一种抗凝血酶Ⅲ测定试剂盒的制作方法

一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒
技术领域
1.本发明属于体外检测试剂盒领域，具体涉及一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒。


背景技术：

2.抗凝血酶ⅲ主要在肝细胞和内皮细胞中合成，是由432个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，其相对分子质量为58200kd。抗凝血酶ⅲ是丝氨酸蛋白酶抑制物超家族成员，在体内主要以α型和β型两种结构存在，它们都含有3个β折叠，9个α螺旋和1个rcl，三维结构构象相似。抗凝血酶ⅲ与丝氨酸蛋白酶抑制物的重要区别在于抗凝血酶ⅲ可以通过结合肝素类分子来提高其抑制活性。
3.抗凝血酶ⅲ是凝血酶及凝血因子
ⅻ
α、
ⅺ
α、
ⅸ
α、
ⅹ
α等的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸－丝氨酸肽键相结合，形成抗凝血酶-凝血酶复合物而使凝血酶灭活，肝素可使这一反应加速千倍以上。抗凝血酶ⅲ作为血液中活性凝血因子最重要的阻碍因子，控制着血液的凝固和纤维蛋白的溶解。血液中抗凝血酶ⅲ的水平根据各种疾病、症状而变化，在急性心肌梗死、弥散性血管内凝血、肝病、肾病综合征等疾病中抗凝血酶ⅲ浓度降低。因此，抗凝血酶ⅲ的浓度作为对于此类疾病的诊断疗效监测、预后判定的指标具有重要意义。
4.目前，市售抗凝血酶ⅲ测定试剂盒大部分为s-2238底物法，多为冻干剂型，试剂组成多，生产过程和操作使用复杂，且成本投入大。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒。
6.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂1、试剂2,其中，
7.试剂1包括缓冲液、表面活性剂、反应调节剂、防腐剂和抗干扰剂，
8.试剂2包括缓冲液、表面活性剂、反应调节剂、蛋白保护剂、防腐剂和抗凝血酶ⅲ抗体。
9.试剂1和试剂2的体积比为(1-10)：1，或者试剂1和试剂2的体积比为(1-5)：1，优选的，试剂1和试剂2的体积比为4:1。
10.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂1的缓冲液选自tris-hcl缓冲液、na2hpo
4-nah2po4缓冲液、mes缓冲液、mopso-mopso/na缓冲液、pipes缓冲液、hepes缓冲液、na2hpo
4-hcl缓冲液、na2hpo
4-kh2po4缓冲液中的一种,
11.所述试剂2的缓冲液选自tris-hcl缓冲液、na2hpo
4-nah2po4缓冲液、mes缓冲液、mopso-mopso/na缓冲液、pipes缓冲液、hepes缓冲液、na2hpo
4-hcl缓冲液、na2hpo
4-kh2po4缓冲液中的一种。
12.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂1的缓冲液的ph为6.0～8.0，浓度为10～200mm；所述试剂2的缓冲液的ph为6.0～8.0，浓度为10～200mm。
13.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂1中，表面活性
剂包括吐温20，吐温80，曲拉通x-100，brij-35的一种或多种，表面活性剂占缓冲液重量的0.01～2wt％。
14.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂2中，表面活性剂包括吐温20，吐温80，曲拉通x-100，brij-35的一种或多种，表面活性剂占缓冲液重量的0.01～2wt％。
15.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂1中，反应调节剂包括a组分和b组分，其中，
16.a组分为聚乙二醇4000或聚乙二醇6000，
17.b组分为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种；
18.反应调节剂占缓冲液重量的0.05～40wt％。
19.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，所述试剂2中，反应调节剂包括a组分和b组分，其中，
