高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法

1.本发明涉及透射电子显微镜生物样品的制备技术，尤其是涉及一种高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法。


背景技术：

2.电子显微镜是一种可以在纳米维度观察生物组织或细胞样品的超显微结构的仪器。通过其所得到的电子显微镜图片在医疗诊断、科学研究中都起着非常重要的作用。样品制备是生物成像的第一步，而样品的好坏在很大程度上影响最后电子显微镜的成像结果。制备失败的样品必定无法获得满意的图像，而良好制备的样品则是获得满意图像的重要一步。目前常用的透射电子显微镜样品固定方法包括化学固定法和冷冻固定法。
3.化学固定法因其操作简单被广泛使用，其主要原理是利用化学试剂与样品中的氨基酸、蛋白质和脂类之间形成交联，通常是以共价键的形式，从而固定样品。常用的初次化学固定剂包括戊二醛、甲醛或丙烯醛等，二次固定剂则以四氧化锇最为常见。固定后，样品通过使用梯度系列的乙醇、甲醇或丙酮溶液来完成脱水。切片前，样品需要先嵌入树脂中，这通常需要花费数小时至数日时间。目前常用梯度树脂替代的方法来进行样品的渗透并使用热或紫外光进行聚合。最后，样品进行切片后置于电子显微镜中成像。但化学固定法通常会导致蛋白质变性，因此利用该方法制得的样品无法进行免疫学标记。此外，化学固定剂通常需要数小时才能完全渗透进样品完成固定步骤，而在此期间样品可能已经发生了组织降解等生理变化，使最终观察到图片的准确性大打折扣。因此，对更为快速且对样品影响较小固定方法的需求迫在眉睫，而冷冻固定法则应运而生。
4.常用的冷冻固定法包括直插式冷冻法和高压冷冻法，主要取决于样品的厚度而进行选择，对于样品厚度小于10μm的样品，可以使用直插式冷冻法，将含样品的栅格快速地插入由液氮冷却的乙烷中完成固定。而对于样品厚度大于10μm的样品，在常压下通过骤冷无法获得足够高的冷却速率，而缓慢的冷冻速度会导致冰晶的形成从而破坏样品的显微结构，故无法使用直插式冷冻法固定厚度大于10μm的样品。而增大压力则可提高冷却速率，这使得厚度大于10μm而小于200μm的样品也能在冷冻状态下进行固定。在这里，样品在2100bar下被快速冷冻固定，这样的冷冻速度使样品中的水形成玻璃化的冰，而不会损伤样品。固定后，样品脱水步骤在低温中通过使用丙酮或乙醇来完成。切片前，样品同样需要在保持低温的环境下嵌入低温树脂，而后树脂在紫外光下进行聚合，包埋后有硬度的样品可在切片后放于透射电子显微镜观察。
5.目前，在医院和科研院所，常规电子显微镜的样品固定都是通过传统化学试剂在常温完成的。然而化学固定过程十分缓慢，样品可能在固定过程中已发生生理变化，不能很好的保存样品的结构特征，故所得到的结果并不完全可靠。化学固定法会造成细胞结构的收缩，细胞内容物的降解等结构假象，从而丢失细胞结构的真实生理状况下的高分辨信息。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于针对现有技术存在的上述问题，提供针对不同样品的合适参数区间，可极大减少使用者自己试错的时间，提高实验效率，降低试验过程的花费，同时改进优化高压冷冻和冷冻替代过程，最大限度地保证样品的结构并且保留蛋白抗原特征，扩大样品后续实验可行性的一种高压冷冻及冷冻替代制备透射电子显微镜样品的方法。
7.本发明包括以下步骤：
8.1)采集生物组织或细胞样品；
9.2)组织切成小块或细胞离心沉淀后，在高压冷冻仪中进行高压冷冻固定；
10.3)将样品转入冷冻替代仪中，在低温下进行醋酸双氧铀溶液固定和丙酮脱水；
11.4)在冷冻替代仪中，进行乙醇冲洗和梯度浓度的hm20树脂渗透与包埋，紫外光下完成对hm20树脂的低温聚合固化。
