雅拢牛哈占波方剂的HPLC指纹图谱构建方法及检测方法与流程

雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱构建方法及检测方法
技术领域
1.本发明属于化学检测技术领域，具体涉及一种雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱构建方法及检测方法。


背景技术：

2.雅拢牛哈占波是傣医传统经方，收载于古傣医经书《档哈雅召书婉娜》，历史1300余年，该方由倒心盾翅藤、肾茶、圆锥南蛇藤、薏苡根、甘草组成，具有清热利尿化石的作用，用于治疗急慢性肾炎，肾盂炎，尿流感染，肾、输尿管、膀胱结石。西双版纳傣医医院在该传统经方基础上开发成医疗机构制剂“五淋化石胶囊”（滇药制字（z）20082254k号）应用临床20年，在治疗尿路感染和结石方面疗效确切且安全性高。同时，医院在对该处方制剂进行疗效研究时发现，其除排石作用外，还能降低血、尿肌酐，降低尿素含量，提示其有较好的保护肾功能作用。但由于目前傣医药发展缓慢，雅拢牛哈占波方剂缺乏现代可控的质控指标，质量标准有待提高和完善。
3.目前关于雅拢牛哈占波的质量检测研究报道较少，本发明通过建立hplc指纹图谱结合多成分同步含量测定方法，从定性和定量两个方面开展雅拢牛哈占波方剂的质量标准研究，提出质量评价标准建议，为雅拢牛哈占波方剂的质量标准研究提供线索，并为其他傣医传统经典名方的物质基础阐释提供参考。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供一种雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱的构建方法，本发明的第二目的是提供一种雅拢牛哈占波方剂的检测方法。
5.本发明的第一目的是这样实现的，一种雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱的构建方法，按以下步骤实现：1）供试品溶液的制备：将雅拢牛哈占波颗粒粉末用有机溶剂溶解后，超声提取，过滤，即得供试品溶液a；2）对照品溶液的制备：以雅拢牛哈占波方剂的6种主要活性成分即丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b为对照品，用40-70%甲醇为溶剂配制成不同质量浓度的混合对照品溶液；3）指纹图谱的构建：吸取所述供试品溶液a和混合对照品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱；建立对混合对照品液中各物质的浓度或含量与峰面积的线性关系，按照权利要求1步骤3中的色谱条件进样，检测待测雅拢牛哈占波方剂6种有效成分的峰面积，从而得到各物质的含量，即得到相应的主要活性成分的含量。
6.所述液相色谱的条件为：diamonsil c18色谱柱，规格为：4.6
×
250 mm，5 μm；流动
相为乙腈-0.5%冰乙酸水溶液；流速为0.6-1.0ml
·
min-1
，进样量为15-30μl，检测波长为260-330nm，柱温为20-45℃；梯度洗脱条件如下：0~7 min，5%a；7~15 min，5%~10%乙腈；15~30 min，10%~14%乙腈；30~35 min，14%~18%乙腈；35~55 min，18%~21%乙腈；55~87 min，21%~32%乙腈；87~90 min，32%~95%乙腈；90~100 min，95%乙腈；100~102 min，95%~5%乙腈；102~110 min，5%乙腈。
7.本发明的第二目的是这样实现的，一种雅拢牛哈占波方剂的检测方法，按以下步骤实现：1）将待检测雅拢牛哈占波方剂样品溶解、提取并过滤制备得到供试品溶液b，将供试品溶液b以上述液相色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，得到待检测雅拢牛哈占波方剂的图谱；2）将待检测雅拢牛哈占波方剂的图谱与权利要求1构建的指纹图谱中各峰的相对保留时间和/或各峰的峰面积进行比较，完成对待检测雅拢牛哈占波方剂的定性和/或定量测定。
8.本发明的有益效果为：1）本发明通过对雅拢牛哈占波颗粒的指纹图谱条件进行优化，确定了其色谱条件及雅拢牛哈占波颗粒的提取条件，结合方法学考察，首次建立了雅拢牛哈占波颗粒的hplc指纹图谱方法，280nm下同时标定了多批样品中的32个共有峰，并指认出其中的6个成分，即丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b作为特征峰，可实现对雅拢牛哈占波颗粒剂的定性检测，且稳定性、重现性好。
9.2）本发明利用指纹图谱的色谱分离条件，同时实现了雅拢牛哈占波颗粒中6个主要活性成分的同步定量分析。
10.3）本发明首次以hplc指纹图谱和多指标的含量测定相结合，通过对多批次雅拢牛哈占波颗粒的定性鉴别和含量测定，为更好的监控和评价雅拢牛哈占波颗粒质量，指导规范化生产，具有较高的应用价值；为以多成分、多指标的雅拢牛哈占波颗粒的质量标准建立提供了研究线索，并为雅拢牛哈占波颗粒的深入开发奠定了坚实的基础。
