微型核磁共振探头及核酸、抗体核磁共振检测方法

1.本发明涉及微型核磁共振检测技术领域，特别是一种微型核磁共振探头及核酸、抗体核磁共振检测方法。


背景技术：

2.数字微流控芯片利用介质上电润湿现象实现对液滴的操控。在基底材料上制作驱动电极阵列，数字微流控芯片通过程序性地改变驱动电极的状态，顺序地改变介质层不同区域的润湿性，从而控制液滴的自由运动。
3.中国专利文献cn112090456a公开了一种平面双微带微线圈探头，包括第一梯度线圈、介质基板、微流体芯片、接地板和第二梯度线圈，介质基板上具有平行双微带线，平行双微带线与静磁场b0方向平行放置，流体通道放置在平行微带线之间。在进行磁共振信号激励和接收时，射频电流通过微带线，产生垂直于线圈平面的均匀性很高的射频场b1，微流体芯片由刻有微流体通道的上层特氟龙薄片和下层特氟龙薄片夹着一层孔状pdms薄膜的三明治结构组成，微流控芯片的检测区的流体通道平行双微带线。
4.该现有技术存在的不足为：首先，微流体芯片的微流体通道加工复杂，并且需要微泵，微阀等额外机械部件，难以集成化；其次虽然微线圈减少了检测区域的样本量，但用于使样本流动的泵和管道相关区域仍然存在较大的无用体积，增加了实际的样本使用量。同时连续流体控制也增加了样本使用量且容易产生液体间交叉污染。
5.现有技术中的病毒核酸检测试剂包括新冠病毒核酸检测试剂，大多基于实时荧光定量pcr(qpcr)技术，反应过程通常由20～40个pcr循环组成，每个循环由高温变性一低温复性(退火)一适温延伸三个步骤组成，升降温过程耗费时间，需要数小时才能得到准确结果，要缩短时间只能减少循环次数，会影响灵敏度,造成“假阴性”结果。为了加速病毒诊断可采用lamp核酸扩增技术，避免频繁的升降温过程，将核酸扩增所需时间由1小时缩短至15分钟。对lamp扩增产物进行检测的方法通常为观察反应溶液的焦磷酸镁沉淀、mg
2+
指示剂钙黄绿素和羟基萘酚蓝等颜色变化方法。所有这些检测方法都是基于lamp反应产生的dna质量，而不管产物序列是特异性的还是非特异性的。非特异性扩增、引物二聚体形成或污染容易导致假阳性。
6.目前病毒抗体检测包括新冠病毒抗体检测多采用免疫层析法，检测快速方便，但无法进行准确定量。而用传统的酶联免疫法检测抗体，定量较准确，但对操作人员要求高，成本高且步骤繁琐耗时。


技术实现要素：

7.本发明所要解决的技术问题是：提供一种微型核磁共振探头及核酸、抗体核磁共振检测方法，提高探头的集成化。
8.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种微型核磁共振探头，包括依次平行设置的第一平面匀场线圈、核磁共振微线圈芯片、数字微流控芯片和第二平面匀场线
圈，数字微流控芯片为单极板形式，核磁共振微线圈芯片的介质基板上的微带为环形微带线圈，环形微带线圈为由两条彼此对称的半环形微带线构成的环形，半环形微带线的上下两个结合处为环形微带线圈的电流输入端和电流输出端，用于使两半环形微带线中所传输的电场方向相同，核磁共振微线圈芯片和数字微流控芯片之间间隔设置，形成夹心结构，夹心结构的夹腔为用于核磁共振检测的检测夹腔。
9.进一步限定，核磁共振微线圈芯片包括介质基板、环形微带线圈、第一正面导电带、第二正面导电带和背面导电带，第一正面导电带、第二正面导电带和环形微带线圈位于介质基板的正面，背面导电带位于介质基板的背面，第一正面导电带、第二正面导电带的内端部分别连接环形微带线圈的电流输入端和电流输出端，第一正面导电带、第二正面导电带在一直线上，背面导电带的沿伸方向与第一正面导电带或第二正面导电带的延伸方向相同，背面导电带穿过环形微带线圈在介质基板的背面的投影区域，背面导电带的一端与第一正面导电带的外端部连接，背面导电带的另一端和第二正面导电带的外端部为核磁共振微线圈芯片的电流输入端和电流输出端，用于连接线圈调谐匹配电路。
10.进一步限定，核磁共振微线圈芯片和数字微流控芯片的朝向检测夹腔的表面具有疏水层。
11.进一步限定，检测夹腔内填充氟油。
