1.本发明属于生物医学领域，特别涉及检测cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例的试剂在制备癌症治疗疗效和预后预测试剂盒中的用途。
背景技术：
：：2.肝细胞肝癌(hcc)是全球第四大癌症相关死亡原因。在过去的几年里，免疫检查点抑制剂(icb)已经彻底改变了肿瘤的治疗方法，icb已经成为索拉非尼无效的晚期hcc患者的二线治疗选择。目前治疗hcc的icb药物主要有抗ctla-4和抗pd-1/pd-l1抗体。然而，亚洲人群中nivolumab，pembrolizumab或camrelizumab的客观应答率(orr)大约仅为15％，提示筛选免疫治疗敏感人群并针对性的进行靶向治疗和/或免疫治疗，从而提高肝癌患者药物治疗的客观应答率，具有十分重要的临床意义。技术实现要素：3.为了解决上述技术问题，本发明第一方面cd27+cd8+t细胞作为标志物在制备癌症治疗疗效预测试剂盒中的用途。4.进一步地，所述癌症选自肝细胞癌，胆管癌，黑色素瘤，膀胱癌；5.进一步地，所述疗效预测针对接受了抗pd-1抗体和ifn-α的联合治疗的癌症患者、接受了包括抗pd-1抗体在内的综合免疫治疗的癌症患者。6.进一步地，所述试剂盒的检测对象为肝癌组织。7.进一步地，组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+t细胞中的比例高于正常对照指示抗pd-1抗体和ifn-α的联合治疗的疗效良好。8.进一步地，组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+t细胞中的比例高于正常对照指示包括抗pd-1抗体在内的综合免疫治疗的疗效良好。9.本发明第二方面提供了cd27和/或cd8作为标志物在制备癌症预后预测试剂盒中的用途。10.进一步地，所述癌症选自肝细胞癌，胆管癌，黑色素瘤，膀胱癌；11.进一步地，所述预后的判断标准包括包括生存时间和无复发生存时间。12.进一步地，所述预后预测针对癌症切除患者。13.进一步地，所述cd27和/或cd8的高表达指示癌症预后良好。14.本发明第三方面提供了一种癌症治疗疗效或预后预测试剂盒，所述试剂盒中包括cd27检测试剂和cd8检测试剂。15.进一步的，所述试剂盒包括记载了根据检测结果进行疗效、预后预测的使用说明书。16.进一步地，所述检测cd27的试剂包括cd27ihc抗体、荧光标记的cd27流式抗体、cd27原位杂交探针、cd27定量pcr引物和/或探针等。优选地，所述检测cd27的试剂为免疫组化ihc抗体。17.进一步地，所述检测cd8的试剂包括cd8ihc抗体、荧光标记的cd8流式抗体、cd8原位杂交探针、cd8定量pcr引物和/或探针等。优选地，所述检测试剂为免疫组化抗体。所述检测cd8的试剂为免疫组化ihc抗体。18.进一步地，所述cd27检测试剂为cd27免疫组化抗体及其对应荧光二抗(cy5)。19.进一步地，所述cd8检测试剂为cd8免疫组化抗体以及对应荧光二抗(cy3)。20.本发明的有益效果是首次发现了：21.1)ifn-α联合抗pd-1抗体治疗小鼠肝癌疗效与癌症组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例相关。肝癌小鼠模型接受ifn-α联合抗pd-1抗体治疗后，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例较对照组显著上升。表明了cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞的比例可作为ifn-α联合抗pd-1抗体治疗疗效的预测标志；2)cd27和cd8表达高低能够预测肝癌手术切除病人的总体生存时间和无复发生存时间。表明了cd27和cd8的表达可作为手术后肝癌、胆管癌患者预后评估的标志；3)肝癌肿瘤组织中cd27+cd8+t细胞比例能够预测基于抗pd-1抗体综合治疗肝细胞肝癌的疗效。肿瘤组织内cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例能够预测免疫治疗，包括但不局限于基于抗pd-1抗体综合治疗肝细胞肝癌，抗pd-1抗体治疗黑色素瘤，抗pd-1抗体治疗膀胱癌等。