20.a组分为聚乙二醇4000或聚乙二醇6000，
21.b组分为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种；
22.试剂1、2中，反应调节剂占缓冲液重量的0.05～10wt％，a组分和b组分的质量比为1:0-200，或者，a组分和b组分的质量比为1:0.1-200，或者，a组分和b组分的质量比为1:1-100。
23.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，试剂1中，所述抗干扰剂为亚铁氰化钾和阻断剂，所述抗干扰剂占缓冲液重量的0.01～1wt％。
24.优选的，阻断剂为异嗜性抗体阻断剂，亚铁氰化钾和阻断剂的质量比为1:0.05-80。
25.亚铁氰化钾可与胆红素发生反应，去除胆红素的干扰；阻断剂与类风湿因子结合，阻断类风湿因子与抗凝血酶ⅲ抗体的结合，从而消除类风湿因子对测试的干扰。
26.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，试剂2中，所述蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或多种；所述蛋白保护剂占缓冲液重量的0.05～30wt％。
27.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，试剂1中，所述防腐剂为叠氮化钠、proclin300、庆大霉素硫酸盐、硫柳汞中的一种或多种，所述防腐剂占缓冲液重量的0.01～0.5wt％；
28.试剂2中，所述防腐剂为叠氮化钠、proclin300、庆大霉素硫酸盐、硫柳汞中的至少2种，所述防腐剂占缓冲液重量的0.01～0.5wt％。
29.根据本发明具体实施方式的一种抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，抗凝血酶ⅲ抗体包括羊抗人抗凝血酶ⅲ抗血清抗体、兔抗人抗凝血酶ⅲ抗血清抗体、鼠抗人抗凝血酶ⅲ抗体等的一种或多种。
30.本发明试剂盒的使用方法如下：
31.试验条件：
[0032][0033][0034]
操作步骤：
[0035][0036]
在全自动生化分析仪上，按照上述试验条件和操作步骤进行试剂定标，绘制浓度-吸光度变化值曲线，测试样本时，根据样本的吸光度变化值计算样本中抗凝血酶ⅲ的浓度。
[0037]
本发明的有益效果：
[0038]
本发明的抗凝血酶ⅲ测定试剂盒通过添加表面活性剂，提高了试剂的均匀性；通过抗干扰剂的添加使试剂测定目标物的反应特异性增强，从而提高了试剂测定结果的准确度；通过添加反应调节剂增强了试剂的灵敏度，提高了低值端(低值端样本主要是指低于100的样本)样本测定结果的准确度。
[0039]
反应调节剂可以调节试剂测试样本的反应度，即吸光度变化值，如不同配方测试同一个浓度75左右的样本，一个的反应度(吸光度变化值
△
a)为0.1200，一个为0.0900，反应度为0.1200的试剂测试75以下浓度的样本时，准确度会更高，因为平分到每一个浓度单位上的反应度更大(0.0016)。
[0040]
本发明选择甘油/牛血清白蛋白、糖类、防腐剂一起添加，不但能够保护抗体蛋白结构，防止其降解，同时还可以抑制微生物繁殖的，较单一的防腐剂，起到更好的广谱抑菌效果，从而甘油/牛血清白蛋白、糖类、防腐剂协同作用，可以更好的提高试剂的稳定性。
具体实施方式
[0041]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
[0042]
本发明的抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，包括试剂1和试剂2，其中
[0043]
试剂1：
[0044]
10～200mm缓冲液(ph6.0～8.0)：tris-hcl缓冲液、na2hpo4-nah2po4缓冲液、mes缓冲液、mopso-mopso/na缓冲液、pipes缓冲液、hepes缓冲液、na2hpo
4-hcl缓冲液或na2hpo
4-kh2po4缓冲液；
[0045]
表面活性剂：吐温20，吐温80，曲拉通x-100，brij-35的一种或多种；其占缓冲液重量的0.01～2wt％；
[0046]
反应调节剂：a组分和b组分，a组分为聚乙二醇4000，聚乙二醇6000
[0047]
b组分为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种；
[0048]
反应调节剂占缓冲液重量的0.05～5wt％；