12.进一步限定，第一平面匀场线圈、核磁共振微线圈芯片、数字微流控芯片和第二平面匀场线圈通过安装座进行安装固定，安装座位于第一平面匀场线圈、核磁共振微线圈芯片、数字微流控芯片和第二平面匀场线圈的下端部。
13.进一步限定，核磁共振微线圈芯片和位于核磁共振微线圈芯片同侧的第一平面匀场线圈上具有至少一个与检测夹腔相通的注液孔和至少一个与检测夹腔相通的排液孔，数字微流控芯片的底部具有与加热器和温度传感器，数字微流控芯片的底部具有加热器和温度传感器。
14.进一步限定，数字微流控芯片上的驱动电极阵列区域具有核酸扩增区域、探针反应区域和核磁共振检测区域，核酸扩增区域、探针反应区域和核磁共振检测区域的底部都具有独立控制的加热器和温度传感器，核磁共振检测区域对应核磁共振微线圈芯片的环形微带线圈区域。
15.进一步限定，数字微流控芯片上的驱动电极阵列区域具有检测功能区域，检测功能区域的底部具有加热器和温度传感器，检测功能区域对应核磁共振微线圈芯片的环形微带线圈区域。
16.一种核酸核磁共振检测方法，采用上述的微型核磁共振探头进行核酸核磁共振检测，首先核酸检测样本加载到微型核磁共振探头的检测夹腔内进行rt-lamp扩增；随后扩增后的液滴与核酸探针修饰的磁性颗粒探针混合反应，磁性颗粒探针捕获目标核酸，造成磁性颗粒探针聚集；随后通过微型核磁共振探头的环形微带线圈对混合反应后的液滴进行核磁共振测量，分析弛豫时间信号变化，实现快速核酸检测。
17.一种抗体核磁共振检测方法，采用上述的微型核磁共振探头进行抗体核磁共振检测，首先抗体检测样本加载到微型核磁共振探头的检测夹腔内与抗体探针修饰的磁性颗粒探针混合反应，磁性颗粒探针捕获目标抗体，造成磁性颗粒探针聚集；随后通过微型核磁共振探头的环形微带线圈对混合反应后的液滴进行核磁共振测量，分析弛豫时间信号变化，
实现快速抗体检测。
18.本发明的有益效果是：通过数字微流控芯片操控液滴，既保留了所需检测样本体积小，可精确操控，分析速度快的优势，又不需要泵，阀等的配合使用，具有结构简单，易集成化的优势，适合样本片上核磁共振检测分析的需求；
19.核磁共振微线圈芯片的环形微带线圈可以产生一个与数字微流控芯片操控的液滴的形状相匹配的均匀b1场，可提高微量样本液滴的填充因子，可大幅度提高信号灵敏度，获得微升级液滴样本的核磁信号；
20.核磁共振微线圈芯片与数字微流控芯片间隔设置，形成夹心结构，可使环形微带线圈紧贴检测样本液滴，使得匀场空间变小，仅需对检测样本液滴空间进行匀场，匀场效果显著，故不需要如中国专利文献cn112090456a单独设置一块接地板，保证匀场效果，该设计有利于简化结构，提供集成度；
21.采用本发明的核磁共振探头进行核酸、抗体核磁共振检测的方法为非接触式的检测手段，不依赖光学或电化学信号，而是基于样本的原子核信息，不像光学或电化学方法那样容易产生非特异性干扰信号，因此可免去复杂耗时的样本前处理步骤，有效缩短检测时间；
22.核酸、抗体修饰的磁性颗粒探针可增强核磁共振检测灵敏度，通过定量分析弛豫时间的变化量与目标检测物浓度的关系，可以实现核酸、抗体的定量检测。
附图说明
23.下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；
24.图1是本发明的实施例1的微型核磁共振探头的结构原理图；
25.图2为本发明的核磁共振微线圈芯片的正面结构示意图；
26.图3为本发明的核磁共振微线圈芯片的背面结构示意图；
27.图4为本发明的实施例1的微型核磁共振探头的结构示意图；
28.图5为本发明的实施例1的微型核磁共振探头的爆炸图；
29.图6为本发明的线圈调谐匹配电路的电路图；
30.图7为本发明的实施例1的核磁共振图谱a；
31.图8为本发明的实施例1的核磁共振图谱b；
32.图9为本发明的实施例1的核磁共振图谱c；
33.图10是本发明的实施例2的数字微流控芯片的驱动电极阵列的布局图；
34.图11是本发明的实施例2中在磁性聚合物纳米颗粒上修饰核酸探针的过程示意图；
35.图12是本发明的实施例2中基于磁性颗粒探针的核酸核磁共振检测方法原理示意图；
36.图13是本发明的实施例3的数字微流控芯片的驱动电极阵列的布局图；
