1.本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及一种非抗体依赖的泛素化修饰富集方法和检测方法。
背景技术：
：：2.蛋白质翻译后修饰在生物应对各种刺激并快速准确地调控生物过程中发挥重要作用。泛素化是一种广泛存在的可逆蛋白质翻译后修饰，它能调节底物蛋白的多种基本特征，包括稳定性、活性或定位等。泛素是真核生物中一种高度保守的含有76个氨基酸的小蛋白质。泛素的c端甘氨酸通过e1-e2-e3级联反应与底物蛋白上赖氨酸残基共价连接，同时该过程可由去泛素化酶逆转。单个泛素分子修饰底物蛋白上的单个赖氨酸残基，可形成单泛素化修饰。多个泛素分子修饰底物蛋白上的多个赖氨酸残基，可形成多泛素化修饰。由于泛素分子本身含有7个赖氨酸残基(k6、k11、k27、k29、k33、k48和k63)，已经共价修饰到底物蛋白上的泛素分子自身携带的7个赖氨酸残基还可继续被其他泛素分子共价修饰，形成泛素链。此外，泛素分子蛋白n端的甲硫氨酸也有一个自由的氨基(m1)，该氨基也可被其他泛素分子共价修饰，形成线性泛素链。因此，细胞中可存在单泛素化、多泛素化以及8类不同形式的同质泛素链修饰。如果一个泛素链上结合泛素本身不同的赖氨酸残基，形成混合或分支泛素链，则会进一步增加泛素链连接类型的复杂性。不同连接类型的泛素链被具有不同泛素结合域的效应蛋白识别，介导不同的信号通路。另外，泛素化修饰的动态变化控制着许多重要的生物过程，如细胞分裂、命运调控和迁移等。泛素化酶的功能或调控异常导致蛋白质泛素化修饰水平紊乱与多种疾病密切相关，如癌症、神经退行性变等。泛素化蛋白质及其修饰位点的鉴定是研究泛素化修饰发挥何种生物功能的先决条件。因此，深度覆盖的蛋白质泛素化修饰分析对研究其发挥生物学功能的分子机制具有重要意义。目前，基于质谱的蛋白质组学是研究蛋白质翻译后修饰非常有效的方法但是，蛋白质泛素化修饰底物由于含量较低，难以进行直接分析。为了提高蛋白质泛素化修饰底物的鉴定灵敏度和覆盖度，研究人员开发了一系列的富集方法对泛素化修饰蛋白质或肽段进行富集，如利用泛素结合结构域(ubds)、泛素异位表达(ectopicexpression)以及稳定的标记泛素交换体系(stabletaggedubiquitinexchange,stubex)对泛素化蛋白质或肽段进行富集，但是这些富集策略难以提供泛素化修饰位点的准确信息或样品适用类型狭窄。由于泛素化修饰蛋白质经胰蛋白酶水解后，泛素化修饰位点会残留双甘氨酸修饰的赖氨酸(k-ε-gg)，因此通过抗k-ε-gg泛抗体富集及质谱分析可实现泛素化修饰位点准确鉴定。该实验策略已广泛应用于泛素化修饰组学研究(然而泛素样蛋白质nedd8和isg15修饰底物的胰蛋白酶水解肽也含有k-ε-gg结构，因此抗k-ε-gg泛抗体难以将泛素化修饰肽段与泛素样蛋白质的修饰肽段进行区分。vyacheslav等使用胞内蛋白酶lys-c对蛋白质进行酶切后，泛素化修饰位点残留十三个氨基酸修饰的赖氨酸(k-ε-estlhlvlrlrgg)，避免了泛素样蛋白质nedd8和isg15修饰底物的干扰。然而，泛素化位点上残留的十三个氨基酸长度较长，会影响质谱对蛋白质泛素化位点的有效鉴定。另外，抗体对底物序列识别具有偏好性，不同批次抗体特异性存在差异，抗12h，得到结合修饰肽段的材料，利用洗脱液将富集的肽段从材料上洗脱下来，即得。23.在其中一些实施例中，s2步骤中对自由氨基进行封闭的试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-n-琥珀酰亚胺、丙酸-n-琥珀酰亚胺、丁酸-n-琥珀酰亚胺、1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上。优选甲醛。24.在其中一些实施例中，s4步骤中所述可富集标签的试剂为有生物素标签的氨基活性试剂(如nhs-ss-biotin，nhs-biotin，nhs-peg4-biotin)，s6步骤中的富集标记肽段的材料为链霉素亲和素基质材料。25.对于含有二硫键的生物素-氨基活性试剂(如nhs-ss-biotin)，洗脱液为20mmdtt，16℃-50℃反应0.5-2h，最终加入50mmiaa避光条件下进行烷基化；26.对于不含二硫键的的生物素-氨基活性试剂(如nhs-biotin，nhs-peg4-biotin)，洗脱液为10mmedta(ph8.2)及95％甲酰胺，90℃反应10min。27.在其中一些实施例中，对富集的肽段进行质谱分析，其检测器为orbitrap、iontrap、tof、quadrupole。28.在其中一些实施例中，待检测生物样品为真菌、细胞、组织、血液及体液中的一种及一种以上。29.本发明利用去泛素化家族酶，构建了一套简单、实用、操作方便的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法和检测方法，所述方法可用于研究特定类型的泛素化修饰模式，补充了目前抗体识别泛素化修饰富集方法无法针对特定泛素链修饰底物进行研究及存在序列识别偏好性的缺点。