11.4）本发明方法制备得到的指纹图谱不仅能对雅拢牛哈占波颗粒剂同时进行定性、定量检测，还能定性、定量的检测雅拢牛哈占波丸剂、浸膏等剂型。
附图说明
12.图1为11批雅拢牛哈占波颗粒的hplc指纹图谱叠加图（280 nm）；图2为雅拢牛哈占波颗粒的hplc指纹图谱共有模式（r，280 nm）；图3为混合对照品（a）和雅拢牛哈占波颗粒与组方药味（b）的hplc图谱（280 nm）；图4 11批拢牛哈占波颗粒样品（s1-s11）聚类分析图；图5 11批拢牛哈占波颗粒样品（s1-s11）的opls-da得分图；图6 11批拢牛哈占波颗粒样品（s1-s11）的opls-da载荷图；图7 11批拢牛哈占波颗粒样品（s1-s11）的opls-da变量重要性投影图（红色：vip》1；绿色：vip《1）。
具体实施方式
13.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
14.本发明一种雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱的构建方法，按以下步骤实现：1）供试品溶液的制备：将雅拢牛哈占波颗粒粉末用有机溶剂溶解后，超声提取，过滤，即得供试品溶液a；2）对照品溶液的制备：以雅拢牛哈占波方剂的6种主要活性成分即丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b为对照品，用40-70%甲醇为溶剂配制成不同质量浓度的混合对照品溶液；3）指纹图谱的构建：吸取所述供试品溶液a和混合对照品溶液注入液相色谱仪进行高效液相色谱分析，即得雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱；建立对混合对照品液中各物质的浓度或含量与峰面积的线性关系，按照权利要求1步骤3中的色谱条件进样，检测待测雅拢牛哈占波方剂6种有效成分的峰面积，从而得到各物质的含量，即得到相应的主要活性成分的含量。
15.所述液相色谱的条件为：diamonsil c18色谱柱，规格为：4.6
×
250 mm，5 μm；流动相为乙腈-0.5%冰乙酸水溶液；流速为0.6-1.0ml
·
min-1
，进样量为15-30μl，检测波长为260-330nm，柱温为20-45℃；梯度洗脱条件如下：0~7 min，5%a；7~15 min，5%~10%乙腈；15~30 min，10%~14%乙腈；30~35 min，14%~18%乙腈；35~55 min，18%~21%乙腈；55~87 min，21%~32%乙腈；87~90 min，32%~95%乙腈；90~100 min，95%乙腈；100~102 min，95%~5%乙腈；102~110 min，5%乙腈。
16.所述步骤1中，有机溶剂为40-70%甲醇，用25-50 ml甲醇中溶解2-4g雅拢牛哈占波颗粒，超声提取25-35min，冷却至室温后称重，再用甲醇补足失去的重量，0.45μm滤膜滤过。
17.步骤2中，对照品溶液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b的浓度分别为38-42μg
•
ml-1
，15-16μg
•
ml-1
，3.20-3.25μg
•
ml-1
，8.5-9.0μg
•
ml-1
，36.5-37.0μg
•
ml-1
，27.5-28.0μg
•
ml-1
。
18.所述雅拢牛哈占波方剂的hplc指纹图谱在280nm下指定共有峰有32个，以17号峰为参比峰，以能代表配方中主要活性成分的4、5、8、17、24、30号峰为特征峰；其中，峰4为丹参素，峰5为原儿茶酸，峰8为原儿茶醛，峰17为对香豆酸，峰24为迷迭香酸，峰30为丹酚酸b。
19.依据紫外光谱信息和保留时间，对雅拢牛哈占波颗粒与单味药的指纹图谱的相关峰进行比对，确定特征峰的来源归属，其中色谱峰5、8、11、14、18归属于倒心盾翅藤，色谱峰4、7、8、15、23、24、25、26、28、29、30、32归属于肾茶，色谱峰12和14归属于圆锥南蛇藤，色谱峰17归属于薏苡根，色谱峰18、19归属于甘草。
20.所述雅拢牛哈占波方剂包括颗粒剂、汤剂、丸剂、片剂、浸膏。
21.本发明还提供了一种雅拢牛哈占波方剂的检测方法，按以下步骤实现：1）将待检测雅拢牛哈占波方剂样品溶解、提取并过滤制备得到供试品溶液b，将供试品溶液b以上述液相色谱条件注入高效液相色谱仪进行测定，得到待检测雅拢牛哈占波方剂的图谱；2）将待检测雅拢牛哈占波方剂的图谱与权利要求1构建的指纹图谱中各峰的相对
保留时间和/或各峰的峰面积进行比较，完成对待检测雅拢牛哈占波方剂的定性和/或定量测定。
22.定量测定时，6种主要活性成分同步定量分析时，63-78min的检测波长为330nm，其余时间的检测波长为280nm。
23.实施例1 雅拢牛哈占波颗粒剂的hplc指纹图谱的制定一、 实验材料仪器：lc-20a高效液相色谱仪（dad检测器，岛津）；kq-300b型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；xs105du型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。
