一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒及其制备方法与流程

1.本技术涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.促卵泡生成素(fsh)、促黄体生成素(lh)、泌乳素(prl)、雌二醇(e2)、孕酮(prog)和睾酮(t)在调控人体的发育、生长、青春期性成熟、以及生殖相关的一系列生理过程发挥着重要作用，在人体健康指示上有着重要的意义。
3.目前市面上的一些荧光免疫检测性激素试剂盒多是承载单独试剂卡，能够检测的指标少，多种指标分批检测则需要更多的时间，且需要专业人员的操作才能完成，对于设备要求也高，价格昂贵。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒，该试剂盒配合仪器可同时对多个项目进行检测，且满足定性定量的分析需求，其检测结果能够为临床医生评估病人性激素水平提供精准的数据支撑。
5.本技术的另一目的在于提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒的制备方法，该制备方法工艺简单，成本低，检测结果精准可靠。
6.本技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
7.一方面，本技术实施例提供了一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒，包括：外壳、样本缓冲液以及设置于上述外壳上的多个检测卡；
8.上述外壳内设置至少三个卡槽，上述检测卡与上述卡槽一一对应；
9.上述检测卡包括底板以及搭接于上述底板上的滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫；
10.上述喷金垫上喷涂有荧光微球偶联复合物，上述检测垫上设有检测带和质控带，上述检测带包被预设抗体或抗原；上述质控带包被生物素化-bsa；
11.上述抗体或抗原为促黄体生成素抗体、促卵泡生成素抗体、泌乳素抗体、雌二醇抗原、雌激素抗原和睾酮抗原中的至少三种。
12.另一方面，本技术实施例提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒的制备方法，其制备步骤如下：
13.对荧光微球进行活化，活化后在其表面偶联预设抗体，用链霉亲和素进行修饰得到荧光微球偶联复合物，将上述荧光微球偶联复合物喷涂在玻璃纤维膜上，干燥备用；
14.使用硝酸纤维素膜作为检测垫层析试纸，分别在膜条前端包被检测抗体或抗原作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线，制得检测垫，然后进行干燥，烘烤备用；
15.将滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫依次粘合在底板上，层压严实，随后将层压完成的膜条裁切得到检测卡，再将检测卡匹配到上述外壳上的卡槽内；
16.最后将制备的样本缓冲液和装配好的检测卡装盒，得到试剂盒。
17.相对于现有技术，本技术的实施例至少具有如下优点或有益效果：
18.1、本技术基于荧光免疫层析法，同时结合生物素-链霉亲和素标记技术，提供了一种高灵敏度待测抗原检测卡及其制备方法。生物素-链霉亲和素系统具有高特异性、高灵敏度、高稳定性的特点，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。
19.2、本技术提供的一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒可一次性检测性激素六项指标，耗时短，15min内即可获得检测结果，并获得各项指标的定量浓度，为临床医生评估病人性激素水平提供精准的数据支撑。
附图说明
20.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
21.图1为本技术实施例一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒中检测试剂卡的加样面；
22.图2为本技术实施例一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒中的检测试剂卡的结果观测面；
23.图3为本技术实施例荧光免疫检测性激素多联试剂盒中检测卡的结构示意图；