30.1、本发明涉及一种非抗体依赖的泛素化修饰富集方法，无需通过特异抗体即可富集泛素化修饰肽段；31.2、本发明可以针对不同类型去泛素化酶，对特定类型的泛素化修饰底物及其修饰位点进行鉴定，如usp家族(usp1、usp2、usp4、usp5、usp6、usp7、usp8、usp9x、usp10、usp15、usp16、usp20、usp21、usp25、usp27x、usp28)去泛素化酶特异性较低，基本能水解所有类型(m1,k6,k11,k27,k29,k33,k48,k63)泛素链，cyld去泛素化酶能特异性地水解k63及m1连接类型泛素链，outd3去泛素化酶能特异性地水解k6和k11连接类型泛素链，otub1去泛素化酶能高特异性地水解k48连接类型泛素链，otulin能高特异性地水解mi连接类型泛素链，amsh及brcc3去泛素化酶能高特异性地水解k63连接类型泛素链。附图说明32.图1、去泛素化酶usp2在不同反应体系中的泛素链去除效果检测。33.图2、本发明实施例2中所述非抗体依赖的泛素化修饰富集方法流程图。34.图3、hela细胞中的蛋白质泛素化修饰检测结果。35.图4、本发明实施例5中所述非抗体依赖的泛素化修饰富集方法流程图。具体实施方式36.本发明下列实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。37.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的
技术领域：
：的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。38.在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，a和/或b，可以表示：单独存在a，同时存在a和b，单独存在b这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。39.本发明的一些实施例中，涉及了一种非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，整个泛素化肽段富集流程包含以下几个部分：(s1)首先裂解细胞或组织，提取蛋白质；(s2)然后使用氨基活性试剂对蛋白质自由氨基进行封闭处理；(s3)使用能够去除泛素链的去泛素化酶水解底物蛋白质上的泛素链，蛋白泛素化修饰位点处会产生新的自由氨基；(s4)使用含有可富集标签的氨基活性试剂nhs-ss-biotin标记新产生的赖氨酸侧链氨基；(s5)利用蛋白水解酶对蛋白质进行酶切处理；(s6)利用链霉亲和素球对标记的肽段进行富集，从而得到泛素化修饰肽段。40.此后，可以利用液相-质谱联用对富集的肽段进行检测分析，得到蛋白质泛素化修饰位点信息。41.在其中一些实施例中，非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法以及检测方法，包括以下步骤：42.1、全蛋白提取43.配置8m尿素，0.1mhepes，ph8.0裂解缓冲液，细胞或组织样品中加入10倍体积裂解液，并通过超声或匀浆器进行进一步充分裂解，20000g，4℃离心后取上清，得到样品a。44.2、蛋白水平自由氨基封闭45.对总蛋白样品进行自由氨基封闭，样品a中加入浓度为10-200mm的氨基活性试剂，加入浓度为5-100mm的氰基硼氢化钠，在16℃-80℃条件下，封闭0.25-12h，并利用超滤管或分子排阻色谱去除封闭后样品中残留反应试剂，得到样品b。46.蛋白自由氨基全封闭的氨基活性试剂为甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、乙酸酐、丙酸酐、丁酸酐、乙酸-n-琥珀酰亚胺、丙酸-n-琥珀酰亚胺、丁酸-n-琥珀酰亚胺、1h-吡唑-1-甲脒盐酸盐中的一种及一种以上。47.3、泛素链去除48.样品b中加入0.1mhepes,ph8.0，将尿素浓度稀释至2m以下，加入去除泛素化修饰链的酶，酶用量为蛋白1/50-1/200，25℃-45℃条件下，酶切1-12h，得到样品c。49.用于泛素化修饰去除的酶为去泛素化酶家族蛋白质。50.4、含有可富集基团的nhs-ss-biotin试剂标记蛋白泛素化修饰位点处的自由氨基51.向样品c中加入浓度为5mm-50mm的nhs-ss-biotin试剂，在16℃-50℃条件下，标记0.5-2h，利用超滤管或分子排阻色谱去除样品中残留反应试剂，得到样品d。52.5、蛋白质酶切53.向样品d中加入0.1mhepes，ph8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2m以下，根据蛋白质的质量加入蛋白水解酶，蛋白质水解酶的用量为蛋白质的1/50-1/200，在16℃-45℃条件下，酶切2-24h，得到样品e。