一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法

1.本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体的涉及一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法。


背景技术：

2.丁酰肼是一种琥珀酸类植物生长调节剂，可保存植物中的叶绿素，延长一些易腐蔬菜的寿命。但是有研究表明，丁酰肼具有明确的致癌作用，因此在美国已限制采后使用。遗憾的是中国的消费者还不能鉴定哪种水果在保鲜的时候使用了丁酰肼。所以开发定量分析丁酰肼的方法具有重要的现实意义。
3.目前，国外报道的丁酰肼检测方法主要有薄层色谱法、气相色谱法、比色法、色谱质谱联用法，而国内主要是用一些衍生化试剂进行衍生以后，用气相色谱进行测定。但是这些方法均存在操作步骤繁琐，分析效率不高的问题。


技术实现要素：

4.本发明实施例提供一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法，包括：
5.获取待测目标组份为丁酰肼的待测样品；
6.采用马来酸作为内标，将马来酸和待测样品溶解于氘代水d2o得到待测溶液；
7.优化核磁共振分析的波谱仪测试参数，测定待测溶液的核磁共振氢谱，获得马来酸和丁酰肼的定量峰；
8.对马来酸的定量峰和丁酰肼的定量峰积分，分别得到各自的积分面积，根据拟合公式计算待测样品中含有丁酰肼的质量。
9.优选地，核磁共振分析的波谱仪测试参数，包括：
10.温度：298.15k，zg：30脉冲，谱宽：9.9967，脉冲激发中心频率o1p：4.73，弛豫时间d1：20s，采样次数ns：24，采样时间aq：8.19s，空采次数ds：0。
11.优选地，拟合公式，表达式包括：
[0012][0013]
其中，m
丁酰肼
，m
马来酸
分别表示丁酰肼和马来酸的质量，w表示马来酸纯度用质量百分数表示，s
丁酰肼
、s
马来酸
分别表示丁酰肼和马来酸定量峰面积。
[0014]
优选地，在对所述马来酸的定量峰和丁酰肼的定量峰积分时，选取定量峰的峰型轮廓线与水平基线交叉处之间区域作为积分区域，且均积分多次，取其平均值作为实际积分面积。
[0015]
本发明实施例提供一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法，与现有技术相比，其有益效果如下：
[0016]
1、本发明专利建立了一种高效，准确，方便的通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼有效成份的方法。
[0017]
2、本发明建立的方法具有较好的普适性，可以用于果蔬中丁酰肼残留量以及丁酰肼纯度的定量分析。
[0018]
3、本发明建立方法具有和气相色谱-质谱(gc-ms)法法相近的测试准确度，与气相色谱-质谱(gc-ms)法相比，无需待测组分的高纯对照品，无需衍生化过程，也无需萃取，过滤等繁复的纯化过程，大大节约测试效率。
[0019]
4、本发明方法具有较低的检测限和定量限(ng/ml级别)
附图说明
[0020]
图1为本发明实施例提供的一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法的流程图；
[0021]
图2为本发明实施例提供的一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法的丁酰肼和吡嗪混合物核磁共振氢谱图；
[0022]
图3为本发明实施例提供的一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法的丁酰肼和马来酸混合物核磁共振氢谱图；
[0023]
图4为本发明实施例提供的一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法的丁酰肼质量和峰面积线性关系图。
具体实施方式
[0024]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
参见图1～4，本发明实施例提供一种通过核磁共振氢谱定量分析丁酰肼含量的方法，该方法包括：
[0026]
第一步，氘代试剂的选择：称取20mg丁酰肼，选择d2o作为氘代溶剂，选用topspin2.1软件自带proton标准模板参数测定1h nmr谱，活泼氢均被氘代，但是无合适的定量峰；
[0027]
第二步，丁酰肼1h nmr谱中，所有质子峰混合在一起，无合适的定量峰：用d2o残余溶剂峰标定化学位移，选择吡嗪为内标，无定量峰，无法定量分析(如图1所示)，但是选用马来酸作内标时发现丁酰肼中甲基峰移动到3.046处，且为一孤立尖锐单峰，非常适合用于定量分析(如图2所示)。综上，丁酰肼定量分析采用氘代水(d2o)作溶剂，马来酸作内标完成；
[0028]
第三步，测试参数优化：温度298.15k，zg30脉冲，谱宽(sw)设为9.9967，脉冲激发中心频率(o1p)为4.73，弛豫时间(d1)为20s，采样次数ns为24，采样时间(aq)为8.19s,空采次数ds为0，其他参数默认。
