一种总同型半胱氨酸的电化学免疫检测方法

1.本发明涉及电化学分析技术和免疫学的技术领域，尤其涉及一种总同型半胱氨酸的电化学免疫检测方法。


背景技术：

2.同型半胱氨酸(homocysteine,hcy)是一种天然存在的含硫氨基酸，为蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物，部分以同型半胱氨酸-半胱氨酸二硫化物存在，微量以还原型同型半胱氨酸存在，大部分通过二硫键与白蛋白结合而存在。大量对hcy的研究表明，hcy是动脉粥样硬化和血栓形成等心脑血管疾病及血管栓塞性疾病发病的独立危险因素。遗传、饮食营养等因素异常会引起hcy积累过多，大幅增加一些疾病如高胱氨酸尿症、唐氏综合症、阿尔茨海默病、心血管疾病、先天畸形以及维生素缺乏症等的发病风险。因此，快速、准确、高灵敏、简单而廉价的检测生物体中总同型半胱氨酸(total homocysteine,thcy)水平，对于疾病预防和病理研究具有十分重要的意义。
3.目前，临床常用的检测thcy的方法主要有两大主流方法：一是循环酶法，通过循环反应放大检测信号，增强反应灵敏度。其原理是样本中同型半胱氨酸被转化成游离型(还原型)后，利用s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosyl-l-methionine,sam)在同型半胱氨酸甲基转移酶(homoeysteine methyltransferase,hmtase)作用下将血浆或血清中hcy转化生成(s-adenonsyl-homocysteine,sah)，sah又在sah水解酶(sahhydrolase,sahase)作用下脱掉腺苷(ado)水解为hcy；水解生成的hcy也会在sam及hmtase作用下，生成sah，生成的sah又会继续启动反应，形成循环的反应，每循环一次，腺苷生成的量叠加放大，腺苷通过水解生成氨和次黄嘌呤，在谷氨酸脱氢酶的作用下，生成的氨会使还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)，样本中的hcy浓度与nadh转化速率成正比，该法是利用酶促反应及nadh的变化来检测同型半胱氨酸浓度。该方法虽然重复性好，但易受血清中氨离子的干扰，特异性和准确性略差，并且反应过程中需要好几种酶进行循环放大，试剂的稳定性的影响因素增多，同时操作过程复杂、成本高昂、使用非常不便、耗时、需要高昂的检测设备，不利于各级医院的推广普及。
4.另一种主要检测方法是荧光偏振免疫检测法，其检测原理为先用二硫键还原剂将生物样本中结合态的同型半胱氨酸还原成游离形式后，加入腺苷，在s-腺苷-l-同型半胱氨酸水解酶(sahase)的作用下，同型半胱氨酸转化为s-腺苷-l-同型半胱氨酸(sah)。然后，加入sah单克隆抗体和荧光标记的sah抗原，sah与荧光标记抗原竞争结合sah抗体，形成大分子免疫复合物，最后测定其荧光偏正强度。但是，上述检测产品使用繁琐且需要专业的设备进行检测，不利于小型智能化和床旁快速简便检测。
5.电化学传感器具有快速、灵敏和价廉等优点，在床边诊断中扮演很重要的角色。目前，已有文献报道了基于金纳米粒子修饰石墨烯碳糊电极的同型半胱氨酸电化学传感(分析科学学报，2020，36(6):775-781.)，该电化学传感器是基于金纳米粒子-石墨烯复合材料对同型半胱氨酸的电化学氧化原理对同型半胱氨酸进行定量检测，虽然取得了较好的线性
范围和检测灵敏度，但是同型半胱氨酸在该电化学传感电极上的氧化峰电位为0.46v(饱和甘汞电极为参比电极)，其他共存生物分子也易在该电位下被氧化造成干扰。在实际样本中，通常半胱氨酸、谷胱甘肽等生物分子与同型半胱氨酸共存，这些生物硫醇分子也会在该电位下被氧化，从而影响对同型半胱氨酸定量检测的准确性和可靠性。