[0049]
抗干扰剂：包括亚铁氰化钾和阻断剂，所述抗干扰剂占缓冲液重量的0.01～1wt％
[0050]
防腐剂：叠氮化钠、proclin300、庆大霉素硫酸盐、硫柳汞中的一种或多种，所述防腐剂占缓冲液重量的0.01～0.5wt％。
[0051]
试剂2：
[0052]
10～200mm缓冲液(ph6.0～8.0)：tris-hcl缓冲液、na2hpo
4-nah2po4缓冲液、mes缓冲液、mopso-mopso/na缓冲液、pipes缓冲液、hepes缓冲液、na2hpo4-hcl缓冲液或na2hpo
4-kh2po4缓冲液；
[0053]
表面活性剂：吐温20，吐温80，曲拉通x-100，brij-35的一种或多种；其占缓冲液重量的0.01～2wt％；
[0054]
反应调节剂：a组分和b组分，a组分为聚乙二醇4000，聚乙二醇6000
[0055]
b组分为氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、乙二胺四乙酸二钠中的一种或多种；
[0056]
反应调节剂占缓冲液重量的0.05～5wt％；
[0057]
蛋白保护剂：甘油、牛血清白蛋白、甘氨酸、海藻糖、甘露醇或蔗糖的一种或多种，所述蛋白保护剂占缓冲液重量的0.05～30wt％
[0058]
防腐剂：叠氮化钠、proclin300、庆大霉素硫酸盐、硫柳汞中的一种或多种，所述防腐剂占缓冲液重量的0.01～0.5wt％；
[0059]
抗凝血酶ⅲ抗体。
[0060]
实施例1
[0061]
1.1本发明的抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，包括：
[0062]
试剂1：
[0063]
缓冲液为hepes缓冲液，ph值为6.5，缓冲液的浓度为100mm。
[0064]
表面活性剂为吐温20和曲拉通x-100，吐温20占缓冲液重量的0.02wt％，曲拉通x-100占缓冲液重量的0.10wt％；
[0065]
反应调节剂为聚乙二醇6000、氯化钾、硫酸钠，聚乙二醇6000占缓冲液重量的2.00wt％，氯化钾占缓冲液重量的0.05wt％，硫酸钠占缓冲液重量的0.60wt％；
[0066]
抗干扰剂为亚铁氰化钾和异嗜性抗体阻断剂，亚铁氰化钾占缓冲液重量的0.5wt％，异嗜性抗体阻断剂占缓冲液重量的0.02wt％；
[0067]
防腐剂为庆大霉素硫酸盐和叠氮化钠，庆大霉素硫酸盐占缓冲液重量的0.01wt％，叠氮化钠占缓冲液重量的0.2wt％。
[0068]
试剂2：
[0069]
缓冲液为tris-hcl缓冲液，ph值为8.0，缓冲液的浓度为20mm；
[0070]
表面活性剂为吐温20和曲拉通x-100，吐温20占缓冲液重量的0.02wt％，曲拉通x-100占缓冲液重量的0.10wt％；
[0071]
反应调节剂为氯化钾、硫酸钠，氯化钾占缓冲液重量的0.05wt％，硫酸钠占缓冲液重量的0.60wt％；
[0072]
蛋白保护剂为甘氨酸、甘油和牛血清白蛋白，甘氨酸占缓冲液重量的5.00wt％，甘油占缓冲液重量的10.00wt％，牛血清白蛋白占缓冲液重量的0.80wt％；
[0073]
防腐剂为庆大霉素硫酸盐和叠氮化钠，庆大霉素硫酸盐占缓冲液重量的0.01wt％，叠氮化钠占缓冲液重量的0.20wt％；
[0074]
抗凝血酶ⅲ抗体为羊抗人抗凝血酶ⅲ抗血清抗体，占缓冲液重量的15.00wt％。
[0075]
1.2本发明的抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，包括试剂1和试剂2：
[0076]
试剂1：
[0077]
缓冲液为na2hpo
4-nah2po4缓冲液，ph值为7.0，缓冲液的浓度为50mm。
[0078]
表面活性剂为吐温80和brij-35，吐温80占缓冲液重量的0.01wt％，brij-35占缓冲液重量的0.30wt％；
[0079]
反应调节剂为聚乙二醇4000、氯化钠和碳酸氢钾，聚乙二醇4000占缓冲液重量的4.00wt％，氯化钠占缓冲液重量的2.00wt％，碳酸氢钾占缓冲液重量的0.20wt％；
[0080]
抗干扰剂为亚铁氰化钾和异嗜性抗体阻断剂，亚铁氰化钾占缓冲液重量的0.3wt％，异嗜性抗体阻断剂占缓冲液重量的0.05wt％；
[0081]
防腐剂为proclin300和叠氮化钠，proclin300占缓冲液重量的0.10wt％，叠氮化钠占缓冲液重量的0.10wt％。
[0082]
试剂2：
[0083]
缓冲液为na2hpo
