一种基于弛豫磁传感的血液中碱性磷酸酶检测方法

1.本发明属于磁弛豫生物传感领域，具体涉及一种基于弛豫磁传感的血液中碱性磷酸酶检测方法，构建基于mno2/mn
2+
转换体系实现对复杂样品中碱性磷酸酶的灵敏检测。


背景技术：

2.碱性磷酸酶(alp)作为分子生物学研究的重要生物标志物，也是许多人类疾病的诊断指标，如骨病(成骨细胞性骨癌，paget病和骨软化症)，肝脏疾病(肝炎和阻塞性黄疸)和癌症。血清中碱性磷酸酶正常范围在20-190u/l，alp含量高低与多种的疾病发生发展密切相关。因此，开发一种简单方便的alp检测方法将有利于alp相关疾病的诊断。
3.临床使用经典的比色法检测alp。然而，这些方法灵敏度较低。为克服经典比色法灵敏度低的缺点，近年来发展了许多不同的方法用于alp检测，主要基于信号放大的比色法，荧光，电化学发光和表面增强拉曼散射(sers)。其中，基于比色法的alp检测简单，无需大型仪器，但仍不够灵敏；基于荧光的检测具有出色的灵敏度，但由于需要合成额外的荧光纳米颗粒，操作复杂且费用昂贵；基于sers的alp定量检测，受限于其准确度。cn 106066325a公开了一种检测碱性磷酸酶的方法，利用碱性磷酸酶alp还原抗坏血酸磷酸酯aap生成抗坏血酸aa，然后抗坏血酸使cu
2+
还原成cu
+
，cu
+
可以抑制辣根过氧化物酶的活性，从而不能使tmb-h2o2溶液变色，实现了alp的检测。但该技术方案还是基于“比色法”，并且前置处理步骤a制备的混合溶液中加入hrp溶液，室温下反应后，通过加入tmb-h2o2显色溶液，分别检测其吸光度，构建碱性磷酸酶alp溶液浓度与吸光度的线性关系，该方法仍然需要在检测alp之前对样品进行复杂的前处理。
4.因此，有必要开发一种简单检测复杂样品中alp的方法。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种简单检测复杂样品中碱性磷酸酶的方法，旨在解决现有碱性磷酸酶检测方法存在的例如需要昂贵的材料试剂，且样品前处理程序复杂耗时等技术问题。
6.本发明所述的具体技术方案如下：
7.一种基于弛豫磁传感的血液中碱性磷酸酶检测方法，所述方法包括如下步骤：
8.1)将抗坏血酸磷酸酯aap溶液、mno2溶液和一系列浓度梯度的碱性磷酸酶alp溶液混合在pbs缓冲溶液中，然后37℃温育后，分别检测其横向弛豫时间；
9.2)另做一组空白实验，用等体积pbs缓冲液代替alp，操作与上述相同，计算横向弛豫时间变化值，构建碱性磷酸酶alp溶液浓度与横向弛豫时间变化值的线性关系；
10.3)利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶alp溶液浓度。
11.优选的，步骤1)中所述一系列浓度梯度的碱性磷酸酶alp溶液浓度设置为：5mu/l，10mu/l，50mu/l，100mu/l，200mu/l，500mu/l。
12.优选的，步骤1)中，pbs缓冲溶液的ph为7.0-8.5。
13.优选的，步骤1)中，所述抗坏血酸磷酸酯aap溶液浓度范围为50-400μm。
14.优选的，步骤1)中，所述mno2溶液浓度范围为2-40μg/ml。
15.优选的，步骤1)中所述反应，具体为在37℃下，抗坏血酸磷酸酯aap溶液和碱性磷酸酶alp溶液反应时间5-60min。
16.优选的一种检测碱性磷酸酶的方法，具体如下，
17.1)将100μl终浓度为200μm的抗坏血酸磷酸酯aap溶液、6μl终浓度为10μg/ml的mno2溶液和25μl一系列浓度梯度的碱性磷酸酶alp溶液混合在169μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，浓度梯度分别为5mu/l，10mu/l，50mu/l，100mu/l，200mu/l和500mu/l，在37℃下反应30min；
18.2)另做一组空白实验，用等体积缓冲液代替alp，操作与上述相同；
19.3)分别用核磁共振成像仪测定其横向弛豫时间，计算横向弛豫时间变化值δt2＝t
2实验组-t
2对照组
，构建碱性磷酸酶alp溶液浓度与横向弛豫时间变化值的线性关系。
20.本发明提供一种碱性磷酸酶的检测方法，利用碱性磷酸酶alp还原抗坏血酸磷酸酯aap生成抗坏血酸aa，然后抗坏血酸使mno2还原成mn
2+
，从而导致溶液水质子的横向弛豫时间(t2)改变，实现了alp的检测。将待测样品与抗坏血酸磷酸酯和mno2混合孵育，当待测样品中存在碱性磷酸酶时，所述混合液横向弛豫时间变短。mn
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有五个不成对电子，是一种顺磁性离子，可致溶液水质子的横向弛豫时间(t2)变短，而二氧化锰(mno2)中的mn原子以八面体几何形状配位到6个氧原子中，并且与水环境隔离，抑制了与质子的交换，对水质子的横向弛豫时间(t2)影响很小。随着alp的浓度增加，横向弛豫时间(t2)逐渐变短，因此该体系可以对不同浓度的alp进行定量检测。该方法简便，检测时间短，灵敏度高，无需复杂前处理。
附图说明
21.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
22.图1为基于mno2和抗坏血酸磷酸酯aap的磁弛豫传感器检测碱性磷酸酶alp的实验原理图；
23.图2为检测alp的可行性分析图,其中a为不存在alp，b为存在溶菌酶，c为存在alp；
24.图3为抗坏血酸磷酸酯浓度对本实验的影响图；
25.图4为二氧化锰浓度对本实验的影响图；
26.图5为ph对本实验的影响图；
27.图6为反应温度对本实验的影响图；
28.图7为反应时间对本实验的影响图；