37.图14是本发明的实施例3中在磁性聚合物纳米颗粒上修饰抗体探针的过程示意图；
38.图15是本发明的实施例3中基于磁性颗粒探针的抗体核磁共振检测方法原理示意图；
39.图中，1.第一平面匀场线圈，2.核磁共振微线圈芯片，2-1.介质基板，2-2.环形微带线圈，2-3.第一正面导电带，2-4.第二正面导电带，2-5.背面导电带，2-6.镀铜通孔，3.数字微流控芯片，3-1.驱动电极阵列，4.第二平面匀场线圈，5.安装座，6.加热器，7.温度传感器，8.液滴，9.注液孔，10.排液孔，11.疏水层，12.核酸扩增区域，13.探针反应区域，14.核磁共振检测区域，15.磁性颗粒探针，15-1.dna1探针，15-2.dna2探针，15-3.聚苯乙烯外壳，15-4.磁性铕内核，15-5.anti-igm抗体，15-6.蛋白抗原，16.目标核酸，17.检测功能区域，18.目标抗体。
具体实施方式
40.实施例1，如图1～6所示，一种微型核磁共振探头，包括依次平行设置的第一平面匀场线圈1、核磁共振微线圈芯片2、数字微流控芯片3和第二平面匀场线圈4，数字微流控芯片3为单极板形式，核磁共振微线圈芯片2的介质基板2-1上的微带为环形微带线圈2-2，环形微带线圈2-2为由两条彼此对称的半环形微带线构成的环形，半环形微带线的上下两个结合处为环形微带线圈2-2的电流输入端和电流输出端，用于使两半环形微带线中所传输的电场方向相同，核磁共振微线圈芯片2和数字微流控芯片3之间间隔设置，形成夹心结构，夹心结构的夹腔为用于核磁共振检测的检测夹腔，数字微流控芯片3上具有驱动检测夹腔内的液滴8的驱动电极阵列3-1。第一平面匀场线圈1和第二平面匀场线圈4为中国专利文献cn112090456a公开的第一梯度线圈和第二梯度线圈。
41.通过电磁仿真软件cst仿真，可发现在两条半环形微带线的中心正上方区域会产生一个液滴形状的均匀b1场，与数字微流控芯片3操控的液滴8的形状相匹配，该均匀场区域即为可用于进行核磁共振检测的检测区域。
42.如图1、2和3所示，核磁共振微线圈芯片2包括介质基板2-1、环形微带线圈2-2、第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4和背面导电带2-5，第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4和环形微带线圈2-2位于介质基板2-1的正面，背面导电带2-5位于介质基板2-1的背面，第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4的内端部分别连接环形微带线圈2-2的电流输入端和电流输出端，第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4在一直线上，背面导电带2-5的沿伸方向与第一正面导电带2-3或第二正面导电带2-4的延伸方向相同，背面导电带2-5穿过环形微带线圈2-2在介质基板2-1的背面的投影区域，背面导电带2-5的上端与第一正面导电带2-3的外端部连接，背面导电带2-5的下端和第二正面导电带2-4的外端部为核磁共振微线圈芯片2的电流输入端和电流输出端，用于连接线圈调谐匹配电路。在图1中第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4和背面导电带2-5未画出。
43.优选，第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4的带宽为20mm，第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4的内端部收窄连接环形微带线圈2-2，内端部收窄区域呈三角形，两侧的倾斜角度a为45度，环形微带线圈2-2的带宽为800um，中间圆心半径为1mm,介质基板2-1选用3mm厚度可使得环形微带线圈2-2区域的结构在电路中电感性远大于电容性，介质基板2-1的材质为f4b基板或rogers5880，介电常数2.2，损耗角正切值小。核磁共振微线圈芯片2采用pcb加工工艺形式，在介质基板2-1上印刷制备所设计的环形微带线圈2-2、第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4和背面导电带2-5，环形微带线圈2-2、第一正面导电带2-3、第二正面导电带2-4和背面导电带2-5为35um铜箔，背面导电带2-5的上端与第一正面导