4-nah2po4缓冲液，ph值为7.0，缓冲液的浓度为50mm。
[0084]
表面活性剂为吐温80和brij-35，吐温80占缓冲液重量的0.01wt％，brij-35占缓冲液重量的0.30wt％；
[0085]
反应调节剂为氯化钠，占缓冲液重量的2.00wt％；
[0086]
蛋白保护剂为甘油和蔗糖，甘油占缓冲液重量的25.00wt％，蔗糖占缓冲液重量的2.00wt％；
[0087]
防腐剂为proclin300和叠氮化钠，proclin300占缓冲液重量的0.10wt％，叠氮化钠占缓冲液重量的0.10wt％；
[0088]
抗凝血酶ⅲ抗体为羊抗人抗凝血酶ⅲ抗血清抗体，占缓冲液重量的20.00wt％。
[0089]
1.3本发明的抗凝血酶ⅲ测定试剂盒，包括试剂1和试剂2：
[0090]
试剂1：
[0091]
缓冲液为mopso-mopso/na缓冲液，ph值为7.0，缓冲液的浓度为100mm；
[0092]
表面活性剂为曲拉通x-100、brij-35和吐温80，曲拉通x-100占缓冲液重量的1.50wt％，brij-35占缓冲液重量的0.10wt％，吐温80占缓冲液体积的0.02wt％；
[0093]
反应调节剂为聚乙二醇6000、乙二胺四乙酸二钠，聚乙二醇6000占缓冲液重量的8.00wt％，乙二胺四乙酸二钠占缓冲液重量的0.25wt％；
[0094]
抗干扰剂为亚铁氰化钾和异嗜性抗体阻断剂，亚铁氰化钾占缓冲液重量的0.10wt％，异嗜性抗体阻断剂占缓冲液重量的0.01wt％；
[0095]
防腐剂为proclin300和硫柳汞，proclin300占缓冲液重量的0.02wt％，硫柳汞占缓冲液重量的0.01wt％。
[0096]
试剂2：
[0097]
缓冲液为mopso-mopso/na缓冲液，ph值为7.0，缓冲液的浓度为100mm；
[0098]
表面活性剂为曲拉通x-100、brij-35和吐温80，曲拉通x-100占缓冲液重量的1.50wt％，brij-35占缓冲液重量的0.10wt％，吐温80占缓冲液体积的0.02wt；
[0099]
反应调节剂为乙二胺四乙酸二钠和氯化钾，乙二胺四乙酸二钠占缓冲液重量的0.10wt％，氯化钾占缓冲液重量的5.00wt％；
[0100]
蛋白保护剂为海藻糖和甘油，海藻糖占缓冲液重量的3.00wt％，甘油占缓冲液重量的20.00wt％；
[0101]
防腐剂为proclin300和硫柳汞，proclin300占缓冲液重量的0.02wt％，硫柳汞占缓冲液重量的0.01wt％；
[0102]
抗凝血酶ⅲ抗体为羊抗人抗凝血酶ⅲ抗血清抗体，占缓冲液重量的30.00wt％。
[0103]
实施例2验证本发明试剂盒的效果
[0104]
2.1均匀性试验
[0105]
按照本发明的实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)和对比例1、2、3配方进行试剂配制生产，生产出的试剂与市售试剂在日立3500全自动生化分析仪上同时测试两个水平血清(水平1为正常值(180-320mg/l)、水平2为异常值(＜180mg/l))样品，每个水平重复测定10次，计算10个测量值的平均-[0106]
值(x)、标准差(sd)和变异系数(cv)。
[0107]
对比例1：不添加表面活性剂，其他成分同实施例1.1。
[0108]
对比例2：表面活性剂为十二烷基苯磺酸钠，浓度为0.10wt％，其他成分同实施例1.1。
[0109]
对比例3：表面活性剂为聚氧乙烯十三醚，浓度为0.10wt％，，其他成分同实施例1.1。
[0110]
均匀性测定结果对比如表1所示。
[0111]
表1重复性测试结果比对表
[0112]
[0113][0114]
由表1可知，本发明试剂的重复性测试结果的变异系数(cv)值≤1.36％，小于对比例1-3和市售试剂的重复性测试结果的变异系数，说明本发明试剂的重复性更好。
[0115]
2.2抗干扰试验
[0116]
按照本发明的实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)和对比例2配方进行试剂配制生产，生产出的试剂在日立3500全自动生化分析仪上进行抗干扰试验测试。
[0117]
对比例4：不添加抗干扰剂，其他成分同实施例1.1。
[0118]
对比例5：抗干扰剂为亚铁氰化钾，浓度为0.50wt％，其他成分同实施例1.1。
[0119]
对比例6：抗干扰剂为异嗜性抗体阻断剂，浓度为0.02wt％，其他成分同实施例1.1。
[0120]
测试方法为：搜集混合血浆样本，充分混匀后平均分成三份。
