一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法与流程

1.本技术涉及药物分析技术领域，特别是涉及一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法。


背景技术：

2.哌柏西利(palbociclib)是一种高选择性的细胞周期蛋白依赖性激酶cdk4和cdk6可逆性拮抗剂，能够恢复细胞周期控制，阻断肿瘤细胞增殖。已于2015年2月经美国fda加速批准上市，用作乳腺癌的一线治疗药物。目前关于哌柏西利及其中间体的制备、合成及其杂质分析均有大量报道，但关于其合成工艺中起始原料基因毒性杂质的关注较少。
3.多数文献报道4-(6-氨基吡啶-3-基)哌基-1-羧酸叔丁酯(式i)作为哌柏西利合成路线中的起始原料。原研药相关专利cn110746418a报道，国内大部分生产厂家均采用以下路线生产该物料，关于该物料的合成工艺中杂质及其制备也均有文献报道，但关于其特定基因毒性杂质的检测报道较少。
[0004][0005]
原研药相关专利cn111239299中，哌柏西利存在若干结构类似的杂质，给分离带来难度，此外，各杂质的极性各不相同，导致检测难度较大。为了准确的控制哌柏西利及其产品的质量，有必要开发出一种灵敏度高、专属性好的用于该药物合成过程中基因毒性杂质的检测方法，特别是严格控制起始原料中亚硝胺和胺类的基因毒性杂质，从而实现对哌柏西利药物质量的精准、有效控制，从而保证哌柏西利用药的安全性，具有重大的研究意义。


技术实现要素：

[0006]
本技术的目的在于提供一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，以测定合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，解决合成哌柏西利的起始原料中的基因毒性杂质检测方法的稀缺性和哌柏西利用药的安全性问题。具体技术方案如下：
[0007]
本技术提供一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，其中，采用高分辨液质联用仪(高效液相色谱-高分辨质谱联用仪)测定基因毒性杂质的含量；所述基因毒性杂质包括基因毒性杂质a、b、c、d、e，化学结构式分别如下：
[0008][0009]
合成哌柏西利的起始原料的结构式如下：
[0010][0011]
所述检测方法包括：
[0012]
(1)获得对照品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0013]
以体积比为3:1-5:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制含有已知浓度的5种基因毒性杂质的对照品溶液；其中，基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度为3-20ng/ml；
[0014]
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为v1的对照品溶液注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0015]
(2)获得待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0016]
以体积比为3:1-5:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制合成哌柏西利的起始原料的待测样品溶液，合成哌柏西利的起始原料浓度c1为0.1-1mg/ml；
[0017]
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为v1的待测样品溶液注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0018]
(3)确定合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量；
[0019]
分别计算待测样品溶液中各基因毒性杂质的浓度cs＝as
×
ci/ai，根据cs/c1计算出合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量，单位为ppm；
[0020]
其中，as为待测样品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ai为对照品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ci为对照品溶液中各基因毒性杂质的浓度，ng/ml。
[0021]
本技术提供的一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，采用高