6.电化学免疫传感器是基于抗原-抗体生物分子的特异性识别引起电信号的变化的原理对生物分子进行检测，具有检测灵敏、选择性好，响应快等优点。而现有同型半胱氨酸检测技术中，尚未见电化学免疫传感方法的报道。因此，开发新型快速、准确、高灵敏、简单价廉的血清thcy检测方法以满足对相关疾病的早期筛查的需求十分重要。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的上述问题，本发明公开了一种总同型半胱氨酸的电化学免疫检测方法，可以快速、准确、高灵敏、简单价廉的检测同型半胱氨酸，且无需大型检测设备，有望实现小型智能化和床旁快速简便检测。
8.具体技术方案如下：
9.一种总同型半胱氨酸的电化学免疫检测方法，包括如下步骤：
10.步骤一、sah电化学免疫传感器的制备：
11.(1)将纳米复合材料与水混合得到悬浮液a，将粘结剂与水混合得到溶液b，将链霉亲和素与水混合得到溶液c，将悬浮液a、溶液b与溶液c混合后滴涂于电极表面，得到修饰后的电极；
12.所述纳米复合材料选自au-nps/rgo/sio2纳米复合材料、au-nps/sio2纳米复合材料或au-nps/rgo纳米复合材料；
13.所述粘结剂选自壳聚糖；
14.(2)在所述修饰后的电极表面滴涂生物素化的sah抗体，温育下反应后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；再将牛血清蛋白溶液滴涂于经上述处理后的修饰后的电极，室温下封闭后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到sah电化学免疫传感器；
15.步骤二、绘制工作曲线：
16.将所述sah电化学免疫传感器在不同浓度下的sah抗原溶液中温育，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到孵育sah抗原的电化学免疫传感器；以所述孵育sah抗原的电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极或ag/agcl电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在铁氰化钾测试液中，用差示脉冲伏安法检测电化学信号，得出不同浓度sah与电流信号响应的工作曲线；
17.步骤三、总同型半胱氨酸的检测：
18.(3)将待测样本与含有二硫键还原剂的样品处理液进行反应，再用sah水解酶溶液与过量腺苷将待测样本中的hcy转化成sah，得到处理后的样本溶液；
19.(4)将所述sah电化学免疫传感器在所述处理后的样本溶液中温育，然后用磷酸盐缓冲液冲洗，以此为工作电极，在铁氰化钾测试液中检测电流响应，根据步骤二获得的工作曲线，得到待测样本中sah的含量，进一步计算获得待测样本中总同型半胱氨酸的含量。
20.本发明公开的检测方法是基于sah抗体与sah抗原特异性反应引起电信号的变化的原理，首先通过自组装技术制备得到au-nps/rgo/sio2纳米复合材料、au-nps/sio2纳米复
合材料或au-nps/rgo纳米复合材料，利用链霉亲和素对所述纳米复合材料功能化并修饰于洁净的电极表面，通过链霉亲和素对生物素的特异亲和作用，将生物素化的sah抗体固定于功能化界面上，用牛血清蛋白溶液封闭得到电化学免疫传感器。将制得的传感器温育sah抗原，抗体与抗原特异性反应形成的免疫复合物阻碍电子传递，从而引起响应电流减小，利用电信号的减小和sah抗原浓度直接的线性关系，通过sah的浓度反映总同型半胱氨酸的含量，可以实现对总同型半胱氨酸的检测，为疾病的诊断、病情的监测、疗效的观察提供快速、准确、高灵敏、简单价廉的检测方法。
21.当所述纳米复合材料选自au-nps/rgo/sio2纳米复合材料，制备步骤具体包括：
22.a)将sio2纳米球分散在水中得到sio2分散液，与含有正电荷的聚合物水溶液混合，经自组装得到带正电荷的sio2纳米复合材料；
23.含有正电荷的聚合物选自聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)、聚乙烯吡啶、聚乙烯亚胺中的一种或多种；
