合治疗。
[0133]
具体步骤如下：将b16f10-ova小鼠黑色素瘤细胞皮下注射至cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠前肢腋下(2x10^6cells/mouse)，在接种肿瘤后第4天(肿瘤大小约为50mm3)，将cd28
+/+ crbn
i391v
荷瘤小鼠随机分为4组，如下所示：
[0134]
组1(cmd+isotype)：给予cmd和isotype。
[0135]
组2(cmd+αpd1)：给予cmd和αpd1。
[0136]
组3(len+isotype)：给予len和isotype。
[0137]
组4(len+αpd1)：给予len和αpd1。
[0138]
其中，cmc、αpd1、len、isotype的配比和给药方式等信息如下表3所示：
[0139]
表3
[0140]
ꢀꢀ
给药量给药方式给药间隔cmc(来那度胺的溶剂对照)质量百分比为0.5％的cmc5μl/g口服灌胃每天一次len溶解在质量百分比0.5％的cmc中50mpk口服灌胃每天一次αpd1溶解在pbs里5mpk腹腔注射每两天一次
isotype(pd-1抗体的对照)溶解在pbs里5μl/g腹腔注射每两天一次
[0141]
其中，isotype(invivoplus rat igg2a isotype control，bioxcell，cat#bp0089.)；小鼠pd-1抗体，是在大鼠(rat)中生产的，属于igg2a免疫球蛋白，称为大鼠抗三硝基苯酚抗体。在实验过程中，需要排除igg2a免疫球蛋白对于小鼠免疫系统的非特异性影响；因为哺乳动物细胞不会产生三硝基苯酚，将该igg2a免疫球蛋白作为对照，其不会对小鼠的免疫系统产生任何特异性的影响，是pd-1抗体的理想对照。
[0142]
pd-1抗体(bioxcell，cat#bp0273)。
[0143]
连续给药6天，记录6天内肿瘤体积变化(n＝6)。在药物处理的第6天，安乐死小鼠，分离荷瘤小鼠的腋下肿瘤，进行称重(图3b)和拍照(图3c)。
[0144]
如图3所示，pd-1抗体单药和来那度胺单药治疗都无法抑制b16f10-ova肿瘤的生长。而来那度胺和pd-1抗体的联合使用可以显著抑制cd28
+/+ crbn
i391v
荷瘤小鼠肿瘤的生长。
[0145]
其中，图3(a)可知，来那度胺(len+isotype)或者pd-1抗体(cmc+αpd-1)单药治疗都无法减慢b16f10-ova肿瘤体积的增长；来那度胺和pd-1抗体的联合使用(len+αpd-1)可以显著减慢b16f10-ova肿瘤体积的增长。
[0146]
其中，图3(b)可知，在药物处理的第6天，安乐死荷瘤小鼠，分离小鼠腋下的肿瘤，进行称重，来那度胺(len+isotype)或者pd-1抗体(cmc+αpd-1)单药治疗都无法减少b16f10-ova肿瘤的重量；来那度胺和pd-1抗体的联合使用(len+αpd-1)可以显著减少b16f10-ova肿瘤的重量。
[0147]
其中，图3(c)可知，在药物处理的第6天，安乐死荷瘤小鼠，分离小鼠腋下的肿瘤，进行拍照，来那度胺(len+isotype)或者pd-1抗体(cmc+αpd-1)单药治疗都无法抑制b16f10-ova肿瘤的生长；来那度胺和pd-1抗体的联合使用(len+αpd-1)可以显著抑制b16f10-ova肿瘤的生长。
[0148]
实施例4来那度胺逆转cd28缺陷导致的pd-1抗体治疗失效
[0149]
虽然来那度胺可以在cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠体内增强pd-1抗体的疗效，但本发明聚焦的是肿瘤中浸润有大量cd28
‑ꢀ
cd8+ t细胞的实体瘤病人，所以本发明还是需要进一步测试来那度胺那能否在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内增强pd-1抗体的疗效。
[0150]
将mc38-ova小鼠结肠癌细胞皮下注射至cd28
+/+ crbn
i391v
或cd28-/
‑ crbn
1391v
小鼠前肢腋下(2x10^6cells/mouse)，接种肿瘤后第5天(肿瘤大小约为80mm3)，将荷瘤小鼠分为以下6组，分别进行以下给药方案：
[0151]
cd28-/
‑ crbn
i391v
(cmc_pbs)：在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠中给予cmc和pbs；
[0152]
cd28-/
‑ crbn
i391v
(cmc_αpd1)：在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠中给予cmc和αpd1；