分辨液质联用仪，可以有效的分离哌柏西利起始原料主成分峰及各基因毒性杂质峰，极大的提高了基因毒性杂质的检测灵敏度，从而可以简单、快速、稳定的检测合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，以便有效的控制合成哌柏西利的起始原料的质量，避免有害杂质未检出可能带来的风险，进而保证哌柏西利用药的安全性，减少患者用药副反应的发生；所述方法具有简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强等优势。
附图说明
[0022]
为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
[0023]
图1为实施例1中基因毒性杂质a对照品溶液的液相-高分辨色谱图。
[0024]
图2为实施例1中基因毒性杂质b对照品溶液的液相-高分辨色谱图。
[0025]
图3为实施例1中基因毒性杂质c对照品溶液的液相-高分辨色谱图。
[0026]
图4为实施例1中基因毒性杂质d对照品溶液的液相-高分辨色谱图。
[0027]
图5为实施例1中基因毒性杂质e对照品溶液的液相-高分辨色谱图。
[0028]
图6为实施例1中基因毒性杂质a、b、c、d、e对照品溶液的液相-高分辨色谱图的叠加图。
具体实施方式
[0029]
下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员基于本技术所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
[0030]
本技术提供了一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，其中，采用高分辨液质联用仪测定基因毒性杂质的含量；所述基因毒性杂质包括基因毒性杂质a、b、c、d、e，化学结构式分别如下：
[0031][0032]
合成哌柏西利的起始原料的结构式如下：
[0033][0034]
所述检测方法包括：
[0035]
(1)获得对照品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0036]
以体积比为3:1-5:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制含有已知浓度的5种基因毒性杂质的对照品溶液；其中，基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度为3-20ng/ml；
[0037]
在相同的色谱条件和质谱条件下，将体积为v1的对照品溶液注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0038]
(2)获得待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0039]
以体积比为3:1-5:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制合成哌柏西利的起始原料的待测样品溶液，合成哌柏西利的起始原料浓度c1为0.1-1mg/ml；
[0040]
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取体积为v1的待测样品溶液注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0041]
(3)确定合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量；
[0042]
根据外标法分别计算待测样品溶液中各基因毒性杂质的浓度cs＝as
×
ci/ai，根据cs/c1计算出合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量，单位为ppm；
[0043]
其中，as为待测样品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ai为对照品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ci为对照品溶液中各基因毒性杂质的浓度，ng/ml。
[0044]
本技术所述对照品溶液的配制方式，可以是各自配制而成的单一对照品溶液，也
可以配制成混合对照品溶液，本技术对此不做限定，只要能实现本技术的目的即可。
[0045]
本技术所述检测方法中，将待测样品溶液和对照品溶液注入高分辨液质联用仪，所采用的的进样方式，本技术对此不做限定，只要能实现本技术的目的即可，例如可采用1.5ml进样小瓶装取约1ml待测样品溶液和对照品溶液，通过高效液相色谱仪的自动进样装置，分别进样检测，记录液相-高分辨色谱图。
[0046]
通过本技术的检测方法，对合成哌柏西利的起始原料中的基因毒性杂质进行分析，实现了微含量的定量检测，能够实现同时测定合成哌柏西利的起始原料中5种基因毒性杂质的含量，且操作简便、分离度好、灵敏度高、重现性好。