24.试剂：甲醇（批号：10044118，国药集团化学试剂有限公司），乙腈（批号：193502，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），冰乙酸（批号：20190530，天津市光复科技发展有限公司），纯净水（批号：3212tj，娃哈哈纯净水有限公司）。
25.待检样品：雅拢牛哈占波颗粒11批（s1-s11，批号依次为200514、200610、200612、200613、200614、200710、200711、200712、200713、200714、200810，10g/袋）以及倒心盾翅藤（金虎尾科植物倒心盾翅藤aspidopterys obcordata的藤茎）、肾茶（唇形科植物肾茶clerodendranthus spicatus的全草）、圆锥南蛇藤（卫矛科植物锥序南蛇藤celastrus paniculatus的根）、薏苡根（禾本科植物薏苡coix lacryma-jobi的根、甘草（豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis的干燥根和根茎）等药材均由西双版纳版纳药业有限责任公司提供，5味组方药材并经西双版纳傣族自治州傣医医院主任药师赵应红鉴定，均符合相关标准要求。以上样品均粉碎过4号筛，供实验研究用。
26.标准品：丹参素钠（批号：chb180731，纯度≥98%），原儿茶酸（批号：chb180929，纯度≥98%），原儿茶醛（批号：chb180928，纯度≥98%），对香豆酸（批号：chb180223，纯度≥98%），丹酚酸b（批号：chb180108，纯度≥98%）均由成都克洛玛生物科技有限公司提供，迷迭香酸（批号：ps012101，纯度≥98%）由成都普斯生物科技有限公司提供。
27.二、试验方法与结果1、供试品溶液的制备a、成品药供试品溶液制备：取雅拢牛哈占波颗粒s5（批号：200614）粉末2 g，精密称定，精密加入25 ml 50%甲醇，称重，超声提取30 min，冷却至室温后补重，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液a。
28.b、单味药供试品溶液制备：按照处方比例，分别取倒心盾翅藤、肾茶、圆锥南蛇藤、薏苡根、甘草等药味各适量，按上述方法分别制备成各单味药的供试品溶液b。
29.2、 对照品溶液的制备精密称取各对照品适量，以50%甲醇配制成含丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b浓度分别为40 μg
•
ml-1
，15.6 μg
•
ml-1
，3.22 μg
•
ml-1
，8.8 μg
•
ml-1
，36.8 μg
•
ml-1
，27.8 μg
•
ml-1
的混合对照品溶液。
30.3、色谱条件diamonsil c
18
色谱柱（4.6
×
250 mm，5 μm），流动相为乙腈（a）-0.5%冰乙酸水溶液（b）进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下：0~7 min，5%a；7~15 min，5%~10%a；15~30 min，10%~14%a；30~35 min，14%~18%a；35~55 min，18%~21%a；55~87 min，21%~32%a；87~90 min，32%~95%a；90~100 min，95%a；100~102 min，95%~5%a；102~110 min，5%a。流速为0.8 ml
·
min-1
，
柱温为40℃，进样量为20 μl，检测波长为280 nm。
31.4、雅拢牛哈占波颗粒的hplc指纹图谱建立方法学考察1）精密度试验取供试品溶液a，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图，以17号峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值。结果32个峰的相对保留时间的rsd值《3%，相对峰面积的rsd值《5%。表明仪器精密度良好。
32.2）稳定性试验取供试品溶液a，分别在0、2、4、8、10和24 h按所述色谱条件测定，以17号峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值，结果32个峰的相对保留时间的rsd值《3%，相对峰面积的rsd值《5%。表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
33.3）重复性试验取雅拢牛哈占波颗粒样品s5，按供试品溶液a的方法平行制备6份供试品溶液（cfx-1——cfx-6），按所述色谱条件测定，以17号峰为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值，结果32个峰的相对保留时间的rsd值《3%，相对峰面积的rsd值《5%。表明此方法重复性良好。