29.图8为不同浓度alp溶液的水质子横向弛豫时间变化值(δt2)；
30.图9为血液中不同离子和蛋白质对本实验干扰图；分别为人血清白蛋白(hsa)、凝血酶(thr)、igg、葡萄糖氧化酶(gox)、溶菌酶(lys)，na
+
，k
+
，ca
2+
，mg
2+
和fe
3+
以及上述所有干扰物质的混合物。
具体实施方式
31.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实
施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
32.以下实施例基于mno2和抗坏血酸磷酸酯aap的磁弛豫传感器检测碱性磷酸酶alp的实验原理图如图1所示。
33.图2为检测alp的可行性分析图；不存在alp，存在非靶标溶菌酶和存在alp三种情况下的横向弛豫时间图，其中a为不存在alp，b为存在溶菌酶，c为存在alp，由图2可说明采用本技术方案检测alp是可行的。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式。
34.实施例1
35.一种检测碱性磷酸酶的方法，包括以下步骤：
36.将购买的碱性磷酸酶alp和抗坏血酸aap用一级水溶解，分别配成5mu/l，10mu/l，50mu/l，100mu/l，200mu/l和500mu/l的碱性磷酸酶alp溶液和50μm，100μm，200μm，300μm和400μm，并在4℃下保存备用。
37.1)将100μl终浓度为200μm的抗坏血酸磷酸酯aap溶液、6μl终浓度为10μg/ml的mno2溶液和25μl一系列浓度梯度的碱性磷酸酶alp溶液混合在169μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液中，浓度梯度分别为5mu/l，10mu/l，50mu/l，100mu/l，200mu/l和500mu/l，在37℃下反应30min；另做一组空白实验，用等体积缓冲液代替alp，操作与上述相同。
38.2)分别用核磁共振成像仪测定其横向弛豫时间，计算横向弛豫时间变化值δt2＝t
2alpx-t
2alp0
，构建碱性磷酸酶alp溶液浓度与横向弛豫时间变化值的线性关系；
39.3)利用线性关系，得到待检测碱性磷酸酶alp溶液浓度。
40.实施例2
41.一种检测碱性磷酸酶的方法，抗坏血酸磷酸酯浓度分别为50μm，100μm，200μm，300μm和400μm，其他与实施例1操作相同，结果如图3所示。
42.实施例3
43.一种检测碱性磷酸酶的方法，二氧化锰浓度分别为2μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml，40μg/ml，其他与实施例1操作相同，结果如图4所示。
44.实施例4
45.一种检测碱性磷酸酶的方法，pbs缓冲溶液的ph分别为7.0，7.4，8.0，8.5，其他与实施例1操作相同，结果如图5所示。
46.实施例5
47.一种检测碱性磷酸酶的方法，温度分别控制在4℃，25℃，37℃和50℃，其他与实施例1操作相同，结果如图6所示。
48.实施例6
49.一种检测碱性磷酸酶的方法，反应时间分别为5min，10min，15min，20min，30min，40min和60min，其他与实施例1操作相同，结果如图7所示。
50.图8为alp溶液的浓度为5mu/l，10mu/l，50mu/l，100mu/l，200mu/l和500mu/l的水质子横向弛豫时间变化值(δt2)；
51.实施例7选择性实验
52.在11组25μl，100mu/ml alp，凝血酶(thr)，葡萄糖氧化酶(gox)、溶菌酶(lys)，50μg/l人血清白蛋白(hsa)、igg，150mm na
+
，4mm k
+
，1mm ca
2+
，1mm mg
2+
，和10μm fe
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，分别加入
100μl终浓度为200μm的抗坏血酸磷酸酯aap溶液、6μl终浓度为10μg/ml的mno2和169μl ph＝7.4的pbs缓冲溶液再在37℃下反应30min，测定横向弛豫时间；另一组加入上述所有酶、蛋白和离子的混合物，操作与上述相同。
53.结果如图9所示，图9为血液中不同离子和蛋白质对本实验干扰图；分别为人血清白蛋白(hsa)、凝血酶(thr)、igg、葡萄糖氧化酶(gox)、溶菌酶(lys)，na
+
，k
+
，ca
2+
，mg
2+
和fe
3+
以及上述所有干扰物质的混合物，可见该方法对alp的检测的选择性很高。
54.本发明提供的碱性磷酸酶的检测方法，利用碱性磷酸酶alp还原抗坏血酸磷酸酯aap生成抗坏血酸aa，然后抗坏血酸使mno2还原成mn
2+
，从而导致溶液水质子的横向弛豫时间(t2)改变，实现了alp的检测。将待测样品与抗坏血酸磷酸酯和mno2混合孵育，当待测样品中存在碱性磷酸酶时，所述混合液横向弛豫时间变短。mn
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导致溶液水质子的横向弛豫时间(t2)变短，而二氧化锰(mno2)不影响水质子的横向弛豫时间(t2)。随着alp的浓度增加，横向弛豫时间(t2)逐渐变短，因此该体系可以对不同浓度的alp进行定量检测。
55.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者替换，而不脱离本技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。