24.图4为本技术的实施例荧光免疫检测性激素多练试剂盒的整体制备流程。
25.图标：100-外壳，110-加样区，120-混合槽，140-二维码，200-检测卡，201-滤血垫，202-喷金垫，203-检测垫，204-吸水垫，205-检测带，206-质控带，207-底板，210-标记区。
具体实施方式
26.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
27.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本技术。
28.一方面，本技术实施例提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒，包括外壳、样本缓冲液以及设置于上述外壳上的多个检测卡；
29.上述外壳内设置至少三个卡槽，上述检测卡与上述卡槽一一对应；
30.上述检测卡包括底板以及搭接于上述底板上的滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫；
31.上述喷金垫上喷涂有荧光微球偶联复合物，上述检测垫上设有检测带和质控带，上述检测带包被预设抗体；上述质控带包被生物素化-bsa；
32.上述抗体或抗原为促黄体生成素抗体、促卵泡生成素抗体、泌乳素抗体、雌二醇抗原、雌激素抗原和睾酮抗原中的至少三种。
33.需要说明的是，在本技术的一些实施例中，实现上述检测目的时，其中荧光微球偶
联复合物和质控带上包被的物质可以用以下方式进行等同替换：
[0034]ⅰ、荧光微球偶联复合物的抗体采用哺乳动物属种抗体，比如：鼠抗，质控带包被对应二抗，比如：兔抗鼠igg；
[0035]ⅱ、荧光微球偶联复合物的抗体采用非哺乳动物属种抗体，比如：igy，质控带包被对应二抗，比如：抗igy抗体；
[0036]ⅲ、荧光微球偶联复合物采用dnp(dinitrophenyl，1,3-二硝基苯)与抗体偶联微球，质控带包被bsa-dnp。
[0037]
本技术的多联试剂盒可一次性检测多种性激素相关指标，耗时短，操作简单，携带方便，对应检测指标分别采用夹心法和竞争法进行检测，结果更为精准。
[0038]
在本技术的一些实施例中，上述外壳上设置有加样区，上述加样区与上述滤血垫连通，方便加样。
[0039]
在本技术的一些实施例中，上述外壳上设置有混合槽，方便将样品和层析缓冲液放入其中进行稀释。
[0040]
在本技术的一些实施例中，上述荧光微球偶联复合物中含有链霉亲和素。亲和素与酶标生物素可以形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗体接触时，可以将微量抗原的信号放大成千上万倍，以便于检测。
[0041]
在本技术的一些实施例中，上述样本缓冲液包括以下成分：浓度为0.1～0.2mm的磷酸缓冲溶液、体积分数为0.5～0.8％的吐温20、体积分数为0.1～0.2％的proclin300防腐剂以及质量分数为0.7～1％的酪蛋白。其配制成分模拟人体内环境，用以对样本进行稀释的同时，不发生化学变化。
[0042]
另一方面，本技术实施例提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒的制备方法，其制备步骤如下：
[0043]
对荧光微球进行活化，活化后在其表面偶联预设抗体，用链霉亲和素进行修饰得到荧光微球偶联复合物，将上述荧光微球偶联复合物喷涂在玻璃纤维膜上，干燥备用；
[0044]
使用硝酸纤维素膜作为检测垫层析试纸，分别在膜条前端包被检测抗体或抗原作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线，抗体包被划线后干燥，烘烤备用；
[0045]
将滤血垫、喷金垫、检测垫和吸水垫依次粘合在底板上，层压严实，随后将层压完成的膜条，按照规格裁切成符合规格的片段，最后将剪裁完成的膜条得到检测卡，再将检测卡匹配到上述外壳上的卡槽内；
[0046]
最后将制备的样本缓冲液和装配好的检测卡装盒，得到试剂盒。
[0047]
在本技术的一些实施例中，上述荧光微球偶联复合物的保存液成分包括：质量分数为5～10％的海藻糖，质量分数为0.5～1％的牛血清白蛋白，体积分数为0.2～0.8％的吐温-20，体积分数为0.1％的防腐剂，浓度为10mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸。
[0048]