24.b)将石墨烯分散在水中得到石墨烯分散液，将所述带正电荷的sio2纳米复合材料分散在水中得到分散液ⅰ，将两者混合，经自组装得到rgo/sio2复合材料；
25.c)将所述rgo/sio2复合材料分散在乙醇中，加入硅烷偶联剂进行改性处理，得到氨基功能化的rgo/sio2纳米复合材料；
26.所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基乙氧基硅烷和/或3-氨丙基甲氧基硅烷；
27.d)将所述氨基功能化的rgo/sio2纳米复合材料分散在水中得到分散液ⅱ，将胶体金水溶液与所述分散液ⅱ混合，经自组装得到au-nps/rgo/sio2纳米复合材料。
28.步骤a)中，所述sio2纳米球的尺寸为50～500nm，sio2分散液的浓度为0.1～15mg/ml；所述含有正电荷的聚合物水溶液的浓度为0.1～15mg/ml；sio2分散液与含有正电荷的聚合物水溶液的体积比为1：0.1～100；
29.本发明中sio2纳米球的制备可以采用方法，为了使电极功能界面具有更大的比表面积以提高传感器的检测灵敏度，所述sio2纳米球的尺寸进一步优选为50～200nm。
30.所述sio2纳米球表面呈电负性，与含有正电荷的聚合物可以通过静电吸附作用实现自组装，所述自组装可以在静置下进行，也可以增加搅拌加速自组装的反应速率。
31.步骤b)中，所述石墨烯的尺寸为10～150nm，石墨烯分散液的浓度为0.2～2mg/ml；所述分散液ⅰ的浓度为0.1～10mg/ml；石墨烯分散液与分散液ⅰ的体积比为1：0.2～15；
32.所述石墨烯呈纳米片状，均匀的包裹在sio2纳米球表面，大大增加了材料的比表面积，为后续金纳米颗粒的负载提供更多的位点，并增强了材料的电子传递能力。
33.所述石墨烯呈电负性，与表面带正电荷的sio2纳米复合材料也可以通过静电吸附作用实现自组装，所述自组装可以在静置下进行，也可以增加搅拌加速自组装的反应速率。
34.步骤c)中，所述rgo/sio2复合材料分散在乙醇中的质量浓度为0.01～0.5g/ml；rgo/sio2复合材料与硅烷偶联剂的质量比为1：0.1～1.0；
35.所述改性处理在乙醇的回流温度下进行。
36.步骤d)中，所述分散液ⅱ的浓度为0.1～10mg/ml；所述胶体金溶液的浓度为0.01～0.5mg/ml，所述胶体金溶液中，纳米金颗粒的尺寸为1～100nm；分散液ⅱ与胶体金溶液的体积比为1：0.1～5；
37.所述氨基功能化的rgo/sio2纳米复合材料中的氨基可以与纳米金颗粒自组装形
成au-n化学键，从而制备得到结合稳定的au-nps/rgo/sio2纳米复合材料。
38.所述胶体金水溶液的制备参考文献(chem.commun.,2007,5220-5222；j.am.chem.soc.1998,120,1959-1964.)制备。
39.当所述纳米复合材料选自au-nps/sio2纳米复合材料，制备步骤仅包括上述a)和d)，具体为：
40.a)将sio2纳米球分散在水中得到sio2分散液，与含有正电荷的聚合物水溶液混合，经自组装得到带正电荷的sio2纳米复合材料；
41.d)将所述带正电荷的sio2纳米复合材料分散在水中得到分散液ⅱ，将胶体金溶液与所述分散液ⅱ混合，经自组装得到au-nps/sio2纳米复合材料。
42.分散液ⅱ的浓度仍然为0.1～10mg/ml，分散液ⅱ与胶体金溶液的体积比为1：0.1～5。
43.当所述纳米复合材料选自au-nps/rgo纳米复合材料，制备步骤仅包括上述c)和d)。
44.c)将石墨烯分散在乙醇中，加入硅烷偶联剂进行改性处理，得到氨基功能化的rgo；
45.所述硅烷偶联剂选自3-氨丙基乙氧基硅烷和/或3-氨丙基甲氧基硅烷；
46.石墨烯分散在乙醇中的质量浓度为0.01～0.5g/ml；r石墨烯与硅烷偶联剂的质量比为1：0.1～1.0；
47.所述改性处理在乙醇的回流温度下进行。
48.d)将所述氨基功能化的rgo分散在水中得到分散液ⅱ，将胶体金水溶液与所述分散液ⅱ混合，经自组装得到au-nps/rgo纳米复合材料。