34.5、雅拢牛哈占波颗粒指纹图谱的建立1）取11批雅拢牛哈占波样品（s1-s11），制备供试品溶液a，按上述色谱条件进行hplc分析。利用岛津工作站将11批样品色谱图导出为cdf格式，再将文件导入软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004a版）》中，以雅拢牛哈占波颗粒s1作为参照图谱，时间窗宽度设置为0.2 min，进行多点校正后自动匹配，得到雅拢牛哈占波颗粒hplc指纹图谱（图1），并生成对照图谱。
35.2）以生成的对照图谱作为参照图谱（r），对11批样品进行相似度评价，并以17号峰作为参照峰计算各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的rsd值，指纹图谱色谱图见图1和图2。结果显示，s1-s11批雅拢牛哈占波颗粒样品与对照图谱的相似度均大于0.980，表明11批样品间的差异较小，化学成分基本一致。32个共有峰的相对保留时间rsd值均《1%，相对峰面积的rsd在0%~17.21%之间，表明不同批次样品间的指纹图谱整体无差异，但色谱峰高或峰面积存在一定差异，可用于雅拢牛哈占波颗粒定性鉴别。
36.3）色谱峰指认在280 nm下共检出了32个共有峰，并通过对照品比对指认出6个峰。其中峰4为丹参素，峰5为原儿茶酸，峰8为原儿茶醛，峰17为对香豆酸，峰24为迷迭香酸，峰30为丹酚酸b。混合对照品溶液见图3a。
37.4）各单味药色谱峰归属依据紫外光谱信息和保留时间，对雅拢牛哈占波颗粒与单味药的指纹图谱的相关峰进行比对，确定特征峰的来源归属，结果见图3b。其中色谱峰5（原儿茶酸）、8（原儿茶醛）、11、14、18来自于倒心盾翅藤，色谱峰4（丹参素）、7、8（原儿茶醛）、15、23、24（迷迭香酸）、25、26、28、29、30（丹酚酸b）、32来自于肾茶，色谱峰12、14来自于圆锥南蛇藤，色谱峰17（对香豆酸）来自于薏苡根，色谱峰18、19来自于甘草。其中色谱峰1、2、3、31在各单味药中未出现，可能是配伍后产生的新成分。
38.5）化学计量学分析
将11批雅拢牛哈占波颗粒的共有峰面积导入simca 13.0数据分析软件中，进行聚类分析（hca）。根据聚类分析图（图4）结果可知，11批样品可分为2类，其中s6、s5、s3、s4可聚为一类；s1、s2、s8、s10、s9、s7、s11可聚为第二类，表明二者在32个成分的含量上存在一定的差异。这可能与雅拢牛哈占波颗粒生产工艺及药材批次间差异有关。
39.在hca的基础上，建立正交偏最小二乘判别分析（opls-da），得分矩阵图见图5。其中指标r2y为0.963，可反映模型的稳定性；指标q2为0.903，可反映模型的预测性；二者数值均大于0.5，说明模型的稳定性和预测性良好。
40.此外建立opls-da载荷图（图6）进一步预测各参数的差异，其中载荷图上的参数离原点越远代表该成分变化的权重越大。同时结合变量重要性投影（variabl importancein the projection，vip）法筛选各批次间成分含量差异较大的成分，其中vip值大于1（图7）的变量能够作为差异标志物。由图7可知，11批样品中有14个化学成分的变化较大，包括色谱峰说明这14个成分可以作为雅拢牛哈占波颗粒质量的差异标志物。
41.实施例2雅拢牛哈占波颗粒6种活性成分含量测定一、方法学考察1、线性关系考察按“2.2”项下制备混合对照品溶液，分别进样2 μl、4 μl、8 μl、10 μl、12 μl、16 μl、20 μl，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，进行线性回归，绘制标准曲线，并拟合线性方程，计算线性范围和r2值。线性关系考察结果见表1。可知丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b分别在8.0~80 μg
•
ml-1
，3.2~32 μg
•
ml-1
，0.6~6.0 μg
•
ml-1
，1.8~18 μg
•
ml-1
，7.4~74 μg
•
ml-1
，5.6~56 μg
•
ml-1
范围内与峰面积呈良好的线性关系，r2均大于0.999。
42.表1 6种成分的线性关系考察2、 精密度试验取雅拢牛哈占波颗粒样品s5，依“2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件，连续进样6次，结果丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b等6个成分的峰面积的rsd值均小于3%。表明仪器精密度良好。
43.3、稳定性试验取雅拢牛哈占波颗粒样品s5，依“2.1”项下方法制备供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、6、8、10、24 h进样分析，结果供试品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b等6个成分的峰面积的rsd值均小于3%。表明供试品在24 h内稳定性良好。
44.4、 重复性试验