本技术的荧光微球偶联复合物的保存液选用海藻糖作为赋形剂，因为对赋形剂要求为性质稳定，不与抗原产生化学或物理影响，从而不影响人胎盘生长因子抗原的含量测定，所以选用海藻糖的范围在重量百分比为5％～10％。荧光微球与抗体的偶联比例对于其制备好的荧光免疫微球结合物的保存有影响，使得还未喷涂到喷金垫上就发生凝集现象。当体系中的抗体不足，微球表面在交联后还空出许多反应基团，这些基团又可以与连在微
球上的抗体反应，结果将微球又拉在一起，从而产生了聚集。但可以通过添加阻断剂比如：胎牛血清蛋白(bsa)进行解决，起到维持渗透压、提供ph缓冲及载体的作用，bsa浓度低于0.5％时难以起到ph缓冲及载体的作用，bsa浓度高于1％则使渗透压过大；防腐剂具有限定微生物活动的作用，但其含量不可过高，因此选用体积百分比为0.1％，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)与无机碳酸氢盐缓冲液相比，在组织或者器官培养中表现出更好的ph控制能力，因此本技术选用了hepes作为保存液的缓冲液。
[0049]
在本技术的一些实施例中，上述检测垫上t线包被抗原或抗体的喷涂量为1.0μg/cm，c线包被生物素化-bsa喷涂量为0.7μg/cm，统一划线更方便生产参数统一设定。
[0050]
在本技术的一些实施例中，上述检测垫划线后烘烤步骤为37℃12h后，60℃72h，使检测垫充分干燥，减少微生物存活几率，延长保质时间。
[0051]
作为一个总的发明构思，本技术还提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒在检测性激素水平中的应用，该方法操作简单，耗时短，可一次性得到多个检测指标的定量浓度，可为医生的临床诊断提供支持。
[0052]
以下结合实施例对本技术的特征和性能作进一步的详细描述。
[0053]
实施例1
[0054]
本实施例提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒及其制备方法。
[0055]
如图1所示，本实施例提供的一种荧光免疫检测性激素多联试剂盒中的试剂卡如图所示，包括：外壳100和6个检测不同指标的检测卡200，6个检测卡200分隔设置在外壳100的卡槽内；如图3所示，检测卡包括顺次搭接在底板207上的滤血垫201、喷金垫202、检测垫203和吸水垫204；喷金垫202喷涂荧光微球偶联复合物，荧光微球偶联复合物包括荧光微球，以及偶联在荧光微球上的链霉亲和素和预设抗体；检测垫203设有检测带205和质控带206，检测带205包被有待测指标的抗体，质控带206固定有生物素化-bsa。
[0056]
再参照图1，滤血垫201处还设有加样区110。滤血垫201与加样区110连通，方便加样。
[0057]
在本实施例中，外壳100设有两个用于混合样品的混合槽120。把样品和样本缓冲液加入混合槽120即可将其混匀。外壳100设有用于标记不同检测指标的标记区210。不同指标所用的抗体或抗原不同，为了避免混淆出现错误，在外壳100上设置颜色标记或文字标记，方便实验人员识别和加样。
[0058]
如图2所示，在本实施例中，外壳上还设有二维码140，通过扫描二维码可得到各项指标的标准曲线信息，根据标准曲线可计算各项指标的浓度，实现定量检测。需要说明的是，为了减小批内差异，不同批次的多联试剂卡的标准曲线不同，每制作一批多联试剂卡均需要制作六个指标的标准曲线。
[0059]
试剂卡的工作原理：取一定量的样本用样本缓冲液稀释后，将稀释后的层析液取75ul滴定加样区110，稀释后的层析液中混杂的血细胞会过滤在滤血垫201上，血清稀释液经毛细作用沿着纤维空隙流动，先经过喷金垫202与微球混合，并带着微球一块沿检测垫203的空隙流动，先后流经检测带205t线和质控带206c线，最后吸水垫204吸收。
[0060]
在整个血清稀释液的流动过程中，血清稀释液先与微球接触后产生第一次免疫反应，血清中的待检测抗原会与微球上检测抗体a结合；当混合有微球的血清稀释液流经检测带205t线时，有两种情况：
[0061]
一种是结合在微球上的抗原会与检测带205上的检测抗体b结合产生第二次免疫反应(夹心法)，随后，与抗原结合的微球会被固定在检测带205t线上；随着混合有微球的血清稀释液继续流动经过质控带206c线时，没有与抗原结合的微球通过链霉亲和素与质控带206c线上的生物素化-bsa产生第三次免疫反应，将微球结合在质控带206c线。结果显示为：待测物浓度越高，t峰越高，t/c值越大。
[0062]