[0121]
对照样本：血清与干扰物19:1的比例，干扰物包括0.1mol/l naoh溶液，1200mg/dl胆红素和4000iu/ml类风湿因子；
[0122]
bil干扰样本：60mg/dl胆红素(bil)；
[0123]
rf干扰样本：200iu/ml类风湿因子(rf)。
[0124]
将配制好的样本用实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)和对比例4、5、6配方分别测试3次。比较对照样本和干扰样本测定结果的相对偏差，用于评价试剂的抗干扰性能。
[0125]
抗干扰试验测试结果如表2所示。
[0126]
表2本发明试剂的抗干扰试验测试结果
[0127][0128]
如表2所示，本发明试剂的抗干扰试验中干扰样本测试结果与对照样本的相对偏差均≤1.98％，而对比例(4、5、6)试剂的抗干扰试验中干扰样本测试结果与对照样本的相对偏差均≥4.03％，抗干扰性能远远低于本发明试剂。因此，本发明的试剂盒通过抗干扰剂的添加可以有效地提高试剂的抗干扰能力。
[0129]
2.3比较本发明的检测试剂盒与对比例及市售品的稳定性
[0130]
加速稳定性：将实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)、对比例7、对比例8、对比例9、对比例10及市售试剂同时做37℃加速处理，每隔一段时间取出一部分样品进行质控测试，测试结果计算平均值，比较多次测定结果平均值的变化趋势，分析本发明的试剂盒、对比例及市售试剂的加速稳定性。
[0131]
效期稳定性：将实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)和对比例5-8同时放2-8℃保存，每隔一段时间取出一部分试剂进行质控测试，测试结果计算平均值，比较多次测定结果平均值的变化趋势，分析本发明的试剂盒、对比例及市售试剂的效期稳定性。
[0132]
对比例7：蛋白保护剂为牛血清白蛋白，浓度为8.00wt％，防腐剂为proclin300，浓度为0.10wt％，其他成分同实施例1.2。
[0133]
对比例8：蛋白保护剂为甘氨酸，浓度为5.00wt％，防腐剂为庆大霉素硫酸盐，浓度为0.01wt％，其他成分同实施例1.2。
[0134]
对比例9：不添加蛋白保护剂，防腐剂为proclin300，浓度为0.10wt％，其他成分同实施例1.2。
[0135]
对比例10：蛋白保护剂为甘油，浓度为30.00wt％，不添加防腐剂，其他成分同实施例1.2。
[0136]
稳定性结果如表3所示。
[0137]
表3本发明试剂与市售试剂稳定性比较
[0138][0139]
如表3所示，从加速稳定性数据可以看出，对比例的质控测试结果呈现持续性下降趋势，市售试剂从第7天开始有下降趋势，第7天后变化趋势非常显著；而本发明试剂加速处理10天内的质控测试结果均较好，变化趋势不显著。从效期稳定性可以看出，不同的对比例经过12个月的存放后，稳定性测试的质控结果均有不同程度的变化，而本发明试剂经过12个月的存放后的质控测定结果变化不显著，说明本发明试剂具有良好的稳定性。因此，说明蛋白保护剂和防腐剂组合能够提高本发明试剂的稳定性。
[0140]
2.4本发明的检测试剂盒对标本测试情况
[0141]
将实施例1中的3个配方(1.1、1.2和1.3)、对比例11、对比例12及市售试剂同时做临床样本测定，对比本发明试剂、对比例(9-10)与市售品的样本测定一致性。
[0142]
对比例11：反应调节剂为聚乙二醇6000，浓度为8.00wt％，其他成分同实施例1.3。
[0143]
对比例12：反应调节剂为氯化钾，浓度为5.00wt％，其他成分同实施例1.3。
[0144]
临床样本测定结果如表4所示。
[0145]
表4本发明试剂和对比例与市售品临床样本测定结果
[0146][0147]
如表4所示，本发明试剂测定样本抗凝血酶ⅲ结果与市售品测定样本抗凝血酶ⅲ结果的相对偏差在-4.38％～4.64％之间，对比例11和对比例12试剂测定样本抗凝血酶ⅲ结果与市售品测定样本抗凝血酶ⅲ结果的相对偏差分别在-10.10％～14.92％和-24.28％～22.86％之间，本发明试剂测定结果的符合性明显好于对比例的样本测定结果，说明添加反应调节剂(表面活性剂和盐离子组合)可以调节试剂测试样本的结果，校正异常数据，使试剂盒配方测试临床样本的结果更准确。
[0148]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。