49.分散液ⅱ的浓度仍然为0.1～10mg/ml，分散液ⅱ与胶体金溶液的体积比为1：0.1～5。
50.优选的，所述纳米复合材料选自au-nps/rgo/sio2纳米复合材料，经试验发现，采用该纳米复合材料制备的sah电化学免疫传感器对同型半胱氨酸具有更高的检测灵敏度。
51.制备得到的au-nps/rgo/sio2纳米复合材料中，sio2的含量为15～89.5wt％，石墨烯的含量为0.5～20wt％，aunps的含量为10～80wt％。
52.步骤一中：
53.步骤(1)，悬浮液a的浓度为1.0～8.0mg/ml，溶液b的浓度为0.05～2.0wt％，溶液c的浓度为200～1000μg/ml；
54.优选的，悬浮液a的浓度为1.0～5.0mg/ml，溶液b的浓度为0.1～1.0wt％，溶液c的浓度为500～1000μg/ml。
55.悬浮液a、溶液b与溶液c的体积比为1：0.1～5：0.1～5；
56.将上述混合溶液滴涂于电极表面后，置于冷藏低温的环境下晾干。
57.所述电极选自本领域制作电化学传感器常用的电极种类，如玻碳电极、金电极、丝网印刷电极、导电纸基电极、石墨电极、ito电极或fto电极。
58.步骤一中，所述粘结剂选自壳聚糖。经试验发现，壳聚糖作为粘结剂能将上述所制备的纳米材料牢固的修饰在固体电极表面，并能保证修饰电极具有良好的电子传输能力。若将粘结剂替换为其它常见种类，如nafion，试验显示，用循环伏安法检测的电化学信号，
明显小于用壳聚糖作为粘结剂修饰电极的电化学信号，且低于裸玻碳电极的电化学信号。
59.步骤一中：
60.步骤(2)，所述生物素化的sah抗体(bio-sah抗体)的浓度为1～50μg/ml，优选为10～30μg/ml；所述温育，温度为37℃。
61.所述牛血清蛋白溶液的浓度为1.0～2.0wt％。
62.步骤二中：
63.所述温育，温度为37℃，时间为30～50min；
64.所述铁氰化钾测试液，为5mm的k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]和0.1m kcl的混合液，ph为6.5。
[0065]
步骤三中：
[0066]
由于同型半胱氨酸在体内循环时，大部分以与血浆蛋白结合的氧化形式存在，即通过二硫键与血浆中的白蛋白结合形成蛋白结合型同型半胱氨酸，只有少量以游离形式存在于血液中，即游离型同型半胱氨酸，所以在使用生物样本测试前需要用处理液对其进行稀释和预反应，将样本中的蛋白结合或聚合状态的同型半胱氨酸转换为游离型同型半胱氨酸。
[0067]
具体为将待测样本与含有二硫键还原剂的样品处理液进行反应，再用sah水解酶溶液与过量腺苷将待测样本中的hcy转化成sah。
[0068]
所述二硫键还原剂选自二硫苏糖醇(dithiothreitol，dtt)、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(tcep)、β-巯基乙醇(β-me)中的一种或多种；
[0069]
所述含有二硫键还原剂的样品处理液的浓度为0.1～20mmol/l，优选为1～20mmol/l；
[0070]
所述sah水解酶溶液的浓度为0.001～10mg/ml，优选为1～10mg/ml。
[0071]
本发明公开的检测方法对不同来源的样本均具有适应性，待测样本可以来源于尿液、组织液、血液、血液血清或血液血浆等等。
[0072]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0073]
本发明首次公开了一种利用电化学免疫法检测人体内总同型半胱氨酸的方法，基于sah抗体与sah抗原特异性反应引起电信号的变化的原理，具有检测时间短和更高的灵敏度、准确性和特异性等优势，实现了快速、准确、高灵敏、简单价廉的检测thcy，且无需大型检测设备，有望实现小型智能化和床旁快速简便检测。经测试，实际检测样本的加标回收率为95～105％，证明该检测方法具有较好的实际应用能力。
[0074]