另一种是结合在检测带205上的抗原相似物与荧光微球偶联复合物中的抗体结合产生第二次免疫反应(竞争法)，随着混合有微球的血清稀释液继续流动经过质控带206c线时，没有与抗原和抗原相似物结合的微球通过链霉亲和素与质控带206c线上的生物素化-bsa产生第三次免疫反应，微球结合在质控带206c线。结果显示为：待测物浓度越高，t线上能结合的荧光微球越少，t线峰值越低，t/c越小。
[0063]
本实施例检测6项性激素指标，分别为：促黄体生成素(lh)、促卵泡生成激素(fsh)、泌乳素(prl)、孕酮(prog)、雌二酵(e2)和睾酮(t)。
[0064]
另外，本实施例还提供一种荧光免疫检测性激素多联试剂卡的制备方法，包括以下步骤，其整体制备流程如图4所示：
[0065]
一、滤血垫的制备：
[0066]
滤血垫处理液的配制(100ml)：0.6g三羟甲基氨基甲烷(tris-base)，0.1g二水合乙二胺四乙酸二钠(edta na2·
2h2o)，1g牛血清白蛋白(bsa)，0.5g酪蛋白，5g海藻糖，2.5ml 0.01m pbs缓冲液，0.8ml吐温-20。
[0067]
加入适量纯化水溶解，定容至100ml，再用稀盐酸或氢氧化钠调整ph至8.5，混匀。将一张滤血膜放在干净的托盘中，倒入滤血垫处理液，浸没滤血膜，于水平摇床震荡浸泡30min，取出滤血膜，将处理完成的滤血膜置于37度生化培养箱中干燥24h，干燥完成后回收滤血膜备用。
[0068]
二、喷金垫的制备：
[0069]
(1)所需的试剂：
[0070]
①
聚苯乙烯荧光微球：1.05g/cm3，固体含量0.5％，直径160nm；
②
cn95硝酸纤维素膜；
③
微球活化缓冲液：0.1m ph6.0 mes(2-(n-吗啉代)乙磺酸)溶液；
④
偶联缓冲液：0.01m ph7.0 hepes溶液；
⑤
0.1mg/μl edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液；
⑥
0.1mg/μl nhs(n-羟基丁二酰亚胺)溶液；
⑦
封闭液：5％bsa+0.01m ph7.0 hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)；
⑧
微球保存液：10％海藻糖、0.5％bsa、0.8％tween-20、0.1％proclin300、0.01m ph7.0 hepes补齐；
⑨
样本缓冲液：0.2mm pb+0.5％tween20+0.1％proclin300+0.7％酪蛋白
⑩
抗原稀释液：25mm nah2po4·
2h2o(二水合磷酸二氢钠)、25mm na2hpo4·
12h2o(十二水合磷酸氢二钠)、0.3m nacl(氯化钠)、10mm d-mannitol(d-甘露醇)、0.6％chaps(3-[3-(胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸内盐)、0.1％proclin300防腐剂，ph＝7.5。
[0071]
(2)所需的设备：
[0072]
高速冷冻离心机、超声波清洗器、可调式混匀仪、旋转混匀仪、电子天平、切条机、点膜仪和ph计。
[0073]
(3)制备流程：
[0074]
使用红色荧光微球作为荧光标志物，先使用edc、nhs对荧光微球活化表面羧基，活化后在荧光微球上偶联检测抗体。将偶联抗体后的微球喷涂在玻璃纤维膜(喷金垫)上干燥
后备用。
[0075]
喷金垫处理液(100ml)的配制：称量1g bsa、6g蔗糖、1g pvp-k30加入超纯水中溶解，再量取1ml吐温20加入混合液中，搅拌均匀，定容至100ml；将玻璃纤维膜放在干净的托盘中，倒入处理液，于水平摇床震荡浸泡30min；将处理完成的喷金垫置于37℃生化培养箱中干燥24h，回收备用。
[0076]
将得到的荧光微球偶联复合物使用三维平面点膜喷金仪的喷金功能，设置参数，将荧光微球偶联复合物稀释2倍，按1.5μl/cm进行喷涂。将荧光微球偶联复合物喷在处理好的喷金垫上；将喷好荧光微球偶联复合物的喷金垫放置在37℃的生化培养箱中烘烤24小时。将烤好的已喷金垫子装在铝箔袋中，加上干燥剂，放在4℃冰箱备用。
[0077]
其中荧光微球偶联复合物的制备详细步骤如下：
[0078]