12.在步骤1)中，所述样品包括动物(包括人类)、植物和酵母等的生物组织或细胞样品；优选地，所述样品的厚度为200μm以下；
13.所述收集的具体方法可为：对于组织样品，首先将动物(包括人类)或植物等的组织在尽可能鲜活的状态下，快速切成厚度小于200μm小块；对于动物细胞、植物细胞或酵母，则分别通过转速为300～350xg、70～100xg和3000xg离心5～10min沉淀收集。
14.在步骤2)中，所述高压冷冻固定，样品需要在尽可能鲜活的状态下放入高压冷冻仪中进行固定；所述高压冷冻固定的具体方法可为：将样品迅速放入高压冷冻仪的承载容器中，容器中未填满的部分加入原细胞或组织培养液、十六碳烯、10％～20％牛血清白蛋白(bsa)(动物样品适用)或0.1～0.15m的蔗糖溶液(植物样品适用)等填充剂，避免空气残留；利用高压冷冻仪可在2100bar的压力下，在毫秒级时间内利用液氮对细胞或组织样品快速冷冻固定，样品冷冻速率为12000k/s～25000k/s，从而捕捉细胞内的精细结构。
15.在步骤3)中，所述醋酸双氧铀溶液的浓度为0.1％～0.5％，优选为0.33％；所述醋酸双氧铀固定和丙酮脱水的时间为3～72h，优选为72h；所述低温的温度范围为-90～-80℃，优选-85℃；
16.所述醋酸双氧铀溶液可由以下方法配制：先将醋酸双氧铀溶于适量甲醇中配制成15％～25％(质量百分比)的醋酸双氧铀/甲醇溶液，优选为20％。然后再将适量醋酸双氧铀/甲醇溶液溶于丙酮中配制成醋酸双氧铀终浓度为0.1％～0.5％的工作溶液，优选为0.33％。
17.在步骤4)中，所述进行hm20树脂渗透与包埋的温度为-55～-45℃，优选-50℃；所述低温聚合的温度为-40～-30℃，优选-35℃；所述hm20树脂的梯度浓度范围为33％～100％，优选地，所述梯度浓度可依次为33％、66％、100％。
18.优选地，所述hm20树脂混合物由交联剂d(crosslinker d)、单体e(monomer e)和引发剂c(initiator c)组成；配置hm20树脂混合物所需交联剂d、单体e和引发剂c的质量比可为(2.5～3.5)︰(11.3～22.7)︰(0.07～0.13)，更优选为2.98︰17.02︰0.10。
19.本发明采用高压冷冻法是利用在2100bar的高压下，液氮对样品进行毫秒级别快速冷冻，将样品中的水迅速凝结成玻璃态，玻璃态的水为非晶态固态，体积与密度都与液态水相似，不会因样品中水的结晶而破坏细胞结构，所以使用者可以得到样品最真实的超微结构信息。关于高压冷冻和冷冻替代法的最优条件设置还没有统一的标准，市面上的说明
80℃范围内完成用0.1％～0.5％醋酸双氧铀进一步固定和丙酮脱水的过程。随后在-55～-45℃范围内采用乙醇冲洗和梯度浓度的hm20树脂(可采用生产厂家electron microscopy sciences；产品型号：hm20)对样品进行包埋，最后在-40～-35℃范围内使用紫外光对树脂进行聚合。该方法简洁高效，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
28.本发明一方面，提供一种高压冷冻固定样品的方法。另一方面，提供一种低温下样品脱水及树脂包埋的方法。
29.优选地，所述样品包括动物(包括人类)、植物和酵母等的生物组织或细胞样品。
30.优选地，所述样品包括动物(包括人类)、植物和酵母等的生物组织的厚度需为200μm以下。
31.优选地，所述醋酸双氧铀溶液配制需先将醋酸双氧铀溶于适量甲醇中配制成15％～25％(质量百分比)的醋酸双氧铀/甲醇溶液，优选为20％。然后再将适量醋酸双氧铀/甲醇溶液溶于丙酮中配制成醋酸双氧铀终浓度为0.1％～0.5％的工作溶液。例如可以是0.10％、0.15％、0.20％、0.25％、0.30％、0.33％、0.35％、0.40％、0.45％或0.50％，优选为0.33％。