54.蛋白质酶切所用的酶为胰蛋白酶trypsin、梭菌蛋白酶arg-c、蛋白内切酶glu-c、金属蛋白质内切酶lys-n、胰凝乳蛋白酶chymotrypsin、木瓜蛋白酶、弹性蛋白酶、胃蛋白酶中的一种及一种以上联合使用。55.6、biotin-pullown富集生物素标记的泛素化肽段56.a.酶切肽段溶液中分别加入终浓度20mmtris-hcl,ph7.6，1mmedta，0.4％tritonx-100；57.b.取40μl链霉素亲和素基质球，5,000g离心3min，去除上清，pbs清洗三次；58.c.将酶切肽段溶液加入链霉素亲和素基质球中，室温孵育2h；59.d.5,000g离心3min，去除上清，使用washingbuffer(20mmtris-hcl,ph60.7.6，1mmedta，0.4％tritonx-100，600mmnacl)清洗结合了生物素标记的泛素化肽段的链霉素亲和素基质球4次，之后再用pbs清洗3次；61.e.加入20mm二硫苏糖醇重悬结合了生物素标记的泛素化肽段的链霉素亲和素基质球，50℃条件下孵育30min；62.f.加入终浓度50mm的碘乙酰胺，室温避光条件下孵育45min；63.g.5,000g离心5min，取上清，即得到富集的泛素化肽段样品f；64.7、液相-质谱分析65.将样品f用c18stagetip进行除盐，之后进行液相-质谱分析，对产生的质谱数据进行软件解析，得到蛋白质泛素化修饰位点信息。66.对富集的肽段进行质谱分析所用的检测器为orbitrap、iontrap、tof、quadrupole一种及一种以上。67.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。以下实施例为本发明较优的实施方式，但是本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与基本思想下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应视为等效的置换方式，都应包含在本发明的保护范围之内。68.实施例169.为了验证本发明所述方法的可行性，我们首先纯化了低特异性链选择去泛素化酶usp2和usp21，并对在不同反应体系中泛素链去除效率进行评估。70.将去泛素化酶usp2或者usp21与hela裂解液在不同反应体系中孵育，之后通过westernblot检测hela蛋白中泛素链修饰水平变化。71.实验包括以下步骤：72.s1:以宫颈癌hela细胞为样品，样品均分3份，分别使用①8m尿素,100mmhepes，ph8.0；②4％脱氧胆酸钠，100mmhepes，ph8.0；③6m盐酸胍，100mmhepes，ph8.0为裂解液，对hela细胞进行裂解并提取蛋白质，进一步使用bca试剂盒对hela裂解液进行蛋白定量。73.s2:每一种细胞裂解液分别取100μg，用100mmhepes，ph8.0缓冲液分别稀释1倍、2倍、4倍和8倍。74.s3：加入终浓度为5mm的二硫苏糖醇，按照酶与底物1:200(质量比)的比例加入去泛素化酶usp2或usp21，37℃孵育2h。75.s4：进一步蛋白质免疫印迹实验用p4d1抗体来检测反应不同系统系中泛素化修饰蛋白信号强度。76.如图1结果显示，usp2与稀释不同倍数的脱氧胆酸钠细胞裂解液或盐酸胍细胞裂解液孵育后，泛素化信号强度很高，相对于不加usp2孵育的样品无明显变化，说明usp2在脱氧胆酸钠和盐酸胍反应体系中usp2酶活性很低，无法将泛素化蛋白上的泛素链水解；usp2在稀释1倍(8m)和2倍(4m)的尿素细胞裂解液中孵育后，泛素化信号强度也很高，相对于不加usp2孵育的样品无明显变化，当细胞裂解液中尿素浓度稀释4倍(2m)和8倍(1m)后再与usp2共孵育，泛素化信号强度很弱，相对于不加usp2孵育的样品明显降低，说明usp2在2m及以下浓度尿素中酶活性非常高(实验结果表明，反应体系中如果含有脱氧胆酸钠或盐酸胍，即使稀释到比较低的浓度，也会使去泛素化酶usp2和usp21酶失活，而反应体系中如果含有尿素，尿素浓度稀释至2m及以下去泛素化酶usp2和usp21还能保持高活性。)，能够显著去除hela蛋白上的泛素链修饰，usp21实验结果与usp1完全一致，提示本发明所述方法能够通过去泛素化酶成功暴露蛋白泛素链修饰处赖氨酸ε氨基，并为后续进一步标记上可富集标签提供可能。77.实施例2：78.本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：79.s1:以宫颈癌hela细胞为样品，按照图2的技术路线。使用8m尿素,100mmhepes，ph8.0为裂解液，对hela细胞进行裂解并提取蛋白质。