往100μl荧光微球中加入900μl 0.1m mes(ph6.0)，混匀超声5min，14400rpm离心12min弃上清；随后，加1ml 0.1m mes(ph6.0)，超声5min，离心弃上清；加500μl 0.1m mes(ph6.0)超声分散5min，加edc、nhs各1mg，60rpm旋转混匀1h(室温)，离心去上清；再向沉淀中加1ml hepes，超声5min，离心去上清，重复一次；再加入500μl hepes，超声5min，先加5μg链霉亲和素(sa)混匀，再加入抗体偶联(如表1所示)5μg混匀，60rpm旋转过夜2～8℃；之后，离心(上清保留测bca)，沉淀加500μl封闭液，超声混匀，封闭1h；随后，60rpm旋转混匀2h(室温)，离心去上清；最后，向沉淀中加1ml hepes离心去上清，加入保存液，保存比例1:1。
[0079]
表1相应抗原检测喷金垫上荧光微球复合物偶联的抗体
[0080][0081]
其中封闭液配方：125μl 20％bsa+375μl hepes
[0082]
其中保存液配方：10％海藻糖，0.5％bsa，0.8％tween-20，0.1％proclin300，10mm hepes补齐
[0083]
三、检测垫的制备：
[0084]
使用硝酸纤维素膜作为检测垫的免疫层析试纸条，使用三维平面点膜喷金仪的划膜功能，分别在膜条前端包被检测抗体作为检测带t线，在膜条后端包被生物素化-bsa作为质控带c线。在距离一端检测卡约1.2cm处喷涂t线，t线后约0.7cm处喷涂c线，喷涂的体积和质量按表2的设计进行，干燥1h；将包被完成的硝酸纤维素膜条在37℃条件下烘烤过夜。随后，将干燥好的检测垫收起，用铝箔袋装好，加入干燥剂，封口后再放置60℃生化培养箱中烤72h；拿出烤好的检测垫，放在4℃冰箱备用。
[0085]
表2检测线上包被的物质及划线量
[0086][0087][0088]
四、样本缓冲液的制备(100ml)：
[0089]
向玻璃容器中加入0.5ml tween-20，0.1ml proclin300，0.7g酪蛋白，再加入0.2mm pb溶液搅拌溶解，用稀盐酸或氢氧化钠将ph调节为7.4。
[0090]
五、组装：
[0091]
依次将滤血垫201、喷金垫202、检测垫203、吸水垫204黏贴在底板207上，层压严实。
[0092]
层压完成后的膜条，按规格裁切成合适的小段，其中检测卡的规格为2.5cm
×
0.5cm，吸水垫的规格为2cm
×
0.5cm，样品垫(血垫)的大小为1.2cm
×
0.5cm，安装在外壳卡槽中，制作成检测试剂卡。
[0093]
最后将样本缓冲液和检测试剂卡包装成盒。
[0094]
六、标准曲线的制备：
[0095]
对试剂盒进行测试：层析参数：血清/血浆50μl，全血75μl，缓冲液150μl，加样量75μl，层析时间15min。
[0096]
将待测样品和样本缓冲液在混合槽中混匀，随后加入加样区反应一段时间后开始层析。计时，时间到后扫描，读数。
[0097]
通过光学设备测量检测带t线与质控带c线的荧光强度，分别反映了结合抗原的微球量和未结合抗原的微球量。
[0098]
利用已知抗原浓度的样本进行层析，测量出不同浓度下的检测带t线与质控带c线
的荧光强度的对比值，制作出标准曲线公式。
[0099]
成品检测卡在使用时，通过测量未知浓度样本层析后检测卡上检测带t线与质控带c线的荧光强度的对比值，再代入标准曲线公式即可计算出样本浓度。
[0100]
结果评价标准：优先考虑浓度与比值之间的相关关系，以r2为评价标准，r2越大越好。
[0101]
实施例2
[0102]
本实施例与实施例1基本相同，区别点在于：
[0103]
样本缓冲液成分为：0.1mm pb+0.6％tween20+0.1％proclin300+0.8％酪蛋白。
[0104]
保存液成分为：
[0105]
0.01m ph7.0 hepes+1％bsa+0.2％tween-20+0.1％proclin300+10％海藻糖+1％甘油+1％乙二醇+0.2％聚乙烯吡咯烷酮(pvp10)。
[0106]
实施例3
[0107]
本实施例与实施例1基本相同，区别点在于：
[0108]
样本缓冲液成分为：0.1mm pb+0.8％tween20+0.3％proclin300+1％酪蛋白。
[0109]
保存液的成分：
[0110]
0.01m ph7.0 hepes+0.5％bsa+0.8％tween-20+0.1％proclin300+5％海藻糖+5％蔗糖+0.5％酪蛋白(casein)。
[0111]
综上所述，本技术实施例的荧光免疫检测性激素多联试剂盒具有可同时获得多项指标检测结果，效率高，成本低的特点。另外，本技术实施例的荧光免疫检测性激素多联试剂盒的制备方法工艺简单，成本低。
[0112]
以上所描述的实施例是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。