电带2-3的上端通过镀铜通孔2-6连接。
44.如图6所示，线圈调谐匹配电路包括阻抗匹配电容c1和调谐电容c2，c3。将c2和c3分别连接背面导电带2-5和第二正面导电带2-4的下端部，这种分压设计使环形微带线圈2-2两端的电压分别为v/2和-v/2，降低了调谐电容c2所需承受的电压，同时使得环形微带线圈2-2的中心处于虚拟接地状态。
45.核磁共振微线圈芯片2和数字微流控芯片3的朝向检测夹腔的表面具有疏水层11。疏水层11具体为特氟隆。
46.检测夹腔内填充氟油，具体为fc-40氟油或者fc-43氟油。检测夹腔内填充氟油可降低数字微流控芯片3引起的磁场不均匀性和不稳定性。
47.核磁共振微线圈芯片2和位于核磁共振微线圈芯片2同侧的第一平面匀场线圈1上具有至少一个与检测夹腔相通的注液孔9和至少一个与检测夹腔相通的排液孔10。在本实施例1的附图中，注液孔9和排液孔10的数量都为一个。
48.第一平面匀场线圈1、核磁共振微线圈芯片2、数字微流控芯片3和第二平面匀场线圈4通过安装座5进行安装固定，安装座5位于第一平面匀场线圈1、核磁共振微线圈芯片2、数字微流控芯片3和第二平面匀场线圈4的下端部。
49.以葡萄糖溶液为例，采用本实施例1的微型核磁共振探头进行核磁共振检测的方法的具体过程为：
50.将含有0.1m葡萄糖的重水溶液通过注液孔9加载到检测夹腔内，进行核磁共振检测，如图7所示，在所得谱中未观察到峰值。接下来数字微流控芯片3将葡萄糖样本液滴驱动到环形微带线圈2-2的中心，如图8所示，在所得谱中观察到清晰解析的葡萄糖谱。最后，将葡萄糖样本液滴从环形微带线圈2-2中移开，再次获得空白谱，如图9，在环形微带线圈2-2处残留的样品发出微弱信号。
51.实施例2，和实施例1相比基本相同，区别在于：对生物样本进行处理的过程中对反应温度有特定的要求，为了实现高性能核磁共振检测，在数字微流控芯片3的每个功能区域需要提供特定的温度。比如抗原和抗体之间的特异性结合的合适温度是37℃，核酸rt-lamp扩增过程中要求最佳反应温度需要维持在65℃，探针反应最佳温度需要设置在37℃，而核磁共振检测过程中所需的静磁场磁体的工作温度需要设置在25℃。故在数字微流控芯片3的底部需要具有加热器6和温度传感器7。
52.如图10所示，本实施例2的微型核磁共振探头具体为用于核酸核磁共振检测的微型核磁共振探头，数字微流控芯片3上的驱动电极阵列3-1区域具有核酸扩增区域12、探针反应区域13和核磁共振检测区域14，核酸扩增区域12、探针反应区域13和核磁共振检测区域14的底部都具有独立控制的加热器6和温度传感器7，核磁共振检测区域14对应核磁共振微线圈芯片2的环形微带线圈2-2区域。
53.采用该微型核磁共振探头进行核酸核磁共振检测的方法的具体过程为：
54.(1)制备核酸探针修饰的磁性颗粒探针15。
55.步骤1的具体过程为：
56.(1.1)制备表面羧基化的羧基化磁性聚合物纳米颗粒；
57.(1.2)在磁性聚合物纳米颗粒上修饰核酸探针。
58.如图11所示，取1ml羧基化磁性聚合物纳米颗粒溶解在2mlmes缓冲液(50mm，
ph6.0)中，加入8mgedc和12mgnhs，超声3分钟，37度震荡15分钟。弱酸性环境中活化羧基，加入与目标核酸16有互补序列的dna1探针15-1(不用洗涤)，在37度震荡1小时。加入封闭液封闭反应位点，37度继续震荡1小时，得到dna1探针15-1修饰的磁性颗粒探针15。dna1探针15-1修饰的磁性颗粒探针15分离清洗后分散在中性mes缓冲液中。
59.按照同样的步骤得到与目标核酸16有互补序列的dna2探针15-2修饰的磁性颗粒探针15。