附图说明22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。23.图1显示了抗pd-1抗体和ifn-α抗体联合治疗不同处理组的组织细胞分析。图1a，tsne图上显示的21个t细胞亚群的标志物表达详情及其聚类；图1b,各组浸润t细胞亚群的tsne图；图1c，各组肿瘤内t细胞的tsne图合并后结果，点图显示各组cd27+cd8+t细胞的百分比；图1d和e对hepa1-6肿瘤组织进行多色免疫荧光染色，并定量检测各组肿瘤内的cd27+cd8+t细胞，比例尺为50μm。24.图2显示了cd27、cd8的表达水平与预后的关联。图2a和图2b，采用kaplan-meier曲线分析中山医院数据，评估cd27、cd8及两者联合对os和pfs的预后预测效果。图2c和图2d，使用tcga肝细胞肝癌数据集，通过kaplan-meier曲线分析评估cd27、cd8及其组合对os和pfs的预后预测性能。25.图3显示使用tcga胆管癌数据集，通过kaplan-meier曲线分析评估cd27、cd8及其组合对os预后预测性能。26.图4显示了cd27、cd8的表达水平与抗pd-1抗体综合免疫治疗疗效的关联。图4a，多色免疫荧光染色图像显示在基于抗pd-1的免疫治疗前采集的石蜡包被样本中cd8和cd27均高表达的应答者(n＝19)情况。定量分析治疗应答者和无应答者肿瘤内区域cd8和cd27密度。图4b和图4c单细胞测序数据显示，在黑色素瘤队列和膀胱癌队列中，治疗应答者cd8和cd27均有高表达。具体实施方式27.下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。除非特别说明，本专利所用试剂、仪器、设备和方法均为本
技术领域：
：的常规市购试剂、仪器、设备和方法。28.实施例1肝癌小鼠模型的ifn-α联合抗pd-1抗体治疗29.为了探讨ifn-α联合抗pd-1抗体治疗提高抗pd-1抗体疗效的内在免疫微环境的机制，我们用hepa1-6/h22细胞建立了原位小鼠肝癌模型评估治疗效果。30.六周龄雄性c57bl/6j小鼠右侧腋下皮下注射5×106个hepa1-6细胞(重悬于100μlpbs悬液)，或者六周龄雄性balb/c小鼠右侧腋下皮下注射5×106个h22细胞(重悬于100μlpbs悬液)。皮下注射两周后，将hepa1-6细胞株或h22细胞株成瘤的肿瘤组织在无菌条件下取出，剪碎成为1mm3大小的碎块。将等体积的碎块种植在六周龄雄性c57bl/6j小鼠或者是六周龄雄性balb/c小鼠的肝脏右叶。在接受治疗前三天，所有小鼠进行随机分组。对于空白对照组，进行生理盐水+igg同型对照抗体腹腔注射治疗。对于ifn-α组，小鼠腹腔注射1×104iumifn-α(miltenyibiotec,130-093-130)，频率为每天一次，对于抗pd-1抗体组，小鼠腹腔注射抗pd-1抗体[10mg/kg抗pd-1单克隆抗体(mab)(bioxcell,be0146)]，频率为每三天一次。对于ifn-α联合抗pd-1治疗组，小鼠腹腔注射1×104iumifn-α(miltenyibiotec,130-093-130)，频率为每天一次，同时小鼠腹腔注射抗pd-1抗体[10mg/kg抗pd-1单克隆抗体(mab)(bioxcell,be0146)]，频率为每三天一次。以上四组治疗周期为28天。每3-5天，通过preclinicalvevo3100小动物b超平台对小鼠原位肿瘤进行观察并通过vevolab分析软件(visualsonics)分析小鼠原位肿瘤大小。[0031]在验证了ifn-α联合抗pd-1抗体联合治疗对免疫系统健全的原位肝癌小鼠模型具有有效的治疗效果后，对小鼠的肝癌组织进行了质谱流式检测。其中，质谱流式结果显示，小鼠肝癌组织内的各种免疫细胞可以聚类为21个cluster(图1a)，对vehicle+igg组，anti-pd-1组，ifnα组和ifnα联合anti-pd-1组的所有免疫细胞cluster进行降维分析可视化，可以看到不同治疗方案治疗后，小鼠的肝癌免疫微环境存在差异(图1b)。我们进一步分析发现，肝癌小鼠模型接受ifn-α联合抗pd-1抗体治疗后，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例较对照组显著上升(图1c)。