[0153]
cd28-/
‑ crbn
i391v
(len_pbs)：在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠中给予len和pbs；
[0154]
cd28-/
‑ crbn
i391v
(len_αpd1)：在cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠中给予len和αpd1；
[0155]
cd28
+/+ crbn
i391v
(cmc_pbs)：在cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠中给予cmc和pbs；
[0156]
cd28
+/+ crbn
i391v
(cmc_αpd1)：在cd28
+/+
crbn
i391v
小鼠中给予cmc和αpd1。
[0157]
其中，cmc、αpd1、len、pbs的配比和给药方式等信息如下表4所示：
[0158]
表4
[0159]
ꢀꢀ
给药量给药方式给药间隔
cmc(来那度胺的溶剂对照)质量百分比为0.5％的cmc5μl/g口服灌胃每天一次len溶解在质量百分比0.5％的cmc中50mpk口服灌胃每天一次αpd1溶解pbs中5mpk腹腔注射每两天一次pbs(pd-1抗体的溶剂对照)——5μl/g腹腔注射每两天一次
[0160]
其中，pd-1抗体(bioxcell，cat#bp0273)
[0161]
连续给药9天，记录9天内肿瘤体积变化(n≥5)。在药物处理的第9天，对荷瘤小鼠进行安乐死，并分离小鼠腋下的肿瘤，分析肿瘤中浸润的淋巴细胞。根据表面标志物将细胞分为：总免疫相关细胞(cd45
+
，c)、cd8
+ t细胞(cd45
+ cd8
+
，d)和毒性t细胞(cd8
+ granzyme b
high
，e)。
[0162]
如图4所示，在缺少cd28共刺激受体的cd28-/
‑ crbn
i391v
小鼠体内，pd-1抗体无法像在cd28
+/+ crbn
i391v
小鼠体内那样继续抑制mc38-ova肿瘤的生长。此时，加入来那度胺，可以恢复pd-1抗体的疗效。对肿瘤微环境进行分析也发现，来那度胺可以增强肿瘤中总免疫细胞和cd8+ t细胞的浸润。而且，在有来那度胺处理的情况下，pd-1抗体可以发挥增强肿瘤中cd8+ t细胞毒性的作用。
[0163]
实施例5来那度胺与apd-1联合使用促进cd28-cd8+ t细胞增殖
[0164]
虽然以上在小鼠模型中的数据表明来那度胺这一类免疫调节药物可以增强浸润cd28
‑ꢀ
cd8+ t细胞的肿瘤病人对免疫治疗的响应，但是这一联合治疗方案是否能用于肿瘤病人还有待进一步确定。本发明利用结直肠癌病人的肿瘤样品进行了初步的联合治疗尝试，发现来那度胺联合pd-1抗体可以增强结直肠癌病人肿瘤中cd28-cd8+ t细胞的增殖能力。提示了来那度胺联合pd-1抗体有可能改善这些肿瘤中浸润有大量cd28
‑ꢀ
cd8+ t细胞的实体瘤病人的生存情况，是一种值得进一步在临床上测试的联合免疫疗法。
[0165]
从7例结直肠癌病人肿瘤中通过正向选择试剂盒(miltenyi biotec，cat#130-045-201)分选出cd8+ t细胞，进一步通过流式细胞分选，获得cd28-和cd28
+ cd8
+ t细胞，将第一步分选剩余的非cd8
+
细胞进行辐照用于刺激分选出的cd8
+ t细胞，然后利用5μm来那度胺(len)和10μg/mlαpd-1(biolegend，cat#329946)抗体处理受到刺激的cd8
+ t细胞，96小时后，通过流式细胞术检测被激活的(cd25
+
，a)和增殖中的(ki-67
+
，b)cd8
+ t细胞的比例.
[0166]
结果如图5所示：
[0167]
在图5(a)中，cd25
+
细胞的比例反应了t细胞的激活水平；来那度胺既可以促进cd28
‑ cd8
+ t细胞激活，又可以促进cd28
+ cd8
+ t细胞激活；但是，无论是在cd28-还是cd28
+ cd8
+ t细胞中，来那度胺联合pd-1抗体都无法进一步促进t细胞激活。
[0168]
在图5(b)中，ki-67+细胞的比例反应了t细胞的增殖能力；来那度胺既可以促进cd28-cd8
+ t细胞增殖，又可以促进cd28
+ cd8
+ t细胞增殖；在cd28
‑ cd8
+ t细胞中，来那度胺联合pd-1抗体可以进一步促进t细胞增殖；但是，在cd28
+ cd8
+ t细胞中，来那度胺联合pd-1抗体无法进一步促进t细胞增殖。
[0169]
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括
在本发明的范围内。