[0047]
本技术提供的一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，可以有效的分离合成哌柏西利的起始原料主成分峰及各基因毒性杂质峰，同时可以提高较高的专属性，避免假阳性杂质的检出，极大的提高了基因毒性杂质的检测灵敏度，能够简单、快速、稳定的检测合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，从而可用于合成哌柏西利的起始原料的质量控制，避免有害杂质未检出可能带来的临床风险。
[0048]
在本技术的一些实施方式中，所述对照品溶液中，基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度为3-8ng/ml。
[0049]
在本技术的一些实施方式中，所述色谱条件包括：
[0050]
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
[0051]
流动相：a相为体积分数为0.05-0.2％的甲酸水溶液，b相为体积分数为0.05-0.2％的甲酸乙腈溶液；采用体积分数0-75％a相，25-100％b相，梯度洗脱；柱温为40-50℃，流速为0.4-0.6ml/min，进样体积v1为5-15μl，检测波长为220-240nm。
[0052]
优选地，所述色谱条件包括：
[0053]
流动相：a相为体积分数为0.08-0.12％的甲酸水溶液，b相为体积分数为0.08-0.12％的甲酸乙腈溶液；柱温为43-47℃，流速为0.45-0.55ml/min，进样体积v1为8-12μl，检测波长为225-235nm。
[0054]
本技术所述色谱柱，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；本技术中，流动相比例对各基因毒性杂质与合成哌柏西利的起始原料的分离度有很大影响，发明人通过进一步研究发现，经过设置不同比例的流动相进行梯度洗脱，可达到各基因毒性杂质及合成哌柏西利的起始原料的准确分离，优选地，流动相的a相和b相的体积比，在0到10分钟内，设为75:25-0:100；在10到15分钟内，体积比为0:100，保持5分钟；然后将体积比调回75:25；在本技术的一些实施方式中，所述梯度洗脱具体为：0-10min，25-100％b相；10-15min，100-100％b相；15-15.1min，100-25％b相；15.1-30min，25-25％b相。
[0055]
在本技术的一些实施方式中，所述质谱条件包括：
[0056]
离子源为电喷雾电离源，离子源温度为400-500℃；鞘气流速为45-65psig，辅助气流量为10-20psig；归一化碰撞能量(nce)为10-150；离子传输管温度为300-400℃；扫描极性为正模式(positive)，扫描模式为平行反应监控模式(prm)或选择离子监控质谱法模式(sim)。
[0057]
优选地，所述质谱条件包括：
[0058]
离子源为电喷雾电离源，离子源温度为420-480℃；鞘气流速为50-60psig，辅助气流量为13-17psig；归一化碰撞能量为20-140；离子传输管温度为330-370℃。
[0059]
在本技术中，所述各基因毒性杂质的定性离子与定量离子包括：
[0060][0061]
本技术中，所述定性离子为一级定性离子，根据检测所得到的一级质谱图获得；所述定量离子为二级定量离子，根据检测所得到的二级质谱图获得；根据所述定性离子与定量离子确定各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积。
[0062]
本技术所述检测方法中，目标离子的归一化碰撞能量对检测结果中基因毒性杂质的灵敏度有很大影响，发明人研究发现，经过高分辨质谱碰撞室，基因毒性杂质a在nce为60时用于定量的离子质荷比(173.9544)有最大离子响应，基因毒性杂质b在nce为20时用于定量的离子质荷比(253.0938)有最大离子响应，基因毒性杂质c在nce为90时用于定量的离子质荷比(121.0764)有最大离子响应，基因毒性杂质d在nce为100时用于定量的离子质荷比(83.0611)有最大离子响应，基因毒性杂质e在nce为140时用于定量的离子质荷比(76.0187)有最大离子响应；综上所述，基因毒性杂质a在nce为60时，定量离子质荷比为173.9544；基因毒性杂质b在nce为20时，定量离子质荷比为253.0938；基因毒性杂质c在nce为90时，定量离子质荷比为121.0764；基因毒性杂质d在nce为100时，定量离子质荷比为83.0611；基因毒性杂质e在nce为140时，定量离子质荷比为76.0187。
[0063]
在本技术中，所述合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，基因毒性杂质a≤12ppm，基因毒性杂质b≤12ppm，基因毒性杂质c≤12ppm，基因毒性杂质d≤12ppm，基因毒性杂质e≤12ppm。