本发明公开的检测方法，以au-nps/rgo/sio2纳米复合材料、au-nps/sio2纳米复合材料或au-nps/rgo纳米复合材料为原料，依次经链霉亲和素、生物素化的sah抗体的修饰及牛血清蛋白溶液封闭得到电化学免疫传感器；采用层层自组装和模板法相结合技术制备纳米复合材料，该纳米复合材料具有很好的分散性、优异的导电性、高比表面积、良好的生物相容性，有利于提高传感器的分析检测性能；生物素-链霉亲和素系统由于具有高特异性且一分子链霉素亲和素可以结合四分子生物素，利用这一特异性亲和作用，在链霉亲和素功能化的纳米复合材料界面上可以固定大量的生物素化sah抗体，从而构建更高效的传感平台，所形成的免疫复合物可以显著地抑制界面上的电子传递作用。
附图说明
[0075]
图1为本发明公开的电化学免疫传感器的制备和检测过程示意图；
[0076]
图2为实施例1制备得到的(a)pdda/sio2纳米材料的扫描电镜图，(b)rgo/sio2复合材料的扫描电镜图，(c,d)au-nps/rgo/sio2纳米复合材料在不同放大倍数时的tem图；
[0077]
图3为实施例1制备得到的sah电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品差分脉冲曲线和线性关系；
[0078]
图4为分别以实施例1(曲线c)、对比例1(曲线a)制备的sah电化学免疫传感器电极在10ml ph为6.5含有0.1m kcl的5mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]测试液中，用循环伏安法检测的电化学信号，并给出以裸玻碳电极在同一测试液中的电化学信号作为对比(曲线b)；
[0079]
图5为实施例2制备的由au-nps/sio2纳米材料构建的sah电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品的差分脉冲曲线；
[0080]
图6为实施例3制备的由au-nps/rgo纳米材料构建的sah电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品的差分脉冲曲线。
具体实施方式
[0081]
为了更好的阐明本发明的技术过程和目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明进行详细介绍，显然，所描述的实施方式为本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0082]
此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
[0083]
实施例1
[0084]
将0.04mol teos溶解在200ml无水乙醇中，搅拌1小时形成均匀溶液，加入0.12molnh3·
h2o和3.4mol水室温搅拌反应过夜，离心、洗涤、干燥获得sio2纳米球。将上述所制得的sio2纳米球超声分散在水中得到浓度为10mg/ml sio2分散液，在超声过程中，将上述sio2分散液逐滴加入到等体积浓度为10mg/ml的pdda水溶液中，搅拌过夜，离心得到带正电荷的sio2纳米复合材料(pdda/sio2)。图2中a为所制备的pdda/sio2纳米材料的扫描电镜图片，从图中可以看到pdda/sio2纳米材料的表面粗糙，呈球形形貌，大小尺寸均匀约为150nm。
[0085]
将0.5mg/ml石墨烯水分散液在超声过程中逐滴加入到等体积4mg/ml带正电荷的sio2水分散液中，继续超声组装，搅拌24h，离心，得到rgo/sio2纳米复合材料。如图2中b所示，与pdda/sio2纳米材料相比，rgo/sio2纳米复合材料的表面变得粗糙，石墨烯纳米片均匀的包裹在sio2表面，增加了材料的比表面积，为后续金纳米颗粒的负载提供更多的位点，并且纳米球相互之间连接在一起，形成导电网络，增强了材料的电子传递能力，这有利于提高传感器检测灵敏度。
[0086]