32.优选地，容器中未填满的部分加入原细胞或组织培养液、十六碳烯、10％～20％bsa(动物样品适用)或0.1m～0.15m的蔗糖溶液(植物样品适用)等填充剂。
33.优选地，所述hm20树脂混合物所需交联剂d、单体e和引发剂c的质量比可为(2.5～3.5)︰(11.3～22.7)︰(0.07-0.13)；更优选的，hm20树脂混合物的配方为交联剂d：2.98克，单体e：17.02克和引发剂c：0.10克。
34.优选地，所述hm20树脂的梯度浓度范围为33％～100％，所述梯度浓度例如可以是依次为33％、66％、100％。
35.以下给出具体实施例。
36.实施例1采用透射电子显微镜，对高压冷冻及冷冻替代的动物样品进行观察。
37.1.流程图如图1所示，首先将小鼠的脑部组织切下并放入高压冷冻仪的容器内，进行高压冷冻固定。
38.2.使用浓度为0.33％的醋酸双氧铀溶液对高压冷冻固定后的样品在低温下进行进一步固定。
39.3.使用梯度浓度的hm20树脂(33％、66％，100％)对样品进行渗透和包埋，参数设定参照表1。
40.4.使用紫外光对包埋好的样品进行固定。
41.5.切片观察如图2所示。
42.表1冷冻替代仪的条件设定参数表
[0043][0044][0045]
实施例2采用透射电子显微镜，对高压冷冻及冷冻替代的植物样品进行观察。
[0046]
1.流程图如图1所示，首先将拟南芥根尖切下并放入高压冷冻仪的容器内，用0.15m的蔗糖溶液进行填充，并进行高压冷冻固定。
[0047]
2.使用浓度为0.33％的醋酸双氧铀溶液对高压冷冻固定后的样品在低温下进行进一步固定。
[0048]
3.使用梯度浓度的hm20树脂(33％、66％，100％)对样品进行渗透和包埋，参数设定参照表1。
[0049]
4.使用紫外光对包埋好的样品进行固定。
[0050]
5.切片并用免疫金对细胞器进行观察如图3所示。
[0051]
实施例3采用透射电子显微镜，对高压冷冻及冷冻替代的酵母样品进行观察。
[0052]
1.流程图如图1所示，首先将酵母离心后转移至高压冷冻仪的容器内进行高压冷冻固定。
[0053]
2.使用浓度为0.33％的醋酸双氧铀溶液对高压冷冻固定后的样品在低温下进行进一步固定。
[0054]
3.使用梯度浓度的hm20树脂(33％、66％，100％)对样品进行渗透和包埋，参数设定参照表1。
[0055]
4.使用紫外光对包埋好的样品进行固定。
[0056]
5.切片观察如图4所示。
[0057]
实验表明，本发明已经成功分别在小鼠脑组织、拟南芥根和酵母中应用本发明，本发明适用于当前大部分科学研究领域和医学检测的样品制备。且发明人提供具体参数设置范围，使此发明便于推广应用。加之本技术相较于传统化学固定在最终效果上有明显优势，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
[0058]
综上所述，本发明提供一种制备透射电子显微镜的高压冷冻及冷冻替代样品的方法，改进优化高压冷冻和冷冻替代的过程，避免传统常温化学固定对样品结构产生的影响，最大限度地保证样品的结构特征，令此发明达到最大限度地保证样品的结构并且保留蛋白
抗原特征，使所得到的样品可以进一步被抗体标记，极大地方便后期蛋白标记的实验开展，扩大样品后续实验的可行性。本发明方法可广泛适用到各种不同样品的制备，最大限度的保证样品的结构特征，缩短制备用时，适用于大多数生物样品。
[0059]
本发明通过上述实施案例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述案例及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。