取雅拢牛哈占波颗粒样品s5，依“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件，分别进样，结果供试品中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b的含量分别为0.245 mg/g，0.072 mg/g，0.015 mg/g，0.058 mg/g，0.255 mg/g，0.188 mg/g。rsd分别为0.31%，1.04%，0.00%，2.77%，0.20%，2.94%。表明此方法重复性良好。
45.5、 加样回收率试验取雅拢牛哈占波颗粒样品（s5）6份各1 g，精密称定，每份样品加入等量的丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b对照品，依“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样，记录其峰面积并计算加样回收率，见表2。实验结果显示，丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b的平均加样回收率在100.66%~101.99%，rsd均小于3%，表明丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸、迷迭香酸、丹酚酸b的加样回收率结果良好。
46.表2加样回收率试验结果
二、6种活性成分含量测定取11批雅拢牛哈占波颗粒样品（s1~s11），按照实施例1中方法依制备供试品溶液，依法进样分析，选择280 nm作为丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、对香豆酸含量测定的检测波长， 330 nm作为迷迭香酸和丹酚酸b的检测波长。雅拢牛哈占波颗粒剂的含量测定结果见表3。
47.表3雅拢牛哈占波颗粒剂的含量测定结果（mg/g，n=11）
结果分析：从表1可知，在雅拢牛哈占波颗粒中迷迭香酸的平均含量最高为0.257 mg/g，其余成分含量由高到低依次为丹参素0.249 mg/g、丹酚酸b 0.183 mg/g、原儿茶酸0.073 mg/g、对香豆酸0.057 mg/g、原儿茶醛0.014 mg/g。
48.其中迷迭香酸的含量最高，与之前研究结果相符；丹参素含量0.249 mg/g和丹酚酸b 含量0.183 mg/g较高，根据10批次以上样品测定结果，可纳入雅拢牛哈占波颗粒的质控标准中。鉴于原儿茶酸、对香豆酸的含量较低，而其与迷迭香酸、丹酚酸b均有机酸类成分，在雅拢牛哈占波颗粒中总量可达0.570 mg/g，可考虑将有机酸类成分总量作为质控指标。
49.实施例3用实施例1制备的指纹图谱对雅拢牛哈占波汤剂进行检测：供试品溶液的制备：取雅拢牛哈占波汤剂冻干粉2g，精密称定，精密加入30ml 50%甲醇，称重，超声提取30 min，冷却至室温后补重，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液a。其余操作与实施例1相同。
50.指纹图谱结果显示，其与对照图谱相比较，32个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上。结果表明，实施例1构建的指纹图谱还能够用于雅拢牛哈占波汤剂的检测。
51.实施例4用实施例1制备的指纹图谱对雅拢牛哈占波浸膏进行检测：供试品溶液的制备：取雅拢牛哈占波浸膏3g，精密称定，精密加入25 ml 70%甲醇，称重，超声提取30 min，冷却至室温后补重，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液a。其余操作与实施例1相同。
52.指纹图谱结果显示，其与对照图谱相比较，32个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上。结果表明，实施例1构建的指纹图谱还能够用于雅拢牛哈占波浸膏的检测。
53.实施例5
用实施例1制备的指纹图谱对雅拢牛哈占波片剂进行检测：供试品溶液的制备：取雅拢牛哈占波片剂4g，精密称定，精密加入50ml60%甲醇，称重，超声提取35 min，冷却至室温后补重，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液a。其余操作与实施例1相同。
54.指纹图谱结果显示，其与对照图谱相比较，32个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上。结果表明，实施例1构建的指纹图谱还能够用于雅拢牛哈占波片剂的检测。
55.实施例6用实施例1制备的指纹图谱对雅拢牛哈占波丸剂进行检测：供试品溶液的制备：取雅拢牛哈占波丸剂3g，精密称定，精密加入40ml 50%甲醇，称重，超声提取25 min，冷却至室温后补重，0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液a。其余操作与实施例1相同。
56.指纹图谱结果显示，其与对照图谱相比较，32个共有峰均有出现，且相似度在0.95以上。结果表明，实施例1构建的指纹图谱还能够用于雅拢牛哈占波丸剂的检测。