将所制得的rgo/sio2复合材料表面氨基功能化，将0.5grgo/sio2复合材料超声分散在10ml无水乙醇中，加入200μl氨水和0.3g 3-氨丙基乙氧基硅烷，在75℃下回流24h，离心，洗涤，干燥，得到氨基功能化的rgo/sio2纳米复合材料。
[0087]
将氨基功能化的rgo/sio2纳米复合材料超声分散在水中，将1ml 1mg/ml的氨基功
能化的rgo/sio2纳米复合材料水分散液逐滴加入到5ml浓度为0.079mg/ml的胶体金溶液中，超声组装，离心，干燥得到au-nps/rgo/sio2纳米复合材料。如图2中c,d为au-nps/rgo/sio2纳米复合材料的tem图，从图中可以看到au-nps均匀负载在复合材料表面。au-nps/rgo/sio2纳米复合材料中sio2、rgo和au-nps的质量含量分别为63.7wt％、8.0wt％和28.3wt％。
[0088]
构建电化学免疫传感器电极：
[0089]
(1)将上述制备的au-nps/rgo/sio2纳米复合材料超声分散到水中，其浓度为2mg/ml，与1.0wt％壳聚糖水溶液等体积混合，超声得到均匀混合液；
[0090]
(2)取上述混合液与600μg/ml链霉亲和素水溶液等体积混合，通过静电作用或au-n键共价偶联，得到链霉亲和素功能化的au-nps/rgo/sio2纳米复合材料混合液；
[0091]
(3)取8μl链霉素生物功能化的au-nps/rgo/sio2纳米复合材料混合液滴涂于洁净的玻碳电极表面，并置于4℃下晾干。
[0092]
(4)取10μl 20μg/ml bio-sah抗体水溶液滴涂在上述修饰后的玻碳电极表面，37℃下孵育45min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗；
[0093]
(5)取8μl1.0wt％牛血清蛋白水溶液滴涂于上述所得到的电极表面，在室温封闭1h后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗，得到检测sah的电化学免疫传感器。
[0094]
用所构建的电化学免疫传感器检测同型半胱氨酸：
[0095]
a.将上述制备的基于au-nps/rgo/sio2纳米复合材料的电化学免疫传感器在不同浓度的sah抗原溶液中37℃下温育30min，然后用磷酸盐缓冲溶液冲洗。
[0096]
b.以步骤a制得的电化学免疫传感器为工作电极，饱和甘汞电极或ag/agcl电极作为辅助电极，铂片电极作为对电极，在10mlph为6.5含有0.1m kcl的5mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]测试液中，用差示脉冲伏安法检测电化学信号，得到标准曲线。
[0097]
c.为考察该电化学传感器的实际应用能力和准确性，用本实施例制备的sah电化学免疫传感器对临床人血清样本进行测定。将40μl待测人血清样本与100μl 5mm的dtt水溶液在37℃下反应8min，将样本中的蛋白结合或聚合状态的同型半胱氨酸转换为游离型同型半胱氨酸。再加入100μl5mg/mlsahase与过量腺苷在37℃下孵育8min，将hcy转化成sah。以上述制得的sah电化学免疫传感器检测样本中sah产生的电流响应值，根据标准曲线，计算样品中总同型半胱氨酸的浓度。
[0098]
图3为本实施例制备得到的sah电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品差分脉冲曲线(a图)和线性关系(b图)。根据3a图，当没有sah时，传感器在0.2v(ag/agcl)处的氧化峰电流是223.9μa，当传感器分别与不同浓度10μm、20μm、30μm、40μm和50μm的sah抗原孵育后，在0.2v处的氧化峰电流变化分别为22.3μa、35.93μa、46.67μa、57.50μa和74.83μa。随着sah抗原浓度的增加，传感器在0.2v处的电流响应逐渐变小；如图3b所示，氧化峰电流变化(电流响应)与sah抗原的浓度呈线性关系，其线性方程为y＝1.401x
–