[0032]之后，我们对接受ifn-α联合抗pd-1抗体治疗的肝癌小鼠模型的肝癌肿瘤组织进行了多色免疫荧光染色(图1d)，多色免疫荧光的结果进一步验证了我们cytof的发现，即肝癌小鼠模型接受ifn-α联合抗pd-1抗体治疗后，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例较对照组显著上升(图1e)。[0033]实施例2cd27和cd8表达与手术肝癌患者预后相关性研究[0034]在发现肝癌小鼠模型接受ifn-α联合抗pd-1抗体治疗后，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例较对照组显著上升后，我们探究了cd27和cd8表达的高低是否对手术切除肝癌患者具有预测预后的价值。我们对在中山医院接受肝癌手术治疗的患者的肿瘤组织进行了组织芯片的构建。对组织芯片分别进行了cd27(1:100,ab131254,abcam)和cd8(1:100,85336,cst)免疫组化染色。通过明场显微镜，在200×视野下，对每个直径为1mm的组织芯片的点上面的阳性cd27细胞以及阳性cd8细胞进行计数。在复旦大学附属中山医院接受手术治疗的肝癌患者队列中发现，肝癌组织中cd27和/或cd8表达的高低能够有效的预测肝癌患者术后的生存时间和无复发生存时间(图2a和图2b)。并且，这一发现在tcga数据库肝癌患者队列中得到了进一步的验证(图2c和图2d)。另外，在tcga数据库胆管癌患者队列中同样证明了cd27和/或cd8表达的高低能够有效的预测胆管癌患者术后的生存时间(图3)。tcga数据库中收集的数据量为tcga数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/，https://xenabrowser.net/hub/)中同时带有预后信息和转录组测序信息的365名肝细胞肝癌患者的以及36名胆管癌患者预后信息以及cd27/cd8的表达情况。该部分数据为公开数据库信息，可以在https://portal.gdc.cancer.gov/及https://xenabrowser.net/hub/进行查询，下载。[0035]实施例3抗pd-1抗体的综合免疫治疗[0036]在发现肝癌组织中的cd27和cd8能够预测肝癌患者的生存时间和无复发生存时间后，我们进一步探究了肝癌肿瘤组织内cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例能否预测基于抗pd-1抗体的综合免疫治疗方案治疗肝细胞肝癌的疗效。我们收集了19例接受基于抗pd-1抗体的综合免疫治疗的肝细胞肝癌患者的肝癌穿刺活检组织，并且对穿刺组织进行了cd27和cd8的免疫组化染色鉴定。对这19例患者的肝癌治疗情况通过mri检查结果，根据“修订后实体瘤临床疗效评价标准(modifiedresponseevaluationcriteriainsolidtumor,mrecist)”进行疗效评估，将患者治疗效果分为部分缓解(pr,partialresponse)，疾病稳定(sd,stabledisease)，疾病进展(pd,progressivedisease)。结果发现，肝癌组织内cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例能够有效地预测基于抗pd-1抗体的综合免疫治疗方案治疗肝细胞肝癌的疗效—具体的，治疗应答的患者(包括pr患者)中，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例显著更高；治疗无应答的患者(包括sd和pd患者)中，肝癌组织中cd27+cd8+t细胞在cd8+阳性细胞中的比例显著更低(图4a)。此外，在抗pd-1抗体治疗的黑色素瘤患者(通过分析开放公共数据集gse120575)中，cd27和cd8表达均高的患者中，有更多的患者治疗有应答(图4b)；在抗pd-1抗体治疗的膀胱癌患者(通过分析开放公共数据集gse145281)中，cd27和cd8表达均高的患者中，有更多的患者治疗有应答(图4c)。[0037]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。当前第1页12当前第1页12