[0064]
本技术发明人发现，基因毒性杂质a、b、c、d、e均属于国际人用药品注册技术协调会(ich)中的3类杂质，根据ich m7的指导原则，需要对其进行杂质研究和控制；综合毒理学阈值(ttc)1.5μg/天的数据和实际工艺情况，最终确认基因毒性杂质a、b、c、d、e限度均为12ppm。
[0065]
优选地，所述合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，基因毒性杂质a≤6ppm，基因毒性杂质b≤6ppm，基因毒性杂质c≤6ppm，基因毒性杂质d≤6ppm，基因毒性杂质e≤6ppm。
[0066]
本技术检测方法的检测灵敏度高，基因毒性杂质a、b、c、d、e定量限均能够达到6ppm，远低于指标限度12ppm。
[0067]
本技术提供的一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，能够很好地检测合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，以控制基因毒性杂质a、b、c、d、e含量均≤12ppm，实现对合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质a、b、c、d、e的有效控制，进而实现对哌柏西利的质量控制，减少患者用药副反应的发生，一定程度保证患者用药的
安全性；优选地，控制基因毒性杂质a、b、c、d、e含量均≤6ppm。
[0068]
以下实施例中所涉及的试剂与药物如无特殊说明均可来源于市售或按照本领域公知方法取得。实施例的流动相中乙腈为色谱纯乙腈，如无特殊说明，实施例中的温度为设定温度，高效液相模块允许温度误差为
±
2℃，高分辨质谱模块允许温度误差为
±
5℃；实施例中对照品溶液和待测样品溶液的检测，均设置了所用溶剂的空白溶液做空白对照，此为本领域公知常识，本技术对此不做赘述。本检测方法为药物分析领域的外标法，以下实施例中的操作方式，没有进行详细说明的，均采用标准操作流程，例如溶液配制，系统适用性实验的操作方法等。
[0069]
实施例1
[0070]
(1)获得对照品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0071]
以体积比为4:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制含有已知浓度的5种基因毒性杂质的各对照品溶液；其中，基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度如表2所示；
[0072]
在相同的色谱条件和质谱条件下，取10μl的各对照品溶液分别注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积；得到的基因毒性杂质a、b、c、d、e的液相-高分辨色谱图分别如图1-图5所示，叠加图如图6所示，可见5种基因毒性杂质的色谱峰峰型良好；
[0073]
其中，所述色谱条件包括：
[0074]
色谱柱：agilent_zorbax sb-aq(250
×
4.6mm，5μm)；
[0075]
流动相：a相为体积分数为0.1％甲酸水溶液，b相为体积分数为0.1％甲酸乙腈溶液，梯度洗脱：0-10min，25-100％b相；10-15min，100-100％b相；15-15.1min，100-25％b相；15.1-30min，25-25％b相；柱温为45℃，流速为0.5ml/min，进样体积v1为10μl，检测波长为232nm；
[0076]
所述质谱条件包括：
[0077]
离子源为可加热的电喷雾电离源，离子源温度为450℃；鞘气流速为55psig，辅助气流量为15psig；离子传输管温度为350℃；扫描极性为正模式，扫描模式为平行反应监控模式；
[0078]
所述质谱检测中5种基因毒性杂质的定性离子与定量离子及相应质谱参数如表1所示，包括：
[0079]
表1
[0080][0081][0082]
(2)获得待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰面积；
[0083]
以体积比为4:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制合成哌柏西利的起始原料的待测样品溶液，合成哌柏西利的起始原料浓度c1如表2所示；
[0084]
在与步骤(1)中相同的色谱条件和质谱条件下，取10μl待测样品溶液注入高分辨液质联用仪中，通过质谱检测，根据各基因毒性杂质的定性离子与定量离子确定待测样品溶液中各基因毒性杂质的色谱峰，并获得各基因毒性杂质的色谱峰面积，如表2所示；
[0085]
(3)确定合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量；
[0086]
根据外标法分别计算待测样品溶液中各基因毒性杂质的浓度cs＝as