60.磁性聚合物纳米颗粒具体为聚苯乙烯外壳15-3包裹磁性铕内核15-4的纳米颗粒，聚苯乙烯外壳15-3包裹磁性铕内核15-4，可有效提高磁性颗粒溶液在外加磁场下的稳定性，只有当检测目标物存在时，探针修饰的磁性颗粒探针15通过与目标物特异性偶联结合，才会引起磁性颗粒探针15的聚集变化，造成水质子体系的t1/t2大幅下降，进而获得生物分子定性和定量信息。
61.(2)利用本实施例2的微型核磁共振探头和步骤1的核酸探针修饰的磁性颗粒探针15进行核酸核磁共振检测。
62.整个rt-lamp核酸扩增和检测过程都是在微型核磁共振探头的检测夹腔内完成，数字微流控芯片3所操控的反应液滴包括rt-lamp试剂液滴、核酸检测样本液滴和磁性颗粒探针液滴，磁性颗粒探针液滴内包含等量的dna1探针15-1修饰的磁性颗粒探针15和dna2探针15-2修饰的磁性颗粒探针15。
63.首先核酸检测样本加载到微型核磁共振探头的检测夹腔内进行rt-lamp扩增；随后扩增后的液滴8与核酸探针修饰的磁性颗粒探针15混合反应，磁性颗粒探针15捕获目标核酸16，造成磁性颗粒探针15聚集；随后通过微型核磁共振探头的环形微带线圈2-2对混合反应后的液滴8进行核磁共振测量，分析弛豫时间信号变化，实现快速核酸检测。
64.具体过程为：数字微流控芯片3操控核酸检测样本液滴、rt-lamp试剂液滴分别移动至核酸扩增区域12进行混合和核酸扩增，核酸扩增采用rt-lamp扩增方法，在65℃恒温下进行，免去了样本循环升降温时间，同时进行rna逆转录和核酸扩增；完成核酸扩增后数字微流控芯片3操控核酸扩增区域12的扩增后的液滴8和磁性颗粒探针液滴分别移动至探针反应区域13进行混合和反应，目标核酸16的核酸片段引发dna1探针15-1修饰的磁性颗粒探针15和dna2探针15-2修饰的磁性颗粒探针15聚集，如图12所示；数字微流控芯片3操控反应完成的液滴8移动至核磁共振检测区域14进行核磁共振检测，分析弛豫时间信号变化，实现快速核酸检测。
65.实施例3，和实施例1相比基本相同，区别在于：数字微流控芯片3上的驱动电极阵列区域具有检测功能区域17，检测功能区域17的底部具有加热器6和温度传感器7，检测功能区域17对应核磁共振微线圈芯片2的环形微带线圈2-2区域。
66.采用该微型核磁共振探头进行抗体核磁共振检测的方法的具体过程为：
67.(1)制备抗体探针修饰的磁性颗粒探针15。
68.如图14所示，步骤1的具体过程为：
69.(1.1)制备表面羧基化的羧基化磁性聚合物纳米颗粒；
70.(1.2)在磁性聚合物纳米颗粒上修饰抗体探针。
71.(2)利用本实施例3的微型核磁共振探头和步骤1的抗体探针修饰的磁性颗粒探针15进行抗体核磁共振检测。
72.整个检测过程都是在微型核磁共振探头的检测夹腔内完成，数字微流控芯片3所操控的反应液滴包括抗体检测样本液滴和磁性颗粒探针液滴。
73.首先抗体检测样本加载到微型核磁共振探头的检测夹腔内；随后抗体检测样本与抗体探针修饰的磁性颗粒探针15混合反应，磁性颗粒探针15捕获目标抗体18，造成磁性颗粒探针15聚集；随后通过微型核磁共振探头的环形微带线圈2-2对混合反应后的液滴8进行核磁共振测量，分析弛豫时间信号变化，实现快速抗体检测。
74.以检测igm为例，具体过程为：数字微流控芯片3操控抗体检测样本液滴、磁性颗粒探针液滴分别移动至检测功能区域17进行混合和反应，当溶液中存在目标抗体18，如存在igm时，目标抗体18igm会与磁性颗粒探针15表面的anti-igm抗体15-5和蛋白抗原15-6相互作用，使得原本自由分散在溶液中的磁性颗粒探针15发生聚集。如图15所示，磁性颗粒探针15聚集会导致其周围局部区域磁场增大的同时，又导致另一些局部区域的磁场减小，造成颗粒周边磁场出现涨落现象，而这种磁场的涨落会加快附近分子自旋弛豫的过程，表现为溶液的弛豫时间t2值变小，聚集程度与目标抗体18igm浓度相关，通过定量分析t2值的变化量与目标抗体18浓度的关系，即可实现抗体的定量检测；
75.反应完成后进行核磁共振检测，分析弛豫时间信号变化，实现快速核酸检测。