进一步使用bca试剂盒对hela裂解液进行蛋白定量，根据bca定量结果，将hela裂解液蛋白质浓度稀释为1mg/ml。80.s1:取1mghela蛋白溶液，加入终浓度为20mm的氰基硼氢化钠和40mm的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应；81.s2:将二甲基化标记的hela蛋白质裂解液转移至10kda的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mmhepes，ph8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2m；82.s3:加入终浓度为5mm的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶usp2与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；83.s4:然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mm的nhs-ss-biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mmhepes,ph8.0继续洗三遍；84.s5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液。85.s6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mm的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mm的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理。86.s7:对干燥得到的肽段进行lc-ms/ms分析以及原始文件的maxquant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。87.如图3所示，利用maxquant软件检索，三次技术重复实验分别鉴定到1167、1115、1138个泛素化修饰位点，分别对应896、847、897个泛素化肽段和666、649、672个泛素化蛋白，说明本发明的技术路线能够有效鉴定到蛋白质泛素化修饰，同时三次技术重复实验鉴定到的泛素化修饰位点、肽段和蛋白数目都相当，说明本发明的方法实验稳定性很高，能够很好的应用与生命科学问题研究中。88.实施例3：89.本实施例的非抗体依赖的针对蛋白质线性m1连接类型泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：90.s1:以宫颈癌hela细胞为样品，按照图2的技术路线。使用8m尿素,100mmhepes，ph8.0为裂解液，对hela细胞进行裂解并提取蛋白质。进一步使用bca试剂盒对hela裂解液进行蛋白定量，根据bca定量结果，将hela裂解液蛋白质浓度稀释为1mg/ml；91.取1mghela蛋白溶液，加入终浓度为20mm的氰基硼氢化钠和40mm的乙醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应；92.s2:将二甲基化标记的hela蛋白质裂解液转移至10kda的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mmhepes，ph8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2m；93.s3:加入终浓度为5mm的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶otulin与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；94.s4:然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mm的nhs-ss-biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mmhepes,ph8.0继续洗三遍；95.s5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；96.s6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mm的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mm的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理；97.s7:对干燥得到的肽段进行lc-ms/ms分析以及原始文件的maxquant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。