×
ci/ai，根据cs/c1计算出合成哌柏西利的起始原料中各基因毒性杂质的含量，单位为ppm，计算得到的各基因毒性杂质的含量结果见表2；
[0087]
其中，as为待测样品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ai为对照品溶液中各基因毒性杂质的峰面积；ci为对照品溶液中各基因毒性杂质的浓度，ng/ml。
[0088]
表2
[0089][0090]
方法学验证
[0091]
系统适用性
[0092]
根据基因毒性杂质a、b、c、d、e含量的限度为12ppm，相当于基因毒性杂质a、b、c、d、e的含量均≤12ng/mg，基于合成哌柏西利的起始原料的溶解度：配制的待测样品溶液中起始原料的浓度为0.5mg/ml，配制基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度均为6ng/ml的混合对照品溶液，待系统平衡重复进样6针，记录液相-高分辨色谱图，获得5种基因毒性杂质的峰面积，并计算各基因毒性杂质峰面积的rsd(相对标准偏差)值，得到的系统适用性试验结果见表3，可见基因毒性杂质a、b、c、d、e均符合规定，表明该方法系统适用性良好。
[0093]
定量限
[0094]
根据实施例1中所配制的对照品溶液，稀释2倍，配制成基因毒性杂质a、b、c、d、e浓度分别为3ng/ml的定量限溶液，进样检测，测得各基因毒性杂质的信噪比均大于10或响应良好，得到的定量限(loq)试验结果见表3，基于合成哌柏西利的起始原料的溶解度：配制的待测样品溶液中起始原料的浓度为0.5mg/ml，计算基因毒性杂质a、b、c、d、e的定量限含量均为6ng/mg，即基因毒性杂质a、b、c、d、e的定量限含量均为6ppm。
[0095]
线性与范围
[0096]
分别称取五种基因毒性杂质对照品适量，用体积比为4:1的乙腈-水溶液溶解并稀释，得到各基因毒性杂质的浓度依次为18、12、9、6、3ng/ml的溶液，取各溶液分别检测，以各
基因毒性杂质的浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，建立各基因毒性杂质的线性方程，线性与范围试验结果见表3，可见5种基因毒性杂质的线性相关系数均≥0.990，截距偏差均≤25％，5种基因毒性杂质在3-18ng/ml范围内的线性关系良好。
[0097]
准确度
[0098]
以体积比为4:1的乙腈-水溶液为溶剂，配制混合对照品储备液，各基因毒性杂质的浓度均为100ng/ml；称取合成哌柏西利的起始原料，加入混合对照品储备液，得到各基因毒性杂质的加入量分别为50％限度、100％限度、150％限度的加标溶液，其中起始原料的浓度均为0.5mg/ml，各基因毒性杂质的浓度依次为3ng/ml、6ng/ml、9ng/ml，每个浓度下的加标溶液平行配制3份；另称取合成哌柏西利的起始原料，用体积比为4:1的乙腈-水溶液溶解得到起始原料的浓度为0.5mg/ml的空白样品溶液，平行配制2份。记录各加标溶液和空白样品溶液的液相-高分辨色谱图，获得5种基因毒性杂质的峰面积，通过外标法分别计算出各加标溶液中5种基因毒性杂质的含量，按照以下公式计算加标回收率，准确度试验结果见表3，得到各基因毒性杂质的加标回收率均在80.0％-120.0％之间，说明各基因毒性杂质在50％-150％限度范围内加标回收率良好，表明本技术的方法准确度良好。
[0099]
准确度计算公式：
[0100][0101]
式中：m0为空白样品溶液中检测出的各基因毒性杂质含量，ng；
[0102]
m1为加标溶液中检测出的各基因毒性杂质含量，ng；
[0103]
m2为加标溶液中加入的各基因毒性杂质含量，ng。
[0104]
稳定性
[0105]
取系统适用性项下的混合对照品溶液于室温放置，分别在0、2、4、8、12、15小时进样检测，记录液相-高分辨色谱图，获得5种基因毒性杂质的峰面积，并计算与0h混合对照品溶液各基因毒性杂质峰面积的回收率，以不同时间下所测得的各基因毒性杂质的峰面积与0h峰面积的比值计算回收率，得到在15小时内5种基因毒性杂质峰面积的回收率结果均在3.3-12.5％之间，均≤15.0％，可知混合对照品溶液在15小时内稳定，稳定性试验结果见表3。
[0106]
表3
[0107][0108]
综上，本技术提供的一种合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的检测方法，可以有效的分离合成哌柏西利的起始原料主成分峰及各基因毒性杂质峰，极大的提高了基因毒性杂质的检测灵敏度，从而可以简单、快速、稳定的检测合成哌柏西利的起始原料中基因毒性杂质的含量，以便有效的控制合成哌柏西利的起始原料的质量，进而实现哌柏西利药物的质量控制，避免有害杂质未检出可能带来的风险；此方法简便、灵敏度高、分析速度快、专属性强。
[0109]
以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。