[0029]
第四步，样品测试及数据处理：采用第三步优化后的测试参数测定样品的1hnmr谱；以马来酸δ6.26(2h，s)处单峰为基准，准确积分丁酰肼δ3.05(6h，s)处峰面积，为减少误差，选取定量峰或内标峰的峰型轮廓线与水平基线交叉处之间作为积分区域，且内标峰与定量峰均积分5次，取其平均值作为实际积分面积。
[0030]
第五步方法学验证：包括线性关系验证，稳定性验证，重复性验证，精密度验证等
[0031]
1、线性关系验证：样品制备：准确称取857.1mg马来酸，以重水溶解后转移至10ml容量瓶中，以重水定容至刻度线，摇匀备用，作为标准溶液；称取157.2mg丁酰肼，装入一次性pe管中，加入1.5ml标准溶液，超声20min使样品完全溶解，得到均一、澄清、透明溶液，依次取50μl，75μl，100μl，125μl，150μl，225μl加入1.5ml一次性pe管中，以标准溶液稀释至600μl，超声10min使其混合均匀，转移至1-6号核磁管中，得到1-6号待测溶液，按照第四步方法测试并处理数据；以丁酰肼定量峰峰面积与马来酸定量峰面积比值为纵坐标，样品中丁酰肼实际质量为横坐标作图，得工作曲线，对工作曲线进行线性拟合得回归方程，表明样品质量与峰面积之间具有良好的线性关系。
[0032]
2、重复性测试：样品制备：称取丁酰肼102.1mg，马来酸57mg，以重水溶解后转移至10ml容量瓶中，用重水定容至刻度线，摇匀，取6份0.6ml样品加入1`-6`号核磁管中，得到1`-6`号待测液；按照第四步方法测试并处理数据；根据左旋肉碱富马酸盐定量峰面积与吡嗪定量峰面积比值计算rsd小于1％，表明该方法具有良好的可重复性。
[0033]
3、精密度测试：取线性测试的1号样品，按照第四步方法测试并处理数据，平行测试5次，通过丁酰肼定量峰与马来酸定量峰面积比值计算标准偏差，计算所得rsd小于0.5％，说明该方法测试结果具有良好的精密度。
[0034]
4、稳定性测试：取线性测试的3号样品，分别于样品配置好后1h，4h，8h，16h，24h，32h按照第四步方法测试并处理数据，通过丁酰肼定量峰与马来酸定量峰面积比值计算标准偏差，计算所得rsd小于0.5％，说明样品及内标物在测试体系中具有良好的稳定性。
[0035]
第六步，所述按照样品及内标物及氘代试剂取用量，依据下式计算所取样品中丁酰肼质量：
[0036][0037]
上式中，m
丁酰肼
，m
马来酸
分别表示丁酰肼和马来酸的质量，w表示马来酸纯度(质量百分数)，s
丁酰肼
、s
马来酸
分别表示丁酰肼和马来酸定量峰峰面积。
[0038]
实施例1
[0039]
通过核磁共振氢谱分析花生中丁酰肼残留，具体步骤如下：
[0040]
准确称取粉碎混合均匀的试样约1.0克(精确到0.0001克)于10毫升离心管中，加入重水6毫升，振荡30分钟静止后离心15分钟(3000r/min)。移取上清液0.6ml装入0.5mm核磁管上机测试，根据技术方案中步骤测试并计算丁酰肼含量
[0041]
表1花生中丁酰肼残留量测试
[0042][0043]
实施例2
[0044]
通过核磁共振氢谱分析丁酰肼原料纯度，具体步骤如下：
[0045]
称取50mg丁酰肼原料药，转移入2ml一次性pe离心管中，加入1.5ml标准溶液，超声5min，溶液呈澄清透明状，取0.6ml加入核磁管中，上机测试。根据下列公式计算丁酰肼实际含量，根据丁酰肼实际含量计算出原料药纯度。
[0046][0047]
表2丁酰肼原料药纯度分析
[0048][0049][0050]
比较例：
[0051]
现有定量分析丁酰肼的方法很多，其中国家标准所用方法为气相色谱-质谱法，故将本发明专利申请方法与气相色谱-质谱(gc-ms)法[sn/t1989-2007进出口食品中丁酰肼残留量检测方法气相色谱-质谱法[m].北京：中国标准出版社，2007]进行比较：采用定量核磁共振氢谱法和高效液相色谱法分别测定了实施例2中丁酰肼原料药中有效成份含量，并对两种测试方法的结果进行比较，如表3所示：本方法测定结果与气相色谱-质谱(gc-ms)法相比无明显偏差(gc-ms法测定结果更加接近是由于药品标称纯度就是采用此法测定)。
[0052]
表3两种测试结果对比
[0053][0054]
与高效液相色谱法相比，定量核磁共振法具有相似的准确度，而且定量核磁共振法采用峰面积和原子核数目之间的对应关系实现定量，无需待测组份的高纯对照品，可显著节约测试成本。此外，本发明方法只需将待测样品碾碎，以重水萃取、静置后直接取上层清液进行测试，无需衍生化步骤，也无需萃取，过滤等繁杂的纯化过程，可以大大简化测试流程，此外，本发明方法可以为定量核磁技术测定此类化合物的提供新思路，扩大定量核磁共振技术的应用范围。
[0055]
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围，但是，本发明实施例并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围内。