4.503，r2＝0.984，线性范围为0～50μm，检测灵敏度为1.401μa/μm。正常人体血清及血浆中的同型半胱氨酸浓度正常参考值范围为5～15μm，通常小于6μm为最佳健康数值，同型半胱氨酸水平为男性高于女性，会随着人体年龄的增长出现逐步上升。本实施例得到电化学免疫传感器可检测0～50μm浓度范围内的同型半胱氨酸。
[0099]
表1为本实施例构建的sah电化学免疫传感器检测实际人血清样本中总同型半胱
氨酸的结果，并通过加标回收率实验验证了所构建的生物传感检测实际样本的能力，每个加标浓度平行测定3次，加标回收率均在95～105％范围之内，说明本发明所提出的电化学免疫传感器检测hcy方法具有很好的准确性和可靠性，可应用于实际样本分析。
[0100]
表1
[0101][0102]
对比例1
[0103]
制备工艺与实施例1基本相同，区别仅在于制备sah电化学免疫传感器电极时，将1.0wt％壳聚糖水溶液替换为0.15wt％的nafion水溶液。图4为分别以实施例1(曲线c)、对比例1(曲线a)制备的sah电化学免疫传感器电极在10ml ph为6.5含有0.1m kcl的5mm k3[fe(cn)6]/k4[fe(cn)6]测试液中，用循环伏安法检测的电化学信号，并给出以裸玻碳电极在同一测试液中的电化学信号作为对比(曲线b)。对比图中的曲线可以确定，采用nafion作为粘结剂制备的sah电化学免疫传感器电极的电化学信号明显小于用壳聚糖作为粘结剂修饰电极的，且低于裸玻碳电极的电化学信号。
[0104]
实施例2
[0105]
pdda/sio2纳米材料的制备与实施例1中相同，将1ml 1mg/ml pdda/sio2纳米材料水分散液逐滴加入到5ml浓度为0.079mg/ml的胶体金溶液中，超声组装，离心，干燥得到au-nps/sio2纳米复合材料。
[0106]
构建电化学免疫传感器电极与用所构建的电化学免疫传感器检测同型半胱氨酸的方法与实施例1中相同。
[0107]
图4为本实施例制备的电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品的差分脉冲曲线，观察该图可以发现，该电化学免疫传感器对10μm和50μm sah标准品溶液的电流响应值分别为22.00μa和37.76μa。说明，采用本实施例制备的纳米材料可以用于构建电化学免疫传感器电极并用于同型半胱氨酸的检测，但该传感器的检测灵敏度低于实施例1中由au-nps/rgo/sio2纳米复合材料构建的电化学免疫传感器。这说明复合材料中石墨烯有利于提高传感器的导电性，进而提高传感器的检测灵敏度。
[0108]
实施例3
[0109]
将0.5g石墨烯超声分散在10ml无水乙醇中，加入200μl氨水和0.3g3-氨丙基乙氧基硅烷，在75℃下回流24h，离心，洗涤，干燥，得到氨基功能化的rgo。
[0110]
将氨基功能化的rgo超声分散在水中，浓度为1mg/ml，将1ml上述氨基功能化的rgo水分散液逐滴加入到5ml浓度为0.079mg/ml的胶体金溶液中，超声组装，离心，干燥得到au-nps/rgo纳米复合材料。
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构建电化学免疫传感器电极与用所构建的电化学免疫传感器检测同型半胱氨酸的方法与实施例1中相同。
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图5为本实施例制备的电化学免疫传感器对不同浓度sah标准样品的差分脉冲曲
线，观察该图可以发现，该电化学免疫传感器对10μm和50μm sah标准品溶液的电流响应值分别为14.40μa和26.70μa。说明，采用本实施例制备的纳米材料可以用于构建电化学免疫传感器电极并用于同型半胱氨酸的检测，但该传感器的检测灵敏度低于实施例1中由au-nps/rgo/sio2纳米复合材料构建的电化学免疫传感器，说明复合材料中二氧化硅纳米球有利于增大比表面积利于金纳米颗粒的负载，进而提高传感器的检测灵敏度。