98.实施例4：99.本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：100.s1:以人血浆为样品，按照图2的技术路线。加入8m尿素,100mmhepes，ph8.0裂解液稀释血浆，并使血浆蛋白变性。进一步使用bca试剂盒对血浆样品进行蛋白定量，根据bca定量结果，将血浆蛋白质浓度进一步稀释为1mg/ml；101.取1mg血浆蛋白溶液，加入终浓度为20mm的氰基硼氢化钠和40mm的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应；102.s2:将二乙基化标记的血浆蛋白质裂解液转移至10kda的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mmhepes，ph8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2m；103.s3:加入终浓度为5mm的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶usp2与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；104.s4:然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mm的nhs-ss-biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mmhepes,ph8.0继续洗三遍；105.s5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；106.s6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入终浓度20mm的二硫苏糖醇，50℃反应30min，打开生物素标记试剂与肽段间的二硫键，进一步加入50mm的碘乙酰胺，室温避光孵育30min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理；107.s7:对干燥得到的肽段进行lc-ms/ms分析以及原始文件的maxquant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。108.实施例5：109.本实施例的非抗体依赖的蛋白质泛素化修饰富集方法，包括以下步骤：110.s1:以人结直肠癌组织为样品，按照图4的技术路线。将组织剪碎，加入8m尿素,100mmhepes，ph8.0，使用匀浆器将组织裂解。进一步使用bca试剂盒对血浆样品进行蛋白定量，根据bca定量结果，将人结直肠癌组织蛋白提取液蛋白浓度稀释为1mg/ml。111.取1mg组织蛋白溶液，加入终浓度为20mm的氰基硼氢化钠和40mm的甲醛，37℃孵育2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应；112.s2:将二甲基化标记的组织蛋白质裂解液转移至10kda的超滤管中，14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再加入3倍体积100mmhepes，ph8.0，将溶液中尿素浓度稀释至2m；113.s3:加入终浓度为5mm的二硫苏糖醇，按照去泛素化酶usp21与蛋白质的质量比为1:200对底物蛋白上泛素链进行水解，37℃消化2h；14,000g离心30min，弃去流穿液；114.s4:然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次。加入终浓度为10mm的nhs-biotin试剂，30℃反应2h，之后加入终浓度为100mm的tris-hcl,ph8.0终止反应。14,000g离心30min，弃去流穿液；然后使用8m的尿素水溶液，清洗三次，再使用100mmhepes,ph8.0继续洗三遍；115.s5:按照胰蛋白酶与蛋白质的质量比为1:50对蛋白质进行酶切，37℃消化12h。14,000g离心30min，收集流穿液，即酶切后肽段溶液；116.s6:使用链霉素亲和素球对含有生物素标记的肽段进行富集，室温孵育2h。最后洗脱时加入10mm的edta(ph8.2),95％的甲酰胺，90℃反应10min，将洗脱下的肽段进行除盐及干燥处理。117.s7:对干燥得到的肽段进行lc-ms/ms分析以及原始文件的maxquant搜索，实现对蛋白质泛素化修饰肽段的鉴定。118.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12当前第1页12